姚偉潔，趙香妍

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院北京婦幼保健院，北京 100006；2北京市和平里醫(yī)院

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）作為糖尿病的常見并發(fā)癥之一，在病程后期易導(dǎo)致患者肢端潰爛甚至造成截肢，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。DPN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明，有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)參與了DPN的發(fā)生發(fā)展［2］。木丹顆粒作為臨床治療DPN的常用中藥，治療效果顯著［3-4］。前期研究發(fā)現(xiàn)，木丹顆粒治療DPN的機(jī)制與抑制Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）相關(guān)通路，從而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，然而木丹顆粒是通過何種途徑調(diào)控TLR4通路的至今尚未有深入研究。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-146a參與了DPN的發(fā)生，并與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［5］。但是木丹顆粒能否通過影響miR-146a的表達(dá)，調(diào)控TLR4通路改善DPN，至今尚未有研究。本實(shí)驗(yàn)以木丹顆粒為治療藥物，以鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的DPN大鼠和高糖環(huán)境下培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞（schwann cells，SCs）為研究對(duì)象，將miR-146a作為切入點(diǎn)，探討木丹顆粒調(diào)控TLR4通路的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只SD雄性大鼠，SPF級(jí)，周齡6～8周，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)條件：動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)飼養(yǎng)室，12 h/12 h晝夜交替、溫度（23±2）℃、濕度（55±10）%，自由進(jìn)食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞雪旺細(xì)胞選擇大鼠RSC96細(xì)胞株（American type culture collection），選用dmem（dulbecco's modified eagle medium）完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中含有4 mM谷氨酰胺，25 mM葡萄糖，1 mM丙酮酸鈉，1500 mg/L碳酸氫鈉，10% FBS及1%青鏈霉素混合液）培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)環(huán)境為37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.3 藥品及試劑鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma-Aldrich，批號(hào)：S0130）；α-硫辛酸（Puritan's Pride，批號(hào)：6007）；木丹顆粒（遼寧奧達(dá)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20080033，規(guī)格：7 g/袋）；D-葡萄糖（Sigma，批號(hào)：D7021）；澳洲胎牛血清（Gibco，批號(hào)：10099-141）；Trizol試劑（Invitrogen，批號(hào)：15596-025）；TransStart Tip Green qPCR SuperMix，TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（全式金，批號(hào)：AQ141-02、AT301-03）；小鼠單克隆β-actin抗體，兔單克隆TRAF6抗體，兔多克隆IRAK1抗體（Abcam，批號(hào)：ab8226、ab33915、ab238）

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器CareSens血糖儀（i-SENS）；3K15型低溫離心機(jī)（Sigma）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Molecular Devices，SpectraMax Plus 384）；CFX96TM型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rid）；PowerPac?型基礎(chǔ)電泳儀電源（Bio-Rid）；Mini-PROTEAN? Tetra電泳槽（Bio-Rid）；小型Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rid）；371型二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）；MLS-3020型高壓滅菌器（SANYO）。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.5.1 造模與分組將SD大鼠40只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，設(shè)10只為空白對(duì)照組，其余30只大鼠腹腔注射60 mg/kg的STZ溶液誘導(dǎo)糖尿病模型，穩(wěn)定1周后空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）≥16.7 mmol/L的大鼠表明糖尿病模型建立成功。將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、α-硫辛酸組和木丹顆粒組，每組10只。

1.5.2 給藥方法α-硫辛酸組給予20 mg/（kg·d）的α-硫辛酸溶液，木丹顆粒組給予2.3 g/（kg·d）的木丹顆粒溶液，空白對(duì)照組和模型組給予10 mL/（kg·d）劑量的飲用水，連續(xù)給藥12周。末次給藥1 h后處死大鼠，收集坐骨神經(jīng)。

1.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.6.1 含藥血清制備另選SD大鼠30只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，空白血清組15只，α-硫辛酸含藥血清組5只，木丹顆粒含藥血清組10只。連續(xù)干預(yù)7天，末次干預(yù)1 h后腹主動(dòng)脈取血，離心半徑13.5 cm，3000 r/min離心10 min，4℃分離血清，60℃水浴滅活后除菌（0.22 μm微孔濾膜過濾除菌），分裝后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6.2 細(xì)胞處理RSC96細(xì)胞以4×105細(xì)胞/孔的數(shù)量接種于6孔板中，將細(xì)胞于培養(yǎng)箱中放置過夜，待細(xì)胞貼壁后，分別使用空白組大鼠血清、150 mM葡萄糖（Sigma）+空白組大鼠血清、150 mM葡萄糖+10% α-硫辛酸（ALA）含藥血清和150 mM葡萄糖+不同濃度（10%、1%和0.1%）木丹顆粒含藥血清孵育細(xì)胞48 h。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 RT-PCR法測(cè)定基因表達(dá)使用Trizol法分別提取大鼠坐骨神經(jīng)和RSC96細(xì)胞中的總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼續(xù)使用SYBR預(yù)混系統(tǒng)和特異性引物將cDNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，確定每個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，以β-actin作為內(nèi)參，對(duì)各樣本miR146、TRAF6和IRAK1進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析，計(jì)算2-△△Ct目的基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以倍數(shù)形式表示。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.7.2 Western blot法測(cè)定蛋白表達(dá)使用RIPA裂解液分別提取坐骨神經(jīng)和RSC96細(xì)胞中總蛋白，并使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。在SDS-PAGE凝膠中使用電泳分離蛋白質(zhì)，并通過濕式轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至0.45 μm PVDF膜上。使用脫脂奶粉室溫封閉蛋白2 h后，加入相應(yīng)一抗4℃孵育過夜。然后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h后，加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑并在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rid）中形成圖像。使用Image J軟件計(jì)算樣品灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)，將β-actin作為內(nèi)標(biāo)蛋白，結(jié)果以倍數(shù)的形式表示。使用了以下一抗：兔單克隆TRAF6抗體，兔多克隆IRAK1抗體，小鼠單克隆β-actin抗體。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用±s表示，多組獨(dú)立樣本比較使用One-Way ANOVA，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠坐骨神經(jīng)miR-146a、IRAK1、TRAF6mRNA及蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組比較，模型組miR-146a表達(dá)顯著降低（P＜0.01），IRAK1、TRAF6蛋白和mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，木丹顆粒組miR-146a表達(dá)顯著升高（P＜0.01），IRAK1、TRAF6蛋白和mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠坐骨神經(jīng)IRAK1和TRAF6蛋白表達(dá)電泳圖

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)miR-146a，IRAK1、TRAF6蛋白及mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)miR-146a，IRAK1、TRAF6蛋白及mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*表示P＜0.01，#表示P＜0.05；與模型組比較，△表示P＜0.01

組別空白對(duì)照組模型組α-硫辛酸組木丹顆粒組鼠數(shù)10 10 10 10 miR-146a 1.00±0.06 0.35±0.05*0.82±0.05#0.80±0.04#△IRAK1 mRNA 1.00±0.09 1.77±0.08*1.36±0.06*△1.35±0.05*△TRAF6 mRNA 1.00±0.06 1.72±0.03*1.34±0.06*△1.44±0.08*△IRAK1 1.00±0.07 2.20±0.17*1.42±0.05*△1.38±0.04#△TRAF6 1.00±0.10 1.57±0.09*1.27±0.08*△1.23±0.08*△

2.2 高糖環(huán)境下雪旺細(xì)胞miR-146a、IRAK1、TRAF6蛋白及mRNA表達(dá)與25 mM組比較，150 mM組miR-146a表達(dá)顯著降低（P＜0.01），IRAK1、TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）；與150 mM組比較，木丹顆粒含藥血清組miR-146a表達(dá)顯著升高（P＜0.01），10%和1%木丹顆粒含藥血清組IRAK1和TRAF6mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），0.1%木丹顆粒含藥血清組IRAK1 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表3。

表3 各組含藥血清對(duì)高糖環(huán)境下雪旺細(xì)胞miR-146a、TRAF6、IRAK1蛋白及mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組含藥血清對(duì)高糖環(huán)境下雪旺細(xì)胞miR-146a、TRAF6、IRAK1蛋白及mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與25 mM組相比，*表示P＜0.01，#表示P＜0.05；與150 mM組相比，△表示P＜0.01，&表示P＜0.05

組別25 mM組150 mM組150 mM+10%ALA組150 mM+10%MD組150 mM+1%MD組150 mM+0.1%MD組樣本量4 4 4 4 4 4 miR-146a 1.00±0.07 0.37±0.04*0.79±0.05*△0.82±0.05#△0.66±0.06*△0.59±0.04*△IRAK1 mRNA 1.00±0.11 1.80±0.05*1.24±0.08#△1.41±0.06*△1.50±0.04*△1.64±0.04*&TRAF6 mRNA 1.00±0.06 1.75±0.10*1.26±0.06#△1.28±0.08*△1.50±0.03*&1.63±0.07*IRAK1 1.00±0.09 2.52±0.20*1.67±0.14*△1.58±0.19#△1.90±0.11*&2.49±0.20*TRAF6 1.00±0.06 1.55±0.04*1.17±0.07△1.23±0.08#△1.12±0.07△1.38±0.04*

圖2 各組含藥血清高糖環(huán)境下雪旺細(xì)胞IRAK1和TRAF6蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

SCs是周圍神經(jīng)的髓鞘形成細(xì)胞［6］，其代謝紊亂易導(dǎo)致神經(jīng)纖維出現(xiàn)髓鞘脫失，是DPN的主要病理特征［7］。研究發(fā)現(xiàn)，SCs容易受高血糖的影響，高糖環(huán)境下SCs的損傷和線粒體的功能障礙會(huì)導(dǎo)致軸突萎縮，髓鞘脫失等病理改變［8］，因此，可將高糖環(huán)境下培養(yǎng)的SCs作為DPN研究的體外模型。含藥血清是由姜廷良教授引入中國(guó)的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，能夠真實(shí)地反映藥物的藥效及其作用環(huán)境，在體外實(shí)驗(yàn)中可信度優(yōu)于中藥粗制劑［9］。因此本實(shí)驗(yàn)的體外實(shí)驗(yàn)采用高糖環(huán)境培養(yǎng)的SCs為研究對(duì)象，使用木丹顆粒含藥血清為治療藥物干預(yù)SCs，結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，共同探討木丹顆粒對(duì)TLR4通路的調(diào)控機(jī)制。

DPN的中醫(yī)病機(jī)以氣滯血瘀為主［10］，木丹顆粒在臨床治療DPN療效顯著［3-4］。方中黃芪為君藥，可使氣旺血行；三七、延胡索為臣藥，功效為活血止痛；佐以赤芍、丹參、川芎、紅花、蘇木和雞血藤，共同達(dá)到活血化瘀，通絡(luò)止痛的作用［11］。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中對(duì)木丹顆粒治療DPN的機(jī)制進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，木丹顆粒能夠抑制DPN大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路和TLR4/p38 MAPK通路，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，改善周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的損傷。

微RNA（MicroRNA，miRNA）是高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度20～25 nt，能夠通過靶向信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3’UTR區(qū)域堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而抑制或降解靶標(biāo)mRNA的翻譯和表達(dá)［12］。miRNA在病理過程中發(fā)揮了重要的作用，能夠作為疾病預(yù)警和早期診斷的生物標(biāo)志物［13］。miR-146a參與急性和慢性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)已被廣泛證明，有研究發(fā)現(xiàn)在miR-146a缺陷型小鼠中觀察到炎癥反應(yīng)標(biāo)志物的高表達(dá)［14-15］。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-146a參與了DPN的發(fā)生，并與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［5］。

IRAKl和TRAF6是miR-146a調(diào)控的兩個(gè)主要靶基因，能夠?qū)ρ装Y進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)控［16］。IRAK1和TRAF6是TLR下游通路中的兩個(gè)重要分子［17］，TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活能夠誘發(fā)炎癥反應(yīng)［18］，其 中MyD88能 夠 與IRAKl和TRAF6形 成MyD88-IRAKs-TRAF6復(fù)合體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，IRAK1和TRAF6的活化會(huì)引發(fā)NF-κB的核移位，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生［19-20］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)均證明，木丹顆粒能夠促進(jìn)miR-146a的表達(dá)，并抑制IRAK1和TRAF6的蛋白和基因表達(dá)。

綜上所述，木丹顆粒能夠通過促進(jìn)miR-146a的表達(dá)，進(jìn)而抑制IRAK1和TRAF6的表達(dá)，從而調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB通路，抑制炎癥反應(yīng)，防治DPN。