李兵

邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001

目前，心血管疾病居我國居民致死疾病譜首位，動脈粥樣硬化所致缺血性心血管疾病、缺血性心肌病是其主要致死原因［1］，氧化應(yīng)激所致心肌細胞凋亡與自噬是該病進展的重要病理基礎(chǔ)［2-3］。丹參多酚酸鹽（salvianolate，SAL）是中藥丹參的水溶提取物，具有抗氧化、抗炎等多種生物學活性［4-5］，目前臨床上主要用于治療輕、中度穩(wěn)定型心絞痛。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)SAL能夠通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而對心肌缺血再灌注大鼠起到一定保護作用［6-7］。本實驗以H9c2心肌細胞為研究對象，探討SAL對過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導H9c2心肌細胞凋亡與自噬的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞H9c2心肌細胞（上海中國科學院細胞庫，目錄號：GNR5）。H9c2細胞接種在含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代一次，取第三代對數(shù)生長期H9c2細胞進行實驗研究。

1.2 藥物及試劑DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號：SH30019.02）；SAL［上海綠谷制藥有限公司，批號：1903027，規(guī)格：50 mg/瓶（含丹參乙酸鎂40 mg）］；胰酶、胎牛血清（美國Invitrogen公司，批號：S27053、A44382）；青鏈霉素、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（上海源葉生物科技有限公司，批號：D17A8F61375、B11A5C33718）；CCK-8試劑盒、山羊抗兔IgG二抗（北京索萊寶科技有限公司，批號：CK04、SE134）；兔抗鼠蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylation Akt，p-Akt）、半胱氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3）、B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相 關(guān)X蛋 白（Bcl-2 related X protein，Bax）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylation mammalian target of rapamycin，p-mTOR）、Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）、P62抗體（Abcam公司，批號：ab207316、ab207324、ab186210、ab185436、ab190527、ab203408、ab182714、ab2061118、ab194329）；增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試 劑 盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒、RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸（bisquinolinecarboxylic acid，BCA）試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號：P0018S、C1075S、P0013C、P0012）。

1.3 實驗儀器HERACell 150i型細胞培養(yǎng)箱（德國Thermo公司）；RT-6100型酶標儀（美國Rayto公司）；ST16R型超速冷凍離心機（美國Beckman公司）；MF52型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；FACS Calibur流式細胞儀、PowerPac HV型電泳儀、Trans-Blot SD型 轉(zhuǎn) 膜 儀（美 國Bio-Rad公司）；C600型凝膠成像系統(tǒng)（美國Azure公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備［8］取對數(shù)生長期H9c2心肌細胞，經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度5×105個/mL的單細胞懸液，200 μL/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，更換含有100 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h以制備H2O2誘導H9c2心肌細胞氧化損傷模型。

1.4.2 細胞分組設(shè)H2O2組和SAL50、100、200 mg/L組；另取對數(shù)生長期H9c2細胞設(shè)為正常組。

1.5 觀察指標

1.5.1 H9c2心肌細胞增殖率各組細胞經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度5×104個/mL的單細胞懸液，100 μL/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每組設(shè)10個復孔；SAL50、100、200 mg/L組分別加入含50、100、200 mg/L的SAL培養(yǎng)液，H2O2組和正常組加常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，10 μL/孔加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后消化并收集細胞，然后通過酶標儀測定570 nm處吸光度（A）。

細胞增殖抑制率（%）=（A藥物組/A正常組）×100%1.5.2 H9c2心肌細胞凋亡率各組細胞經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度5×105個/mL的單細胞懸液，以200 μL/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每組設(shè)10個復孔；SAL 0、100、200 mg/L組分別加入含50、100、200 mg/L的SAL培養(yǎng)液，H2O2組和正常組加常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后消化，以離心半徑8.4 cm，2000 r/min離心5 min收集細胞，按照試劑盒說明，滴加稀釋后的結(jié)合緩沖液重懸細胞，滴加Annexin V-FITC和PI染液，37℃避光孵育15 min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5.3 H9c2心肌細胞自噬小體數(shù)量［8］按照“1.5.2”項方法，各組細胞給藥干預并培養(yǎng)24 h后，更換含有GFP-LC3質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基（不含胎牛血清），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，通過熒光顯微鏡下觀察，細胞內(nèi)亮綠色熒光點狀聚集即為自噬小體。

1.5.4 H9c2心肌細胞蛋白表達量各組細胞經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度1×106個/mL的單細胞懸液，以1 mL/孔接種于直徑60 mm培養(yǎng)皿，每組設(shè)10個皿，然后按照“1.5.2”項方法，各組細胞給藥干預并培養(yǎng)24 h后，消化并收集細胞，滴加RIPA蛋白裂解液于冰上裂解30 min后，4℃，離心半徑8.4 cm、12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度后、沸水浴5 min使蛋白完全變性，以30 μg蛋白量上樣進行10%SDSPAGE膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、以5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉2 h，分別滴加目標蛋白、β-actin兔抗鼠一抗后4℃孵育過夜，TBST洗膜3次后滴加山羊抗兔二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次后滴加ECL化學發(fā)光液，暗盒中顯影后采用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參半定量分析目的蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H9c2心肌細胞增殖率與正常組比較，H2O2組H9c2細胞增殖率顯著降低（P＜0.01）；與H2O2組比較，SAL100、200 mg/L組增殖率顯著升高（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組H9c2心肌細胞增殖率

2.2 H9c2心肌細胞凋亡率與正常組比較，H2O2組H9c2細胞凋亡數(shù)量明顯增多，凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與H2O2組比較，SAL50、100、200 mg/L組凋亡細胞數(shù)量明顯減少，凋亡率顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2—3。

圖2 各組H9c2心肌細胞凋亡率

圖3 各組H9c2心肌細胞凋亡水平

2.3 H9c2心肌細胞自噬小體數(shù)量結(jié)果與正常組比較，H2O2組H9c2細胞內(nèi)自噬小體（亮綠色熒光點狀聚集）數(shù)量明顯增多；與H2O2組比較，SAL50、100、200 mg/L組自噬小體數(shù)量不同程度減少，其中SAL200 mg/L組少于其他組。見圖4。

圖4 熒光顯微下各組H9c2心肌細胞自噬小體（×400）

2.4 H9c2心肌細胞Akt、p-Akt、p-mTOR蛋白表達及p-Akt/Akt表達量與正常組比較，H2O2組H9c2細胞p-Akt、p-mTOR表達明顯下調(diào)而p-Akt顯著降低（P＜0.01），兩組間Akt表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與H2O2組比較，SAL100、200 mg/L組H9c2細胞p-Akt、p-mTOR表達明顯上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），p-Akt顯著升高（P＜0.01）。見圖5—6。

圖5 各組H9c2心肌細胞Akt、p-Akt、p-mTOR蛋白表達電泳圖

2.5 H9c2心肌細胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3、P62蛋白表達及bcl-2/Bax、LC3-Ⅱ/LC3-I比值與正常組比較，H2O2組H9c2細胞Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-I、LC3-II、P62蛋白表達明顯上調(diào)而bcl-2表達下調(diào)（P＜0.01），bcl-2/Bax比值降低而LC3-II/LC3-I比值升高（P＜0.01）；與H2O2組比較，SAL100、200 mg/L組H9c2細胞Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-I、LC3-II、P62蛋白表達明顯下調(diào)且bcl-2表達上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），SAL50、100、200 mg/L組bcl-2/Bax比值升高而LC3-II/LC3-I比值降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖7—9。

圖6 各組H9c2心肌細胞Akt、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量及p-Akt/Akt表達量

圖7 各組H9c2心肌細胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3、P62蛋白表達電泳圖

圖8 各組H9c2心肌細胞Bcl-2/Bax、LC3-II/LC3-I比值

圖9 各組H9c2心肌細胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3、P62蛋白相對表達量

3 討論

活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）代謝失衡，誘導細胞凋亡、自噬，與各類心血管疾病進展密切相關(guān)［9-10］，其中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死以及經(jīng)治療實現(xiàn)再灌注后將引發(fā)ROS大量產(chǎn)生而過剩［11-12］。因此，以細胞凋亡和自噬為治療靶點，對改善心肌細胞氧化應(yīng)激損傷具有重要意義。

H2O2是細胞生理代謝過程中非常重要的一個中間產(chǎn)物，參與基因轉(zhuǎn)錄與表達、細胞增殖等細胞生物過程，但過量的H2O2將會誘發(fā)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而誘發(fā)細胞凋亡與自噬［13］。丹參以唇形科植物丹參的干燥根和根莖入藥，味苦、性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰之功效，臨床用于胸痹心痛、脘腹脅痛、癥瘕積聚、痛經(jīng)閉經(jīng)等癥的治療。SAL為丹參的水溶提取物，具有良好的抗氧化活性［4，14］，目前臨床上主要用于輕、中度穩(wěn)定型心絞痛的治療。本實驗采用H2O2干預制備H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型，給予不同濃度SAL進行干預發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SAL干預能夠明顯提高H9c2細胞增殖率并降低凋亡率，減少細胞內(nèi)自噬小體數(shù)量，提示SAL對H2O2所致H9c2細胞氧化應(yīng)激損傷后凋亡和自噬具有抑制作用。

細胞凋亡和自噬是由基因調(diào)控的兩種程序化自主死亡途徑，參與多種生理、病理過程，對維持細 胞 穩(wěn) 態(tài) 具 有 重 要 作 用［15］。Bcl-2家 族 和Caspase家族蛋白在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。在氧化應(yīng)激等病理性刺激下，Bax上調(diào)表達并轉(zhuǎn)移到線粒體膜而導致其通透性改變，細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）由線粒體釋放進入細胞質(zhì)，從而激活線粒體凋亡通路［16-17］。Cyt C將激活Caspase-3，活化Caspase-3蛋白被認為是細胞凋亡最重要啟動因子和執(zhí)行者，具有剪切細胞結(jié)構(gòu)蛋白等作用［18］；Bcl-2主要位于線粒體膜，對膜通透性具有保護作用，并且能夠與Bax形成二聚體而抑制Bax活性，所以Bcl-2/Bax表達比值能夠反映Bcl-2家族對細胞凋亡所起到的調(diào)控作用［19］。LC3蛋白具有LC3-I和LC3-Ⅱ兩種亞型，定位于細胞內(nèi)自噬體膜，其中LC3-Ⅱ能夠與線粒體受體蛋白結(jié)合而誘導其降解，LC3-I則無具備自噬活性，但自噬發(fā)生后LC3-I將轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，所以LC3-Ⅱ/LC3-I比值能夠反映細胞自噬水平［20-21］。P62能夠誘導靶蛋白泛素化而被自噬體包裹而被降解，能夠通過PB1結(jié)構(gòu)域與非泛素化蛋白聚集體結(jié)合而介導其自噬清除，并且P62能夠與LC3蛋白而促進自噬小體的形成［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SAL干預能夠明顯下調(diào)H9c2細胞Caspase-3、Bax、LC3-I、LC3-Ⅱ表達并上調(diào)Bcl-2表達，提高bcl-2/Bax比值并降低LC3-Ⅱ/LC3-I比值。

Akt是一種原癌基因，由胞漿移位到脂膜并被磷酸化而激活后，能夠誘導Caspase蛋白磷酸化而失活，抑制Bax蛋白表達［23］。p-Akt能夠誘導下游基因mTOR磷酸化而活化，p-mTOR能夠清除泛素蛋白而抑制細胞自噬，能夠誘導Beclin1蛋白磷酸化而失活，而Beclin1能夠介導LC3等自噬蛋白轉(zhuǎn)移到自噬體膜的關(guān)鍵因子，從而間接促進細胞自噬［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SAL干預能夠明顯上調(diào)p-Akt、p-mTOR蛋白表達并提高Akt磷酸化，下調(diào)Beclin1表達，提示SAL對H2O2所致H9c2細胞氧化應(yīng)激損傷后凋亡、自噬的抑制作用可能與激活Akt/mTOR/Beclin1通路有關(guān)。

綜上所述，SAL對H2O2所致H9c2心肌細胞凋亡與自噬具有抑制作用，其機制可能與激活Akt/mTOR/Beclin1通路而抑制促凋亡、促自噬相關(guān)蛋白表達和活化有關(guān)。