李歡，盧玲，廖現(xiàn)秋，何乾超，陳煒，梁霜，刁麗梅△

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院,廣西 南寧 530001；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

癲癇是繼偏頭痛、中風(fēng)和老年癡呆癥之后第四大最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。大約三分之一的癲癇患者對(duì)現(xiàn)有的抗驚厥藥物不敏感，極易復(fù)發(fā)，甚至伴有認(rèn)知功能障礙，給患者及社會(huì)增加了極大的負(fù)擔(dān)［2］。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，中國約有900萬例癲癇患者，而且每年約有40萬例的新發(fā)病例［3］。目前臨床上治療癲癇的主要方法包括病因治療、抗癲癇藥物治療及非藥物治療。由于癲癇發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，已知的藥效靶點(diǎn)較少，因此暫無療效確切的治療方案。而中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，在癲癇的治療和輔助治療方面具有很大的潛力。

中藥天南星（rhizoma arisaematis）臨床應(yīng)用十分廣泛，近幾年來，多項(xiàng)研究表明中藥天南星在治療癲癇中發(fā)揮重要作用。天南星，別名南星，虎掌南星，為天南星科植物天南星、異葉天南星或東北天南星的干燥塊莖。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、辛，性溫，有毒，歸肺、肝、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)止痙，化痰散結(jié)的功效，主要用于治療中風(fēng)痰壅、口眼歪斜，風(fēng)痰眩暈，頑痰咳嗽等疾病。藥理研究表明，天南星具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗心律失常、抗腫瘤、抗氧化、祛痰等作用［4］，然而其抗癲癇的具體作用靶點(diǎn)尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合了網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)和多藥理學(xué)的方法，是尋找新的分子靶點(diǎn)的一種很有前途的方法。在本研究的框架內(nèi)，通過對(duì)現(xiàn)有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出與癲癇相關(guān)的基因。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從“活性成分-藥物靶標(biāo)-通路”水平探索天南星治療癲癇的潛在新的藥物靶點(diǎn)及作用機(jī)制，可以為中藥單體在臨床抗癲癇的研究中提供更有力的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源本研究使用的相關(guān)分析平臺(tái)和數(shù)據(jù)庫見表1。

表1 相關(guān)分析平臺(tái)和數(shù)據(jù)庫

1.2 對(duì)天南星活性成分的檢索及篩選本研究借助TCMSP軟件，以“天南星”為檢索詞，檢索其活性成分，根據(jù)藥動(dòng)力學(xué)原理［5］，將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為活性成分篩選條件，篩查天南星的主要有效活性成分及其靶標(biāo)，并將所獲得的資料用Excel表格導(dǎo)出。

1.3 天南星作用靶標(biāo)的獲取及收集采用Perl軟件對(duì)相關(guān)有效成分作用靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后導(dǎo)入物種為“人”的Uniprot數(shù)據(jù)庫查找對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)靶標(biāo)基因名，從而得到天南星活性成分靶標(biāo)。

1.4 癲癇相關(guān)靶標(biāo)的獲取及與天南星預(yù)測(cè)靶標(biāo)的映射利用“epilepsy（癲癇）”為檢索詞，通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取癲癇疾病的相關(guān)靶標(biāo)，刪除重復(fù)靶標(biāo)基因。最后將天南星的預(yù)測(cè)靶標(biāo)與癲癇相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行映射，獲得天南星與癲癇疾病交集靶標(biāo)的韋恩圖。

1.5 “藥物-活性成分-疾病-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析將“1.3”項(xiàng)獲得的天南星治療癲癇的潛在靶標(biāo)，輸至Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病靶標(biāo)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，通過網(wǎng)絡(luò)圖直觀展示中藥天南星活性成分與潛在作用靶標(biāo)之間的關(guān)系。

1.6 構(gòu)建靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI圖）及核心靶標(biāo)的篩選將天南星治療癲癇的潛在靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫并限定研究種類設(shè)置為“homosapiens（人類）”，得出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，保存為tsv文件，將所得文件輸入R語言計(jì)算，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心靶標(biāo)圖。

1.7 GO富集分析與KEGG通路分析把天南星與癲癇疾病交集靶標(biāo)輸入R語言軟件進(jìn)行天南星活性成分治療癲癇關(guān)鍵靶標(biāo)基因Gene Ontology（gene ontology，GO）生物過程、KEGG信號(hào)通路功能注釋富集分析。

2 結(jié)果

2.1 天南星活性成分的檢索及篩選本研究根據(jù)TCMSP平臺(tái)檢索到天南星有效成分123個(gè)，相關(guān)靶點(diǎn)672個(gè)；再將OB≥30%、DL≥0.18對(duì)活性成分進(jìn)行篩選，共獲得天南星的主要活性成分7個(gè)，包括8、11、14-二十二碳三烯酸甲酯、24-表蛇甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇等。見表2。

表2 天南星的活性成分篩選結(jié)果（OB＞30%，DL＞0.18）

2.2 天南星成分治療癲癇的潛在作用靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中的靶標(biāo)預(yù)測(cè)，去除重復(fù)靶標(biāo)后得到天南星活性成分作用靶標(biāo)40個(gè)。通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫平臺(tái)合并去重后獲得癲癇疾病靶標(biāo)4621個(gè)。運(yùn)用R語言軟件將與天南星相關(guān)靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)取交集，獲得天南星治療癲癇的靶標(biāo)的韋恩圖，見圖1。最終獲得共同靶標(biāo)26個(gè)，表明天南星可通過多個(gè)靶標(biāo)發(fā)揮治療癲癇的作用。

圖1 中藥-疾病靶標(biāo)

2.3 藥物-活性成分-疾病-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建本次研究運(yùn)用Cytoscape 3.7.2進(jìn)行關(guān)系網(wǎng)絡(luò)繪制分析。結(jié)果顯示，中藥天南星主要通過6種有效成分作用于26個(gè)癲癇靶標(biāo)，這26個(gè)靶標(biāo)基因可能影響癲癇的發(fā)生。因此本課題組推測(cè)中藥天南星治療癲癇不僅是通過多種中藥活性成分作用于不同靶標(biāo)來實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)效應(yīng)，還可能通過潛在作用靶標(biāo)之間的相互影響，進(jìn)而產(chǎn)生了復(fù)雜的調(diào)節(jié)關(guān)系，從而發(fā)揮治療癲癇作用。見圖2。

圖2 中藥-成分-疾病-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 中藥-疾病靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)與核心靶標(biāo)篩選分析結(jié)果天南星-癲癇靶標(biāo)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。中藥-疾病核心基因按鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目由多到少依次為：CASP3、ADRA1B、JUN、MAOA、CASP8、CASP9、MAOB、PTGS2、SLC6A4、ADRB2、BAX、BCL2、PRKCA、SLC6A2、SLC6A3、OPRM1、PGR、MAP2、AKR1B1、CHRM3、GABRA1、KCNH2、NR3C2、SCN5A，見圖4。

圖3 中藥-疾病靶標(biāo)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 中藥-疾病核心靶標(biāo)的條圖

2.5 關(guān)鍵靶標(biāo)生物功能及通路分析

2.5.1 GO功能富集天南星治療癲癇的關(guān)鍵靶標(biāo)富集顯著的前10個(gè)生物學(xué)功能主要為類固醇激素受體活性，核受體活性，轉(zhuǎn)錄因子活性，細(xì)胞因子活性，細(xì)胞因子受體結(jié)合，核糖核酸聚合酶二轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，泛素樣蛋白連接酶結(jié)合，脫氧核糖核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，激酶調(diào)節(jié)活性，激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。表明天南星有效成分可以通過調(diào)控多種生物學(xué)途徑而發(fā)揮治療癲癇的作用，見圖5a—5b。

圖5 b GO功能富集分析氣泡圖

圖5 a GO功能富集分析柱狀圖

2.5.2 KEGG通路富集天南星治療癲癇的關(guān)鍵靶標(biāo)基因顯著富集在細(xì)胞凋亡-多種信號(hào)通路、乙型肝炎信號(hào)通路、含血清素的神經(jīng)突觸通路、人類免疫缺陷病毒1型感染信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、鉑耐藥信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、麻疹信號(hào)通路、結(jié)腸直腸癌信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、可卡因成癮信號(hào)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號(hào)通路、EB病毒感染信號(hào)通路、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）信號(hào)通路、人類巨細(xì)胞病毒感染信號(hào)通路等通路上。結(jié)果見圖6a—6b。

圖6 b KEGG通路富集分析氣泡圖

圖6 a KEGG通路富集分析柱狀圖

3 討論

癲癇在中醫(yī)里命名有多種，包括“巔疾”“癇證”或“癇病”等，俗稱“羊癇風(fēng)”或“羊癲風(fēng)”。《丹溪心法·癇》指出：“癇證有五，無非痰涎壅塞，迷悶孔竅……”故常將“痰氣逆亂、竅蒙風(fēng)動(dòng)”作為對(duì)癲癇病機(jī)的概括，以化痰熄風(fēng)，開竅定癇為基本治則［6-7］。天南星為傳統(tǒng)中藥，藥用歷史悠久，作用廣泛，常配伍其他中藥組方治療多種疾病。

本次通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索和“藥物-活性成分-疾病-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析，篩選出天南星中包括β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇等在內(nèi)的7個(gè)主要活性成分及靶標(biāo)40個(gè)，在Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫中得到癲癇潛在靶標(biāo)4621個(gè)，與天南星的靶標(biāo)映射得到天南星治療癲癇的靶標(biāo)26個(gè)，天南星治療癲癇的可能關(guān)鍵成分6個(gè)。研究表明，天南星的主要活性成分可通過多靶標(biāo)、多基因影響癲癇的發(fā)生，他們之間存在相互協(xié)同的關(guān)系。天南星治療癲癇的核心基因主要有CASP3、ADRA1B、JUN、MAOA、CASP8、CASP9、MAOB、PTGS2、SLC6A4、ADRB2、BAX、BCL2、PRKCA、SLC6A2、SLC6A3、OPRM1、PGR、MAP2、AKR1B1、CHRM3、GABRA1、KCNH2、NR3C2、SCN5A。這些基因可能通過影響類固醇激素受體活性，核受體活性，轉(zhuǎn)錄因子活性，細(xì)胞因子活性，細(xì)胞因子受體結(jié)合，核糖核酸聚合酶二轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，泛素樣蛋白連接酶結(jié)合，脫氧核糖核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，激酶調(diào)節(jié)活性，激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等來調(diào)控癲癇。即主要從炎癥因子、細(xì)胞因子等分子水平來治療癲癇。炎癥因子可改變神經(jīng)元興奮性從而誘發(fā)神經(jīng)元異常放電，而神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)間放電會(huì)造成神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞功能失調(diào)，最終加速細(xì)胞凋亡［8］。Caspase蛋白家族是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一類蛋白水解酶，其中Caspase-3在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起關(guān)鍵作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3參與癲癇患者顳葉組織的神經(jīng)細(xì)胞凋亡［10］，Caspase-3的升高可導(dǎo)致癲癇患者認(rèn)知功能下降［11］。凋亡的發(fā)生又與凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax的表達(dá)密切相關(guān)，而這兩者的異常表達(dá)又直接參與癲癇的病理過程［12-13］。GABRA1是γ-氨基丁酸受體，兩者結(jié)合可充分發(fā)揮神經(jīng)元興奮抑制作用，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥等功能［14-15］。

根據(jù)KEGG信號(hào)通路和GO生物過程富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)天南星治療癲癇的核心基因涉及的KEGG通路眾多。富集明顯的通路主要包括細(xì)胞凋亡-多種信號(hào)通路、乙型肝炎信號(hào)通路、含血清素的神經(jīng)突觸通路、人類免疫缺陷病毒1型感染信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、鉑耐藥信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、麻疹信號(hào)通路、結(jié)腸直腸癌信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、可卡因成癮信號(hào)通路、EB病毒感染信號(hào)通路、ALS信號(hào)通路、人類巨細(xì)胞病毒感染信號(hào)通路等通路上。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道凋亡信號(hào)通路與癲癇的發(fā)展聯(lián)系密切，凋亡信號(hào)通路的異常激活致使神經(jīng)元凋亡是海馬神經(jīng)元丟失的主要形式之一［16］。腺苷A1R參與了癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元損傷過程，它通過降低腺苷A1R活性，增加谷氨酸興奮性，最終誘導(dǎo)神經(jīng)元調(diào)亡［17］。田沁濤等［18］通過建立癲癇模型，發(fā)現(xiàn)在兩邊海馬CA1區(qū)注射anti-GDNF抗體能夠降低癲癇發(fā)作次數(shù)，起到神經(jīng)元保護(hù)作用，其機(jī)制可能是抑制了GDNF/RET/P53信號(hào)通路。可卡因成癮信號(hào)通路在癲癇中磷酸化水平明顯變化，可能與多巴胺受體功能有關(guān)［19］。ALS信號(hào)通路的改變涉及由Nefh編碼的神經(jīng)纖維細(xì)絲蛋白磷酸化的改變，而這個(gè)蛋白質(zhì)則與軸突功能密切相關(guān)［20］。上述通路涉及病毒、細(xì)菌、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)和腫瘤等各個(gè)方面。這些通路分別從不同的層面影響癲癇的發(fā)生發(fā)展。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)癲癇治療靶點(diǎn)、天南星的有效成分及作用靶點(diǎn)與機(jī)制進(jìn)行了初步的篩選與分析，為后續(xù)針對(duì)天南星治療癲癇的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制的研究提供了依據(jù)。此外，本研究存在一些缺點(diǎn)，由于篩選條件的限制，只能分析天南星中主要化合物，所以在一定程度上研究結(jié)果具有局限性。另外，雖然通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)能夠篩選出大量靶點(diǎn)和通路，但這些結(jié)果都有待于通過藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。