古惠文，江勉君，朱君瑤，史忠亮，郭力恒

1廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院,廣東 廣州 510403；2廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院

膿毒癥是機體感染免疫失調(diào)導致的威脅生命的器官功能障礙［1］。據(jù)報道，因膿毒癥入住ICU的患者占中國ICU患者的1/4，其90天死亡率高達35%［2］。目前，在膿毒癥早期明確診斷，及早開始液體復(fù)蘇與抗感染治療是改善膿毒癥預(yù)后的主要方式。近年來，中藥材提取物被廣泛用于治療膿毒癥，并取得良好的臨床療效，如丹參酮Ⅱ2a［3］、紅花黃色素［4］和人參多糖［5］等。川芎嗪是提取自川芎的酰胺類生物堿，具有抗血栓、抗缺血再灌注損傷，保護重要器官的作用，對膿毒癥所引起的器官損傷和并發(fā)癥具有治療作用［6］。但是，目前針對川芎嗪治療膿毒癥的研究較少，未能全面揭示川芎嗪治療膿毒癥的機制。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方法和分子對接技術(shù)，挖掘川芎嗪治療膿毒癥的靶點，進行功能富集分析和疾病信號通路分析，篩選關(guān)鍵靶點與川芎嗪進行分子對接，以闡明川芎嗪治療膿毒癥的機制。

1 資料與方法

1.1 川芎嗪化合物靶點預(yù)測1）使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）預(yù)測川芎嗪化合物靶點，將預(yù)測結(jié)果上傳Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）進行檢索，選擇物種為Homo sapiens（Human）的靶點，篩選出人源靶點。2）使用Pubchem數(shù) 據(jù) 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索Ligustrazine，收集川芎嗪化合物的2D結(jié)構(gòu)保存為SDF格式；將川芎嗪2D結(jié)構(gòu)SDF上傳至PharmMapper平臺（http：//www.lilabecust.cn/pharmmapper/），通過反向藥效團匹配法預(yù)測川芎嗪相關(guān)靶點，將靶點上傳Uniprot數(shù)據(jù)庫，擇物種為Homo sapiens（Human）的靶點，篩選出人源靶點。3）在通過Pubchem數(shù)據(jù)庫收集川芎嗪Pubchem ID上傳至BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）進行化合物靶點預(yù)測，篩選相關(guān)度較高。綜合上述3種方法預(yù)測川芎嗪化合物靶點，排除重復(fù)、非人源和不符合要求的靶點，獲得川芎嗪化合物靶點。

1.2 膿毒癥疾病靶點預(yù)測以“Sepsis”作為檢索詞，在GeneCards（https：//www.genecards.org/），OMIM（https：//www.omim.org/），TTD（http：//www.biomedsearch.com/）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測膿毒癥疾病靶點；收集上述4個疾病數(shù)據(jù)庫所預(yù)測的膿毒癥疾病靶點，排除重復(fù)靶點，獲得膿毒癥疾病靶點。

1.3 川芎嗪-膿毒癥靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將川芎嗪化合物靶點與膿毒癥疾病靶點上傳至生物平臺OmicShare，進行靶點映射，取交集部分作為川芎嗪治療膿毒癥的作用靶點。將川芎嗪治療膿毒癥作用靶點上傳至Cytoscape 3.7.1繪圖軟件構(gòu)建川芎嗪-膿毒癥靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 川芎嗪治療膿毒癥作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了闡明靶點蛋白在系統(tǒng)上的作用，將作用靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建PPI，物種限定為“Homosapiens”，設(shè)置置信度為midum confidence（0.4）。Cytoscape-Cytohubba可以提供11種算法對復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進行分析，篩選出在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用的靶點。將在STRING中所得的網(wǎng)絡(luò)導入如Cytoscape 3.7.1中，利用插件Cytohubba，選擇MCC算法對PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析打分，選擇分值最大的前10個靶點作為關(guān)鍵靶點。

1.5 GO功能富集分析與KEGG信號通路分析將川芎嗪治療膿毒癥作用靶點上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），設(shè)置P＜0.05，對川芎嗪治療膿毒癥作用靶點同時進行生物過程（biological process，BP）、分子組成（molecular function，MF）、細胞組成（cellular component，CC）分析和KEGG信號通路富集分析。

1.6 川芎嗪-關(guān)鍵靶點分子對接在PDB數(shù)據(jù)庫搜索川芎嗪治療膿毒癥的關(guān)鍵靶點的蛋白晶體復(fù)合物，借助PyMOL軟件將靶蛋白與原配體分離，同時去除靶蛋白中的水分子、磷酸根及多余的非活性配體，在AutoDuck Tools軟件中對處理后靶蛋白進行加氫、加電荷等操作。將川芎嗪的2D結(jié)構(gòu)導入ChemBio3D軟件，以mol2的格式保存其3D結(jié)構(gòu)，將靶點蛋白、原配體、川芎嗪的3D結(jié)構(gòu)統(tǒng)一設(shè)置成AutoDuck Tools軟件可識別的pdbqt格式，以原配體所在位點為靶蛋白的活性口袋，進行靶蛋白與川芎嗪的分子對接，對比分析川芎嗪與各靶蛋白的親和力。

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪化合物靶點與膿毒癥疾病靶點通過“1.1”項中的3種方法收集川芎嗪化合物靶點，經(jīng)排除重復(fù)、非人源性，不符合要求的靶點后，共收集川芎嗪化合物靶點243個。在GeneCards OMIM，DrugBank，TTD 4個數(shù)據(jù)庫收集膿毒癥疾病靶點，排除重復(fù)靶點后，共收集膿毒癥靶點1227個。使用生物平臺OmicShare對川芎嗪化合物靶點與膿毒癥疾病靶點進行映射得到川芎嗪治療膿毒癥的作用靶點46個；將結(jié)果導入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建川芎嗪-膿毒癥網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1。

圖1 川芎嗪-膿毒癥靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 川芎嗪治療膿毒癥的PPISTK4和FBXO32靶點未與其余靶點存在相互作用關(guān)系，將其排除。使用Cytohubba插件對PPI圖進行分析，共有44個節(jié)點，184條相關(guān)作用連線，篩選出關(guān)鍵節(jié)點10個，包括SERPINE1、PLG、SERPINF2、CPB2、F9、THBD、F10、IL-10、VEGFA、NOS3。見圖2、表1。

表1 川芎嗪治療膿毒癥關(guān)鍵靶點及MCC分值

圖2 川芎嗪治療膿毒癥作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

2.3 GO功能富集及KEGG信號通絡(luò)依據(jù)P＜0.05篩選GO條目，BP有30個，CC7個，MF7個。BP涉及凝血、血管再生、纖溶系統(tǒng)、鈉離子遷移、炎癥反應(yīng)等；CC涉及細胞外區(qū)域、血液微粒、細胞外泌體、纖維蛋白復(fù)合物、細胞外基質(zhì)；分子功能涉及血紅素結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、鈣離子結(jié)合、肝素結(jié)合、氧轉(zhuǎn)運蛋白活性、氧結(jié)合。依據(jù)P-Value＜0.05篩選KEGG條目，得到KEGG條目10條，涉及補體和凝血級聯(lián)、瘧疾、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、HIF-1信號通路、Rap1信號通路、金黃色葡萄球菌感染、FoxO信號通路、VEGF信號通路、利什曼病。見圖3、表2。

表2 川芎嗪治療膿毒癥作用靶點的GO分析

圖3 川芎嗪對膿毒癥作用靶點的KEGG分析的氣泡圖

2.4 川芎嗪-關(guān)鍵靶點分子對接使用AutoDock vina1.1.2將化合物川芎嗪10個關(guān)鍵靶點蛋白進行分子對接驗證。其中Affinity＜-4.5 kal/mol的靶點有IL-10、CPB2、THBD、SERPRINE1。結(jié)果表明這5個靶點蛋白容易與川芎嗪分子進行結(jié)合，結(jié)合后結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。見表3。

表3 川芎嗪治療膿毒癥作用關(guān)鍵靶點分子對接結(jié)果

3 討論

川芎嗪具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用［7］。臨床研究表明，川芎嗪能夠抑制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素6的生成，改善膿毒癥患者的預(yù)后［8-9］。同時多個動物研究也表明，川芎嗪對于膿毒癥動物的重要器官具有保護作用。如肖雷等［10］研究表明，川芎嗪可能通過激活Nrf2/HO-1通路，增強超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性，降低丙二醛水平，增強肝組織抗氧化能力，保護膿毒癥小鼠的肝功能。YING等［11］發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可減少NMDAR1（谷氨酸受體）和凋亡蛋白Caspase3的表達，減少膿毒癥小鼠的腎臟損傷，提高膿毒癥小鼠的存活率。

本研究通過Cytohubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析，篩選出在PPI中發(fā)揮重要作用的10個關(guān)鍵靶點，然后利用分子對接技術(shù)對關(guān)鍵靶點與川芎嗪分子進行分子對接。結(jié)果顯示F10、IL-10、CPB2、THBD、SERPRINE1等5個靶點蛋白與川芎嗪分子對接親和力最高，容易形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，發(fā)揮作用。其中F10、CPB2、THBD、SERPRINE1涉及凝血-抗凝-纖溶系統(tǒng)，IL-10涉及炎癥反應(yīng)。感染造成炎癥因子大量生成，損傷血管內(nèi)皮細胞，激活凝血系統(tǒng)，抑制抗凝和纖溶系統(tǒng)引起血液高凝狀態(tài)甚至是彌漫性血管凝血（diffuse intravascular coagulation，DIC），這成為膿毒癥后期形成多器官功能障礙綜合征的關(guān)鍵因素［12-13］。F10是凝血途徑中的重要凝血因子，既可以被FIXa激活啟動內(nèi)源性凝血途徑，又可以被FⅢFVⅡa復(fù)合物激活啟動外源性凝血途徑，是凝血級聯(lián)中的關(guān)鍵酶［14］。臨床研究表明，對膿毒癥患者使用低分子肝素抑制FXa激活可以延長部分活化凝血酶原時間及凝血酶原時間，減少纖維蛋白生成，改善凝血功能障礙和器官功能障礙［15-16］。血栓調(diào)節(jié)蛋白是THBD基因編碼的蛋白產(chǎn)物，可減少內(nèi)皮細胞損傷，有保護血管上皮的作用［17-18］。羧肽酶B2（carboxypeptidase b2，CPB2）與SERPINE1參與纖溶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，都具有限制纖溶酶生成，減少纖溶的作用。LEENAERTS等［19］通過限制纖溶酶生成正反饋機制而減少纖溶。SHI等［20］則通過抑制尿激酶與組織型纖溶酶原激活劑減少纖溶。IL-10是由T細胞產(chǎn)生的具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子；可通過減少IFN-γ、IL-2和IL-12的生成來抑制巨噬細胞的活性。這可避免細胞因子風暴的形成，維持免疫平衡［21-22］。

通過KEGG分析獲得10條信號通路，包括補體與凝血級聯(lián)，鈣信號通路，HIF-1信號通路，VEGF信號通路，金黃色葡萄球菌感染，F(xiàn)oxO信號通路，Rap1信號通路。其中富集因子最大的補體和凝血級聯(lián)可能是川芎嗪治療膿毒癥的過程中主要的作用途徑。補體是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過調(diào)理病原體，吸附白細胞吞噬和裂解病原體和感染組織，激活特異性免疫系統(tǒng)［23］。而且補體與凝血級聯(lián)關(guān)系密切，補體可以通過刺激炎癥因子的釋放激活凝血途徑，生成大量凝血酶，同時抑制抗凝與纖溶系統(tǒng)［24］。研究表明，大量補體的消耗往往意味廣泛凝血的激活［25］；而過度的凝血激活對于膿毒癥患者是不利的，這會造成血液高凝狀態(tài)甚至是DIC［26］。鈣信號通路廣泛存在于人體，參與機體生理病理過程。膿毒癥時，鈣通路開放，造成鈣離子內(nèi)流。鈣離子的大量增加促進自噬相關(guān)基因增加和自噬相關(guān)信號受體的表達，增加機體自噬，維持細胞穩(wěn)定，減少細胞凋亡［27］。HIF-1A信號通路可被由感染或灌注不足引起的缺氧所激活，啟動全身HIF-1A信號級聯(lián)反應(yīng)，破壞肺泡上皮細胞，這可能是造成膿毒癥急性肺損傷的機制［28］。VANDERFM，封萍等［29-30］發(fā)現(xiàn)，通過烏司他丁抑制VEGF的生成可有效的減少血管損傷，改善膿毒癥患者的預(yù)后。金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）是常見的病原菌，同時也是膿毒癥的主要致病菌。SA入侵機體后，可以通過各種粘附分子定植在細胞表面，或者血漿蛋白和細胞外基質(zhì)中，釋放多種毒力因子，包括破壞組織細胞的外毒素和造成免疫紊亂的內(nèi)毒素。此外，SA可通過抑制中性粒細胞滲出趨化和補體激活吞噬而抑制固有免疫；同時還能通過促進B細胞凋亡和抑制T細胞成熟來抑制特異性免疫［31-32］。FoxO信號通路參與機體的增殖、凋亡、代謝、炎癥、細胞因子表達、免疫、分化和抗氧化應(yīng)激等生理病理過程。其中FOXO3a可以增加前凋亡基因的表達，促進細胞凋亡導致器官損傷。而在敲除FOXO3a基因的大鼠中，LPS所誘導的細胞凋亡出現(xiàn)下調(diào)［33-35］。Rap1是cAMP的下游信號分子，能夠抑制NF-κB和調(diào)節(jié)炎癥基因的表達，改善由LPS誘發(fā)的肺部炎癥。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接，系統(tǒng)研究了川芎嗪治療膿毒癥的靶點、生物過程、信號通路等，發(fā)現(xiàn)川芎嗪治療膿毒癥可能通過作用于F10、IL-10、CPB2、THBD、SERPRINE1等關(guān)鍵靶點，調(diào)節(jié)膿毒癥過程中的補體與凝血級聯(lián)，鈣信號通路，HIF-1信號通路，VEGF信號通路，金黃色葡萄球菌感染，F(xiàn)oxO信號通路，Rap1信號通路，發(fā)揮作用，全面揭示了川芎嗪多靶點、多通路、多機制治療膿毒癥的藥理學作用，為后續(xù)進一步研究提供思路。