魏江存，楊正騰，馬家寶△，王成龍，江先再，陸景榮，崔健，陳圣斌

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬?lài)?guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

曼徹斯特大學(xué)Geims教授在2004年使用膠帶剝離石墨晶體首次獲得了石墨烯［1］，從此石墨烯的研究進(jìn)入了一個(gè)快速發(fā)展的時(shí)代。其結(jié)構(gòu)為緊密堆積成的二維蜂窩狀晶體，以單層碳原子sp2雜化連接，屬于新型碳納米材料［2］。制備氧化石墨烯最經(jīng)典的方法是Hummers法，近幾年的研究多見(jiàn)于對(duì)其的改進(jìn)［3-5］。因?yàn)檠趸┑闹苽漭^為簡(jiǎn)單，產(chǎn)量大，價(jià)格低，合成的原料石墨資源也豐富，且能與金屬、無(wú)機(jī)非金屬、聚合物等材料合成性能更加優(yōu)越的復(fù)合材料［6-7］，因此，氧化石墨烯已成為最具廣泛應(yīng)用前景的吸附材料之一，多次被應(yīng)用到農(nóng)殘分析中。氧化石墨烯在農(nóng)殘前處理中，主要被用作固相萃取和固相微萃取的吸附劑。多見(jiàn)于以氧化石墨烯為填料，制備固相萃取柱凈化水果中有機(jī)磷的報(bào)道中，其凈化富集有機(jī)磷回收率可達(dá)69.8%～106.2%［8］，對(duì)6種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的提取回收率也高達(dá)81.1%～111.0%［9］。

石墨烯在傳統(tǒng)中藥方面的研究中并不常見(jiàn)，重金屬和殘留農(nóng)藥的檢測(cè)方面，也不常用［10-11］。傳統(tǒng)的藥材農(nóng)殘的前處理方法有索氏提取法、溶劑萃取法和超聲波提取法等，存在分析周期長(zhǎng)、溶劑消耗量大、操作過(guò)程繁瑣且回收率低等缺點(diǎn)。而農(nóng)藥的殘留一般為痕量級(jí)別，對(duì)分析方法的要求很高，如果提取分離不夠純化，富集不夠徹底，很容易導(dǎo)致含有一定農(nóng)藥殘留的藥材未被檢測(cè)出，勢(shì)必影響藥效和患者的健康。

中藥大黃在種植過(guò)程中，由于蟲(chóng)害的原因，偶爾使用有機(jī)氯農(nóng)藥消除蟲(chóng)害，農(nóng)藥或除草劑中含有有機(jī)氯類(lèi)成分，如2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸殘留。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)，利用氧化石墨烯進(jìn)行中藥有機(jī)氯萃取方法的研究，從洗脫時(shí)間、氧化石墨烯用量和丙酮洗劑濃度方面進(jìn)行正交試驗(yàn)，并采用HPLC高效液相色譜法對(duì)有機(jī)氯的成分進(jìn)行含量測(cè)定，旨在尋找新型材料氧化石墨烯在中藥大黃有機(jī)氯檢測(cè)中的應(yīng)用，為氧化石墨烯在傳統(tǒng)中藥中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也為中藥大黃農(nóng)殘前處理的研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Simplicity超純水系統(tǒng)（密理博中國(guó)有限公司）；Practum224-1CN分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥與藥材2，4-滴丙酸（美國(guó)AccuStandard?，Inc，批號(hào)：217031400，純度：＞98.0%）；2，4，5-三氯苯氧乙酸（美國(guó)AccuStandard?，Inc，批號(hào)：217081073，純度：＞98.0%）；石墨粉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20180118）；甲醇和乙腈為色譜純（Fisher，4L）；濃硫酸、丙酮、乙醇、磷酸、醋酸和其他試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水；大黃藥材（廣東康美藥業(yè)有限公司，批號(hào)：180307002）購(gòu)于老百姓大藥房，藥材樣品經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室梁子寧教授鑒定為豆科植物大黃Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹 果 大 黃Glycyrrhiza inflataBat.或光果大黃Glycyrrhiza glabraL.的干燥根和根莖。本實(shí)驗(yàn)所有樣品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)均采用《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部。

1.3 方法

1.3.1 氧化石墨烯的制備由天然石墨粉反應(yīng)生成氧化石墨，大致分為3個(gè)階段，低溫反應(yīng)：在冰水浴中放入大燒杯，加入適量的濃硫酸（H2SO4），在磁力攪拌器上攪拌，放入溫度計(jì)，測(cè)定其溫度使之降至4℃左右。加入精密稱(chēng)定的100目鱗片狀石墨粉，再加入硝酸鈉（NaNO3），然后緩慢加入高錳酸鉀（KMnO4），加完后記時(shí)，在磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)90 min。中溫反應(yīng)：將冰水浴換成溫水浴，在磁力攪拌器攪拌下將燒杯里的溫度控制在30～40℃，讓其反應(yīng)30 min。高溫反應(yīng)：中溫反應(yīng)結(jié)束之后，緩慢加入一定量的去離子水，加熱保持溫度70～100℃，緩慢加入一定雙氧水（5%）進(jìn)行高溫反應(yīng)，反應(yīng)后的溶液在離心機(jī)中多次離心洗滌，直至BaCl2檢測(cè)無(wú)白色沉淀生成（說(shuō)明沒(méi)有SO42-的存在）或洗滌至中性溶液，樣品在40～50℃溫度下烘干，即得氧化石墨烯。

1.3.2 供試品溶液和對(duì)照品溶液的制備取常用中藥大黃25 g，將其粉碎，加入50 mL超純水，用榨汁機(jī)加工成糊狀。加入適量的氧化石墨烯粉振蕩搖勻，每次用不同濃度的丙醇進(jìn)行洗脫，控制洗脫時(shí)間。將洗脫液用氮?dú)獯蹈?，后加入適量的50%甲醇溶解定容到50 mL的容量瓶中，作為供試品溶液，取適量容量瓶中的溶液，以離心半徑10 cm，13 000 r/min離心15 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。2，4-滴丙酸（100 μg/mL）；2，4，5-三氯苯氧乙酸（100 μg/mL）；分別精密量取上述對(duì)照品溶液為1、0.5 mL，置5 mL量瓶中，搖勻即得混合對(duì)照品溶液（2，4-滴丙酸20 μg/mL，2，4，5-三氯苯氧乙酸10 μg/mL）。

1.3.3 單因素考察

1.3.3.1 氧化石墨烯加入量固定有機(jī)氯萃取時(shí)間為20 min，萃取溶劑丙酮濃度為25%，以氧化石墨烯的加入量對(duì)大黃中機(jī)氯萃得率做單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)氧化石墨烯的加入量分別為10、30、50、80、100、120 mg，在合理使用資源的情況下，發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯的加入量為50 mg時(shí)，有機(jī)氯得率較高。見(jiàn)圖1。

圖1 氧化石墨烯加入量考察

1.3.3.2 萃取時(shí)間以有機(jī)氯萃取時(shí)氧化石墨烯加入量50 mg和丙酮濃度35%，萃取時(shí)間對(duì)大黃中有機(jī)氯的得率做單因素試驗(yàn)，設(shè)萃取時(shí)間為10、20、30、40、50 min，發(fā)現(xiàn)萃取時(shí)間為30 min時(shí)，有機(jī)氯得率較高。見(jiàn)圖2。

圖2 萃取時(shí)間考察

1.3.3.3 萃取溶劑丙酮濃度考察以有機(jī)氯萃取時(shí)氧化石墨烯加入量50 mg和萃取時(shí)間20 min，以萃取溶劑丙酮濃度對(duì)大黃中有機(jī)氯得率做單因素試驗(yàn)，萃取溶劑丙酮濃度為20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%，結(jié)果顯示丙酮濃度為35%時(shí)，有機(jī)氯得率較高。見(jiàn)圖3。

圖3 萃取溶劑丙酮濃度考察

1.3.4 有機(jī)氯萃取方法優(yōu)選正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［12］，采用L9（34）正交表?？疾煅趸┯昧浚謩e為20、50、800 mg，考察萃取時(shí)間，分別為20、30、40 min三個(gè)水平，考察洗脫溶劑，濃度分別為30%丙酮、35%丙酮、40%丙酮三個(gè)水平。精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積值，計(jì)算各指標(biāo)成分含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.5 正交試驗(yàn)取大黃藥材粉末25.0g，精密稱(chēng)定，按照上述“2.2”項(xiàng)下的提取方法進(jìn)行提取，再依供試品溶液的制備方法操作，按L9（34）正交設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，使用高效液相色譜法對(duì)中藥大黃中2，4-滴丙酸、2，4，5-三氯苯氧乙酸成分進(jìn)行含量測(cè)定。見(jiàn)表2—3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

1.3.6 色譜條件色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（5μm，4.6mmX250mm），流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序見(jiàn)表4，流速1 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。理論塔板數(shù)以2，4-滴丙酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，以2，4，5-三氯苯氧乙酸峰計(jì)算不低于4000。2個(gè)成分都能達(dá)到較好分離，樣品中其他成分對(duì)測(cè)定成分無(wú)干擾。見(jiàn)圖4—5、表4。

表4 梯度洗脫程序表

圖4 大黃樣品HPLC色譜圖

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取上述混合對(duì)照品溶液（2，4-滴丙酸20 μg/mL，2，4，5-三氯苯氧乙酸10 μg/mL）2、5、8、10、12、15、20 μL注入液相色譜儀，以峰面積和進(jìn)樣量（μg）分別為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。測(cè)定其信號(hào)（以峰高計(jì)）與噪聲比值，將S/N=3時(shí)的濃度定為檢測(cè)限（LOD），將S/N=10時(shí)的濃度定為定量限（LOQ）。2，4-滴丙酸Y=4.0×106X+37327（R2=0.9998），檢測(cè)限（ng）為2.4，定量限（ng）為18.6；2，4，5-三氯苯氧乙酸Y=4.0×106X+12495（R2=0.9993），檢測(cè)限（ng）為3.1，定量限（ng）為25.3。結(jié)果，2，4-滴丙酸進(jìn)樣量在0.04～0.40 μg范圍和2，4，5-三氯苯氧乙酸進(jìn)樣量在0.02～0.20 μg范圍都呈良好的線性關(guān)系。見(jiàn)圖6—7。

圖6 2，4-滴丙酸線性方程圖

1.3.8 方法學(xué)考察

1.3.8.1 精密度試驗(yàn)精密量取混合對(duì)照品溶液適量（2，4-滴丙酸20 μg/mL，2，4，5-三氯苯氧乙酸10 μg/mL），按“1.3.6”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸峰面積的RSD分別為1.22%和1.15，均小于3%，說(shuō)明儀器精密度良好。

圖5 2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸混合對(duì)照品HPLC色譜圖

圖7 2，4，5-三氯苯氧乙酸線性方程圖

1.3.8.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批大黃藥材粉末25.0 g，精密稱(chēng)定，按“1.3.2”項(xiàng)下的方法，加入氧化石墨烯粉30 mg振蕩搖勻，洗脫時(shí)間30 min，40%丙醇進(jìn)行洗脫，制備成供試品溶液，分別在供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h按“1.3.2”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算大黃中2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸峰面積的RSD分別為1.84%和2.33%，均小于3%，說(shuō)明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。1.3.8.3重復(fù)性試驗(yàn)精密稱(chēng)取同一批大黃藥材粉末25.0 g，精密稱(chēng)定，共6份，按“1.3.2”項(xiàng)下的方法，加入氧化石墨烯粉30 mg振蕩搖勻，洗脫時(shí)間30 min，40%丙醇進(jìn)行洗脫，制備成供試品溶液，按“1.3.2”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算大黃中2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸的平均含量分別為39.56、22.61 μg/g，其供試品溶液的濃度分別為19.78、11.30 μg/mL，其RSD分別為1.39%、1.96%，均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.8.4 加樣回收率試驗(yàn)精密量取已知濃度的6份供試品溶液1 mL，加入適量對(duì)照品溶液，用50%甲醇定容至2 mL的容量瓶，即得進(jìn)樣溶液，按照“1.3.2”項(xiàng)下的方法，加入氧化石墨烯粉20 mg振蕩搖勻，洗脫時(shí)間30 min，40%丙醇進(jìn)行洗脫，制備供試品溶液，按“1.3.6”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，計(jì)算2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸含量及RSD，計(jì)算加樣回收率，平均回收率分別為99.78%、99.65%，RSD為2.27%、2.78%，結(jié)果見(jiàn)表2—3。以上結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確性良好。結(jié)果見(jiàn)表5—6。

表5 大黃中2，4-滴丙酸的加樣回收率結(jié)果（n=6）

表6 大黃中2，4，5-三氯苯氧乙酸的加樣回收率結(jié)果（n=6）

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果分析由于本次實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)大黃中的2個(gè)有效成分進(jìn)行分析，采用綜合加權(quán)評(píng)分法［13-15］，2，4-滴丙酸的權(quán)重系數(shù)為0.5，2，4，5-三氯苯氧乙酸的權(quán)重系數(shù)為0.5，分別把2個(gè)成分項(xiàng)下最好的指標(biāo)定為100分，其他各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)按下式評(píng)分：綜合得分=Yl/50.83×100×0.5+Y2/32.03×100×0.5。根據(jù)正交設(shè)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示，以大黃中2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸的含量為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，由于各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)大黃提取效果的影響程度不同，從結(jié)果可以看出，各因素的主次順序是A＞C＞B。因素氧化石墨烯加入量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，因素洗脫時(shí)間和丙酮濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性影響，經(jīng)過(guò)綜合分析，確定大黃的最佳提取工藝為A1B3C3，即在取25 g中藥大黃的條件下，氧化石墨烯加入量為30 mg，洗脫時(shí)間為40 min，丙酮濃度為40%，此提取效果最佳。

2.2 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)以?xún)?yōu)選出的2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸提取條件對(duì)大黃中殘留的2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸含量進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行進(jìn)行3次測(cè)定。計(jì)算大黃中殘留的2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸平均含量分別為41.08、25.32 μg/g，RSD分別為1.82%和2.39%（n=3）。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，優(yōu)化后的2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸提取條件較好，工藝可行。

2.3 含量測(cè)定取同一批次的大黃藥材粉末3份，每份25 g，按照“1.3.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“1.3.6”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，計(jì)算2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 中藥大黃中2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸的含量（n=3） μg/g

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇考察了不同甲醇-酸水系統(tǒng)和乙腈-酸水系統(tǒng)（0.05%磷酸、0.1%磷酸、0.2%磷酸、0.1%冰醋酸、0.2%冰醋酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸和純水），結(jié)果表明，甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，分離度相對(duì)較好，基線較平穩(wěn)，出峰時(shí)間適當(dāng)，故流動(dòng)相確定為甲醇-0.1%磷酸水溶液。

3.2 波長(zhǎng)的選擇采用二極管陣列檢測(cè)器，在200～400 nm波長(zhǎng)下對(duì)大黃提取液與2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸混合對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸在230、282 nm下有最大吸收。在230、282 nm檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，282基線漂移以及雜峰較多，而用230 nm時(shí)，基線相對(duì)平穩(wěn)，雜峰較少，溶劑峰小，2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸響應(yīng)值較大，故最終采用230 nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)氧化石墨烯萃取大黃中有機(jī)氯的方法進(jìn)行優(yōu)化篩選的基礎(chǔ)上，排除了其他雜質(zhì)的干擾及影響，對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作步驟進(jìn)一步優(yōu)化，檢測(cè)常見(jiàn)中藥大黃中的2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸殘留量變得簡(jiǎn)便與快速。本方法的建立對(duì)于中藥大黃中2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸殘留的快速監(jiān)測(cè)有著重要的意義。

目前，中藥材的來(lái)源基本上都是人工種植，種植中藥所噴灑的農(nóng)藥己成為影響中藥品質(zhì)的主要指標(biāo)。本文利用氧化石墨烯萃取大黃藥材中2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸，經(jīng)提取離心過(guò)濾后用高效液相色譜儀測(cè)定。該方法操作簡(jiǎn)單、快捷，在所用試驗(yàn)條件下，檢測(cè)限適宜，具有良好的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率，能滿足2，4-滴丙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸殘留量的檢測(cè)要求。