閃雅惠，鄧梅毓，郭志青，雷雪超，梁國彩

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，河北 張家口 075000)

肺癌是導致癌癥相關死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和病死率近年來不斷增加[1]。其中，非小細胞肺癌是最常見的肺癌組織學類型，占肺癌的84%，主要包括肺鱗狀細胞癌和肺腺癌兩種亞型[2]。根治性切除被認為是早期肺腺癌的首選治療方法，但仍存在一定的復發(fā)風險以及遠處轉移[3]。近年來，越來越多的癌癥患者接受手術和麻醉以治療癌癥和控制疼痛[4]。順阿曲庫銨(cisatracurium，Cisat)是一種新開發(fā)的非去極化肌松藥，已廣泛應用于臨床麻醉。Cisat的松弛強度為阿曲庫銨的4～5倍，具有療效好、毒性低、代謝不依賴肝腎等特點，已成為最理想的肌松藥[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Cisat在癌癥的發(fā)展進程中發(fā)揮著重要作用，Yang等[6]研究證實Cisat對乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移具有抑制作用；Xia等[7]的研究結果證明Cisat可通過抑制TGF-β/SMAD2/3信號通路的激活從而抑制結腸癌進展。但是，對于Cisat在肺腺癌進展中的作用目前尚不清楚。因此，本研究主要探討Cisat對肺腺癌A549細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響，以期為臨床肺癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Cisat(批號：20200810)購自江蘇東英藥業(yè)有限公司；結晶紫、CCK-8試劑盒、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)檢測試劑盒(JC-1)購自美國sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：22400097)、FBS(批號：12664025C)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；caspase-3(批號：ab184787)、caspase-9(批號：ab184786)、Bax(批號：ab32503)、Bcl-2(批號：ab32124)、纖連蛋白(批號：ab268020)和GAPDH(批號：ab181602)抗體購自英國Abcam公司；抗波形蛋白(批號：bs-8533R)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(批號：bs-34032R)、c-Myc(批號：bs-4963R)、p21(批號：bsm-60698R)抗體購自北京博奧森公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(批號：ZB-2301)購自北京中杉金橋公司；Transwell小室(帶基質(zhì))購自美國BD公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肺腺癌細胞系A549購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫(上海)，將細胞置于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、含5%CO2的濕潤條件下培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測細胞活力

將A549細胞以1×103個/孔的密度接種到96孔板中，加入不同濃度(1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L、320 μmol/L)的Cisat。培養(yǎng)24 h后，加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶標儀讀取450 nm波長處的OD值。計算細胞存活率，細胞存活率=(加藥組細胞OD值/0 μmol/L細胞OD值)×100%。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.4 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力

將Cisat 20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L孵育的A549細胞稀釋后緩慢加入并分散于細胞培養(yǎng)板上。培養(yǎng)14 d后，PBS洗滌細胞2次，甲醇固定細胞，0.1 %結晶紫染色。然后對可見菌落進行計數(shù)。

1.5 Annexin-V/PI法檢測細胞凋亡

將Cisat 20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L孵育的A549細胞用PBS調(diào)整細胞濃度為5×105個/孔，并接種至12孔板，分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，室溫避光孵育15 min，使用BD FACSAria Ⅱ流式細胞儀對樣品進行分析，F(xiàn)low Jo 7.6軟件分析結果。

1.6 流式JC-1檢測MMP[8]

將Cisat 20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L孵育的A549細胞用PBS調(diào)整細胞濃度至1×106/mL，加入終濃度為10 μg/mL的JC-1，于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔5 min顛倒混勻，PBS洗滌3次，使用BD FACSAria Ⅱ流式細胞儀對樣品進行分析，激發(fā)波長為488 nm，用Flow Jo 7.6軟件分析結果。

1.7 Western blot檢測蛋白表達

將Cisat 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L處理的A549細胞用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白。BCA測定蛋白濃度并調(diào)平，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(80 V，40 min；120 V，1 h)分離蛋白，并將其轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的脫脂牛奶在TBST中封閉2 h后，加入一抗caspase-3、caspase-9、c-Myc、p21、Bax、Bcl-2、VEGF、纖連蛋白和波形蛋白(均按1∶1 000的比例稀釋),于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜后ECL曝光成像并用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.8 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力

細胞侵襲通過涂有基質(zhì)的Transwell小室確定。在無血清培養(yǎng)基中，將Cisat 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L孵育的A549細胞以2×104個/孔的密度接種到Transwell的上室中。Transwell的下室裝有含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。37 ℃下孵育48 h后，用棉簽剝離Transwell頂部未侵襲的細胞，而Transwell下部的侵襲細胞則用4%多聚甲醛固定20 min，然后用1%結晶紫染色15 min。在光學顯微鏡(Olympus)下隨機選擇5個區(qū)域?qū)θ肭值募毎M行計數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同濃度的Cisat對A549細胞活力的影響

A549細胞活力隨Cisat濃度的增加而降低，Cisat濃度為0 μmol/L時，A549的細胞活力為100%，Cisat濃度為40 μmol/L時，A549細胞活力顯著下降(P<0.05)，見圖1。因此，選擇0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L Cisat進行后續(xù)實驗。

*：與0 μmol/L相比，P<0.05

2.2 Cisat對A549細胞克隆形成的影響

與Cisat 0 μmol/L組相比，Cisat 40 μmol/L組和Cisat 80 μmol/L組A549細胞克隆形成率顯著降低(P<0.05)，而Cisat 20 μmol/L組無明顯變化(P>0.05)，見圖2。

a：克隆形成實驗檢測A549細胞增殖；b：各組細胞克隆形成率統(tǒng)計 *：與Cisat 0 μmol/L組相比，P<0.05

2.3 Cisat對A549細胞凋亡的影響

與Cisat 0 μmol/L組相比，Cisat 40 μmol/L組和Cisat 80 μmol/L組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，而Cisat 20 μmol/L組無顯著變化(P>0.05)，見圖3a。Cisat 0 μmol/L組JC-1紅綠熒光比值接近100%，與之相比，Cisat 20 μmol/L組紅綠熒光比值無明顯變化，Cisat 40 μmol/L組和Cisat 80 μmol/L組JC-1紅綠熒光比值明顯降低，即MMP顯著降低，見圖3b。

a：流式細胞術檢測細胞凋亡；b：JC-1檢測細胞MMP *：與Cisat 0 μmol/L組相比，P<0.05

2.4 Cisat對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與Cisat 0 μmol/L組相比，Cisat 40 μmol/L組和Cisat 80 μmol/L組cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9、Bax/Bcl-2比值及p21的表達均顯著上調(diào)(P<0.05)，c-Myc的表達顯著下調(diào)(P<0.05)，而Cisat 20 μmol/L組無顯著變化(P>0.05)，見圖4。

a：Western blot檢測各組細胞中凋亡相關蛋白的表達；b：各組蛋白相對表達量統(tǒng)計 *：與Cisat 0 μmol/L組相比，P<0.05

2.5 Cisat對A549細胞侵襲能力的影響

與Cisat 0 μmol/L組相比，Cisat 20 μmol/L組細胞侵襲數(shù)無顯著變化(P>0.05)，Cisat 40 μmol/L組和Cisat 80 μmol/L組細胞侵襲數(shù)目顯著減少(P<0.05)，見圖5a、b。與Cisat 0 μmol/L組相比，Cisat 20 μmol/L組VEGF、纖連蛋白和波形蛋白的表達無明顯變化(P>0.05)，Cisat 40 μmol/L組和Cisat 80 μmol/L組VEGF、纖連蛋白和波形蛋白的表達均顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖5c、d。

a：Transwell檢測細胞侵襲能力(×200)；b：各組侵襲細胞數(shù)統(tǒng)計；c：Western blot檢測VEGF、纖連蛋白和波形蛋白的表達；d：各組蛋白相對表達量 *：與Cisat 0 μmol/L組相比，P<0.05

3 討論

肺腺癌的治療方案通常為手術切除輔以化療，但殘留的癌細胞可能導致術后復發(fā)和轉移的發(fā)生率變高，是患者死亡的主要原因[9]。這些殘留癌細胞的生存和進展取決于多種協(xié)同圍術期因素，其中包括麻醉藥和止痛藥[10]。因此，優(yōu)化手術和麻醉策略至關重要，這可能是減少手術切除后肺癌復發(fā)的關鍵。Cisat是一種非去極化的肌松藥，通常用于需要有效骨骼肌麻痹的手術中。有研究證明，Cisat可顯著抑制人卵巢癌OVACR-3細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡[5]。本研究結果顯示，A549細胞活力隨著Cisat濃度的增加逐漸降低，Cisat濃度在40 μmol/L及以上時，A549細胞活力明顯降低，因此，高濃度Cisat可抑制肺癌細胞活力。

MMP的下降是細胞早期凋亡的一個標志性事件。當MMP下降，線粒體膜通透性增加，細胞色素C釋放到胞內(nèi)后形成凋亡復合體，凋亡復合體通過招募并激活caspase-9，caspase-9進一步激活效應caspase-3和caspase-7，啟動caspase級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡[11]。據(jù)報道，c-Myc蛋白與腫瘤的發(fā)生有關，c-Myc過度表達對細胞增殖、存活、腫瘤血管生成和腫瘤轉移有積極的調(diào)節(jié)作用，此外c-Myc還可介導細胞程序性凋亡的發(fā)生[12-13]。本研究結果顯示，MMP隨著Cisat濃度的增加而顯著下降，且cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9表達上調(diào)，c-Myc表達明顯下調(diào)。說明Cisat能夠降低A549細胞MMP，從而引發(fā)細胞早期凋亡。

據(jù)報道，腫瘤抑制因子p21低表達是腫瘤發(fā)生的先決條件[14]。研究表明，激活p21表達可導致膀胱癌細胞中的G0/G1期細胞周期停滯[15]。Bcl-2家族蛋白是控制線粒體相關的凋亡因子釋放的主要調(diào)節(jié)因子[16]，促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2比值決定了細胞凋亡與否[17]。本研究中，Cisat濃度為40 μmol/L和80 μmol/L時細胞克隆形成率明顯降低，p21表達及Bax/Bcl-2比值顯著上調(diào)。說明Cisat可以抑制A549細胞的增殖并促進其凋亡。

上皮-間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤惡性轉化中起關鍵作用，而纖連蛋白和波形蛋白是EMT的重要標志物[18]。VEGF是關鍵的血管生成因子，可使血管通透性增加，引起腫瘤血管中的蛋白外滲，有助于腫瘤生長、轉移[19]。研究發(fā)現(xiàn)，Cisat可抑制食管癌細胞中的EMT[20]。本研究結果顯示，Cisat顯著下調(diào)了纖連蛋白、波形蛋白和VEGF的表達，表明Cisat可通過抑制A549細胞發(fā)生EMT阻遏腫瘤的侵襲和轉移。

綜上，本研究首次揭示了Cisat在抑制A549細胞增殖、侵襲、遷移和EMT以及誘導細胞凋亡中的重要作用，對于需要充分肌肉松馳或持續(xù)控制通氣的腫瘤切除術，這些發(fā)現(xiàn)具有廣闊的應用前景。然而，本研究僅使用單一的肺腺癌細胞系進行實驗，未來還需要對更多的細胞系進行綜合分析，以了解Cisat在肺癌中的作用。