唐小龍，楊麗霞，繆延棟，哈武華，米登海，△

1川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000;2蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院；3甘肅省中醫(yī)藥研究院

急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）是危害人類健康的重大疾病［1］。AML是白血病的主要類型，是最常見的成人急性白血?。?］。自20世紀70年代以來，大多數(shù)類型的AML的治療方式?jīng)]有改變，AML的低治愈率也沒有明顯改善［3］。雖然現(xiàn)在小分子靶向治療、免疫治療及造血干細胞移植等治療方式取得了一定的治療效果，但因高昂的費用而無法普及。因此，尋找普及性高的AML治療藥物是目前的當(dāng)務(wù)之急。

“蘭州方”是國家級名中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合專家、衛(wèi)生部突出貢獻專家裴正學(xué)教授結(jié)合幾十年治療經(jīng)驗擬定的經(jīng)驗方，曾治愈一例急性白血病患者，在1974年蘇州全國血液病學(xué)術(shù)會議上經(jīng)過研討，被命名為“蘭州方”［4］?！疤m州方”用于臨床多年，但成分復(fù)雜，其作用機制仍不清楚。積極探索“蘭州方”中的有效成分、作用機制也許能為AML的治療提供新的啟示。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于多成分和多靶點分析臨床疾病有效組合藥物的方法，非常適合用來闡明復(fù)雜的中藥復(fù)方對疾病的作用機制［5］。通過計算復(fù)方的靶點與疾病相關(guān)蛋白的聯(lián)系，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以將復(fù)方與疾病的關(guān)系呈現(xiàn)出來，為理解復(fù)方治療疾病的機制提供整體框架［6］。從“一種藥物，一個靶點”到“多種藥物，多個靶點”，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能充分挖掘復(fù)方藥物的治療潛力［7］。

1 資料與方法

1.1 “蘭州方”治療AML的有效成分和靶點及構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP）［8］收集“蘭州方”的化合物，化合物納入標準為生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類 藥性（drug likeness，DL）≥0.18［9］，并同時收集化合物的蛋白靶點?；贒isgenet、Drugbank、NCBI、OMIM、Pharmgkb和TTD疾病數(shù)據(jù)庫，通過關(guān)鍵詞“acute myelogenous leukemia”和“AML”搜索并采集AML疾病相關(guān)基因。通過UniProt數(shù)據(jù)庫，將“蘭州方”的蛋白靶點轉(zhuǎn)換為基因靶點。在對藥物以及疾病的基因靶點取交集后，將共同靶點放入Cytoscape，建立“蘭州方”治療AML的有效成分及對應(yīng)靶點的網(wǎng)絡(luò)。

1.2 “蘭州方”治療AML的核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將共同靶點置入STRING數(shù)據(jù)庫，在得到共同靶點之間相互關(guān)系的文件后，將共同靶點相互關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件進行分析。使用CytoNCA插件，計算各個靶點Betweenness（BC）、Closeness（CC）、Degree（DC）、Eigenvector（EC）、Local Average Connectivity-based method（LAC）、Network（NC）的評分，并篩選出評分大于平均值的靶點構(gòu)建核心網(wǎng)絡(luò)［10］。同時，使用CytoHubba插件中的degree模塊、maximal clique centrality（MCC）模塊和edge percolated component（EPC）模塊構(gòu)建核心網(wǎng)絡(luò)［11］。

1.3 功能富集分析使用R軟件中的“clusterProfiler”［12］“org.Hs.eg.db”“enrichplot”和“ggplot2”包對共同靶點進行基因本體（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，并將富集結(jié)果進行可視化處理。

1.4 分子對接為了進一步探索化合物和靶基因之間潛在的直接作用機制，對靶蛋白及對應(yīng)的化合物進行分子對接。首先，從PubChem數(shù)據(jù)庫獲得“蘭州方”中有效化合物的mol2結(jié)構(gòu)作為分子對接配體，從PDB數(shù)據(jù)庫中獲得AML相關(guān)蛋白晶體結(jié)構(gòu)作為受體。然后，使用AutoDock vina對配體和受體進行分子對接，AutoDock vina是一個開源應(yīng)用，可以實現(xiàn)高效、穩(wěn)健的分子對接。通常分子結(jié)合能≤-5 kcal/mol-1被認為是有效結(jié)合，分子結(jié)合能越小，表示預(yù)測配體和受體結(jié)合的能力越強。

2 結(jié)果

2.1 “蘭州方”治療AML的有效成分及對應(yīng)靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過TCMSP平臺，檢索了“蘭州方”主要藥物的化合物成分，包括：生地黃、山藥、山萸肉、人參須、太子參、北沙參、黨參、五味子、桂枝、白芍、生姜、大棗、炙甘草、麥冬以及浮小麥，其中麥冬和浮小麥沒有相關(guān)資料，因此未被納入后續(xù)分析?；贠B≥30%及DL≥0.18，篩選到“蘭州方”中能被人體口服利用的化合物，并通過與AML疾病相關(guān)基因取交集，得到與AML直接相關(guān)的有效化合物139種，各種藥物含有的化合物以及有效化合物數(shù)量見表1?；贒isgenet、Drugbank、NCBI、OMIM、Pharmgkb和TTD疾病數(shù)據(jù)庫，共查詢到348個AML疾病相關(guān)基因，見圖1A。通過取交集，共得到39個“蘭州方”作用于AML的靶基因，見圖1B。為了更好地展示藥物、化合物成分和AML靶基因的相互關(guān)系，基于Cytoscape 3.8，將藥物、化合物成分及AML靶基因的相互關(guān)系進行分析并構(gòu)建了網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1C。通過網(wǎng)絡(luò)圖，“蘭州方”與AML靶基因復(fù)雜的關(guān)系能被清晰的呈現(xiàn)。該網(wǎng)絡(luò)圖也清晰呈現(xiàn)了Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Naringenin、Diosgenin是作用靶基因數(shù)量最多的5種化合物。見表2。

圖1 “蘭州方”治療AML的有效成分及對應(yīng)靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖

表1 “蘭州方”中各味藥含有的化合物以及有效化合物數(shù)量

表2 “蘭州方”中治療AML作用靶基因最多的5種化合物

2.2 “蘭州方”治療AML的核心網(wǎng)絡(luò)使用STRING數(shù)據(jù)庫，對39個靶基因的相互關(guān)系進行分析并保存為TSV格式文件，置入Cytoscape進行分析。基于CytoNCA插件，將臨界值設(shè)定為BC＞15.73434343，CC＞0.4，DC＞5，EC＞0.103901334，LAC＞2.666666667，NC＞3.466666667，得到8個核心 基 因，包括：MAPK3、STAT3、TP53、VEGFA、HIF1A、IL1B、CXCL8及PTGS2，見圖2A。隨后，基于cytoHubba插件，再次通過3種拓撲算法“Degree”“EPC”和“MCC”進行分析，不同算法展示的結(jié)果幾乎一致，證明了結(jié)果的準確性，見圖2B-D。

圖2 “蘭州方”治療AML的核心網(wǎng)絡(luò)

2.3 GO功能富集與KEGG通路富集分析使用GO功能富集分析了39個靶基因的生物學(xué)過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF），見圖3A。結(jié)果顯示，其主要富集于：細胞對有毒物質(zhì)和異生物質(zhì)的反應(yīng)、活性氧代謝過程、機體對異生物質(zhì)的反應(yīng)及代謝過程等。KEGG通路富集分析顯示靶基因主要富集于：鉑類藥物抵抗、癌癥中的miRNA、PI3K-Akt通路、HIF-1通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、VEGF信號通路、NF-kappa B信號通路。結(jié)果中很多通路與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，揭示了“蘭州方”治療AML的潛在機制，見圖3B。

圖3 “蘭州方”治療AML靶基因的GO與KEGG分析

2.4 分子對接使用AutoDock vina軟件模擬分子對接過程。PTGS2被證明是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因之一，之前結(jié)果也顯示其是“蘭州方”治療AML的核心基因之一，且被多種化合物影響，因此選擇PTGS2編碼的蛋白COX-2進行模擬分子對接。塞來昔布是COX-2的特異性抑制劑，將它與COX-2的結(jié)合作為分子對接的陽性對照。通過PDB網(wǎng)站，查詢到COX-2的活性口袋的位置。在確定活性口袋位置后，vina軟件揭示塞來昔布能在該位置與COX-2集合，結(jié)合能為-11.0 kcal/mol-1，如圖4A。在同一部位，筆者發(fā)現(xiàn)Kaempferol、Quercetin、Luteolin、naringenin、beta-Caro-tene都能與COX-2結(jié)合，結(jié)合能分別為：-8.9、-8.8、-8.5、-8.9、-7.5 kcal/mol-1。通常結(jié)合能≤-5 kcal/mol-1被認為是有效結(jié)合，因此，結(jié)果提示“蘭州方”中的多種化合物成分與PTGS2等疾病相關(guān)靶點有良好的親和性。見圖4。

圖4 “蘭州方”中有效化合物與AML相關(guān)基因PTGS2編碼蛋白COX-2的親和性

3 討論

“蘭州方”是裴正學(xué)教授通過多年臨床實踐擬定的經(jīng)驗方，對AML的療效得到了普遍認可［13］?！疤m州方”中藥物成分多達15種，每種藥物中又有許多不同化合物，傳統(tǒng)方法難以解析其作用機制。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，構(gòu)建了“蘭州方”治療AML的網(wǎng)絡(luò)圖，探尋了起關(guān)鍵治療作用的化合物，探究了治療作用的核心靶點，分析了治療作用的主要富集功能和通路，并通過分子對接，驗證了“蘭州方”中小分子化合物與AML關(guān)鍵靶蛋白的相互作用。本研究基于“多種藥物，多個靶點”的基本邏輯思路，驗證了“蘭州方”的有效性和科學(xué)性，為“蘭州方”的推廣應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

通過構(gòu)建“藥物-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，筆者發(fā)現(xiàn)Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Naringenin、Diosgenin是作用靶點最多的5種化合物。經(jīng)過詳細查閱文獻，筆者發(fā)現(xiàn)Quercetin、Luteolin和Naringenin已經(jīng)被報導(dǎo)過，可能對AML有良好的療效。CHANG等14］報導(dǎo) 了Quercetin能通 過影 響細胞周期，凋亡和自噬，抑制人白血病HL-60細胞系 的 增 殖。SHI等［15］報 導(dǎo)Quercetin能 通 過VEGFR2和PI3K/Akt通路，誘導(dǎo)AML細 胞凋亡。CHEN等［16］基于結(jié)構(gòu)和虛擬篩選的方法，篩選并驗證了Luteolin能夠有效抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）相互作用激酶1（mitogen-activated protein kinase-interacting kinase 1，MNK1）。SHI等［17］報導(dǎo)Naringenin可能通過抑制Akt和ERK通路，促進JNK和p53通路，增強curcumin誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡。然而，Kaempferol、Diosgenin及“蘭州方”中的其他化合物沒有被驗證過對AML有治療作用。不過有許多研究報導(dǎo)了Kaempferol、Diosgenin及“蘭州方”中其他化合物在其他腫瘤里的抗癌潛力，為后續(xù)的研究提供了可能的方向［18-19］。

通過cytosnape里的CytoNCA和cytoHubba插件，得到了“蘭州方”治療AML的核心基因，包括：VEGFA、MAPK3、IL1B、STAT3、HIF1A和PTGS2等。目前已經(jīng)有大量研究報導(dǎo)了這些基因與AML之間的關(guān)系。VEGFA是抑制血管生成靶向治療的主要靶點，對AML的發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用［20］。MAPK3是MAP激酶家族的成員，在信號級聯(lián)中起重要作用，與眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［21］。白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）是白細胞介素1細胞因子家族成員，是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，參與多種細胞活動，包括細胞增殖、分化和凋亡，也參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括AML［22］。信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白家族成員，能被相關(guān)激酶磷酸化，形成二聚體轉(zhuǎn)移到細胞核中激活轉(zhuǎn)錄，在眾多腫瘤中都處于高度激活狀態(tài)［23］。最近，有報導(dǎo)闡述了STAT3在調(diào)節(jié)腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用，靶向STAT3已成為許多癌癥的潛在治療策略［24］。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1 α，HIF1α）作為細胞對缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，激活包括能量代謝、血管生產(chǎn)、細胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，與眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系［25］。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）是前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶之一，負責(zé)參與炎癥和有絲分裂的前列腺素生物合成，在結(jié)直腸癌等腫瘤中，PTGS2被證明是有效的治療靶點［26］。因此，基于既往的研究，表明“蘭州方”可以通過影響多個已被證實的有效靶點治療AML。

通過對共同靶基因的GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)“蘭州方”治療AML的基因功能主要富集在血管生成、活性氧代謝過程、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)及代謝過程等方面。血管生成和活性氧代謝是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵表型［27-28］。長期接觸有毒物質(zhì)，特別是在特定的工作或生活環(huán)境中，是誘發(fā)腫瘤的關(guān)鍵因素之一［29］。本研究結(jié)果表明，“蘭州方”可能通過影響以上生物學(xué)過程，發(fā)揮治療AML的作用。

KEGG富集分析結(jié)果表明，共同靶基因的相關(guān)通路主要有癌癥中的miRNA、PI3K-AKT信號通路，HIF-1信號通路，VEGF信號通路，NF-KB信號通路等。有文獻報道中藥能夠通過影響miRNA的表達量，改變信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達，從而治療腫瘤［30-31］，這與我們的研究相似。PI3K-AKT通路已經(jīng)被廣泛研究，該通路調(diào)節(jié)細胞增殖、生長、代謝和運動，在癌癥發(fā)生發(fā)展中普遍被激活，大量研究表明抑制該通路可抑制腫瘤的進展［32］。HIF-1信號通路在機體缺氧狀態(tài)下被激活。HONG等［33］報道，中草藥的活性成分能夠抑制HIF-1信號通路，進而抑制腫瘤血管生成。VEGF信號通路主導(dǎo)血管生成，抗VEGF信號通路是腫瘤治療的主要手段之一，有文獻報道穿心蓮內(nèi)酯能夠通過抑制VEGF信號通路從而抑制乳腺癌發(fā)展［34］。NF-κB信號通路參與調(diào)節(jié)免疫、炎癥和細胞生存，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵通路。有文獻表明，通過抑制NF-κB信號通路，能夠抑制腫瘤的發(fā)展與抗腫瘤藥物耐藥性的產(chǎn)生［35-36］。以上多條信號通路涉及炎癥、免疫調(diào)節(jié)、血管生成等，且都與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，我們推測“蘭州方”中的活性成分主要通過調(diào)節(jié)以上多條信號通路發(fā)揮治療AML的作用。

筆者采用分子對接方法驗證“蘭州方”中的有效成分與AML中的關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)合能力。PTGS2是核心基因之一，且被“蘭州方”中最多的化合物影響，因此筆者選擇PTGS2進行分子對接驗證。結(jié)果證實，多種化合物都與PTGS2的編碼蛋白COX2的活性口袋區(qū)域具有良好的親和性，并且進一步說明了“蘭州方”通過“多種藥物、多個靶點”的綜合作用，發(fā)揮治療AML的作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建了“蘭州方”治療AML的網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測起關(guān)鍵治療作用 的 化 合 物 為：Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Naringenin、Diosgenin；治療的核心靶點為：MAPK3、STAT3、TP53、VEGFA、HIF1A、IL1B、CXCL8和PTGS2；潛在治療機制影響的通路包括：PI3KAKT信號通路，HIF-1信號通路，VEGF信號通路，NF-κB信號通路等；并通過分子對接，驗證了“蘭州方”中小分子化合物與AML關(guān)鍵靶蛋白PTGS2的相互作用；圍繞“多種藥物，多個靶點”的基本分析策略，驗證了“蘭州方”的有效性和科學(xué)性，為“蘭州方”的推廣應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。