周鳳玲 王盈盈 周曉婭 (濟寧醫(yī)學院基礎醫(yī)學院分子醫(yī)學與化學實驗室,山東 濟寧 272000)

腰椎間盤退變(IVD)是人類常見慢性疾病,以下腰痛和急性下肢神經(jīng)根性疼痛為癥狀〔1〕,在以往的認識中,IVD 病因主要是由于與物理負荷有關(guān)的機械壓迫與損傷及人體組織的衰退及老化。研究證實IVD 是一種免疫介導的炎癥過程。Naylar 等〔2〕首先提出的椎間盤突出癥建立在特定解剖結(jié)構(gòu)基礎上的自身免疫理論,髓核是體內(nèi)最大的無血管組織,它處于免疫特權(quán)狀態(tài),一旦髓核暴露于免疫系統(tǒng)之中,引起局部自身免疫炎癥反應,隨后導致慢性炎癥和持續(xù)性腰腿痛。Th17 細胞的特點是產(chǎn)生白細胞介素(IL)-17A,但它們也分泌許多其他炎癥細胞因子,如IL-22、腫瘤壞死因子(TNF)-α 和IL-26〔3～6〕。最近,對人類和小鼠的大量研究表明,Th17 細胞在許多不同免疫介導疾病的發(fā)病機制中起主導作用,包括類風濕關(guān)節(jié)炎〔7〕、銀屑病〔8〕、哮喘〔9〕和炎癥性腸病〔10〕。但是Th17 細胞及IL-17A 在IVD 發(fā)病機制中的作用尚不明確,本研究分析IVD 患者外周血中Th17 細胞和IL-17A 的變化并探究Th17 細胞在其發(fā)病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2020年6月濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院及濟寧市第一人民醫(yī)院住院部住院的30 例IVD 患者,年齡63.2(61～65)歲,均接受了椎間盤切除術(shù),根據(jù)手術(shù)觀察和影像學表現(xiàn),分為兩組:突出組(纖維環(huán)完整組,n=15)和擠壓組(纖維環(huán)破裂組,n=15)。采集術(shù)前IVD 組及對照組〔健康對照人群13 例,年齡62.6(60～66)〕歲,空腹外周靜脈血。IVD 患者納入標準:典型的骨痛或坐骨神經(jīng)痛;Lasegue 征或Bragard 試驗陽性;脊柱X光片退變椎間盤厚度減小,脊柱生理曲度減小或消失,T2 加權(quán)磁共振成像(MRI)分析顯示,累及髓核的信號減弱,CT 上無鈣化跡象;無肺結(jié)核、類風濕關(guān)節(jié)炎或其他免疫紊亂,近期無糖皮質(zhì)激素使用史。根據(jù)Pfirrmann 分級系統(tǒng)確定IVD 程度,該系統(tǒng)基于MR 信號強度、椎間盤結(jié)構(gòu)、核與環(huán)的區(qū)別及椎間盤高度。實驗方案得到了濟寧醫(yī)學院人類受試者制度倫理審查委員會的前瞻性批準,所有研究對象簽署了關(guān)于使用體外組織和血液樣本的知情同意書。

1.2 分離外周血單核細胞(PBMC) 10 ml 外周靜脈血在實驗對象空腹的條件下抽取,采用密度梯度離心法從外周靜脈血樣本中分離出PBMCs,PBMCs在含有10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640 培養(yǎng)基(Hyclone,Waltham,MA,USA)和24 個U 形底部組織培養(yǎng)板(Costar, Corning Corning Corning, NY,USA) 中培養(yǎng)。培養(yǎng)皿中加入佛波酯(PMA)50 ng/ml和離子霉素2 g/ml 刺激1 h,然后加入布雷菲德菌素A 中并培養(yǎng)5 h,并進行胞內(nèi)染色和流式細胞儀分析。

1.3 運用流式細胞儀檢測Th 細胞 在分離后的PBMCs 用APC/H7-CD3 抗體、FITC-CD4 抗體、PE/Cy7-CD8 抗體和BV510-CD45RO 抗體(BD-PharMingen,San-Diego,CA,USA)在室溫黑暗中染色30 min,對照染色用APC/H7-IgG1、FITC-IgG1、PE/Cy7-IgG1和BV510-IgG1(BD-PharMingen)染色。CD4+細胞通過流式細胞門控進行分離。FlowJo 軟件7.6.2〔11〕用于分析每個樣本的CD4+和CD45RO+CD4+T 細胞的數(shù)量。在刺激后的PBMCs 中加入Alexa Fluor 647-CXCR5 抗體,PE/CY7-CD4 抗體在室溫下避光的條件下染色30 min,然后固定、滲透、Alexa/Fluor 647-IL-17A 染色。流式細胞儀檢測IL-17A+CD4+CD8-細胞的頻率。樣本均采用相同的抗體和方案,并對樣本進行盲法分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行Mann-Whitney-U非參數(shù)檢驗,獨立樣本t檢驗、秩和檢驗及Pearson 秩相關(guān)檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 IVD 患者外周血中T 細胞表達 兩組外周血CD4+T 細胞比率沒有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示),IVD組CD4+CD45RO+T 細胞比率(74.52%±2.229%)相對于對照組(52.99% ±1.645%)明顯升高(P=0.011)。見圖1。

圖1 兩組Th 細胞亞群表達水平

2.2 IVD 組Th17 細胞亞群 Th17(IL-17A+CD4+T)細胞的百分比〔(0.808±0.049)%〕及血清中IL-17A 濃度〔(5.072±0.196)pg/ml〕顯著高于對照組〔(0.515 ±0.021)%、(3.928 ±0.146) pg/ml;P＜0.001〕。見圖2。IVD 組CD45RO+Th17/Th17 細胞比率〔(86.12±2.787)%〕顯著高于對照組〔(78.61±2.157)%;P＜0.001〕。纖維環(huán)破裂組外周血中Th17細胞表達水平〔(0.906±0.058)%〕和纖維環(huán)完整組Th17 細胞的表達水平〔(0.611±0.039)%〕較對照組顯著增高(P＜0.001,P=0.02)。

圖2 兩組外周血Th17 細胞亞群及IL-17A 表達

3 討 論

IVD 發(fā)病機制及病程中免疫的失衡狀態(tài)被發(fā)現(xiàn),椎間盤由髓核及包繞髓核的纖維環(huán)和軟骨終板組成,椎間盤中的髓核常被認為人體的免疫赦免部位〔12〕。一旦椎間盤發(fā)生退變及損傷之后,髓核便暴露于機體的免疫系統(tǒng)之中,因此機體會產(chǎn)生抗原-抗體相關(guān)的免疫反應。Weiler 等〔13〕發(fā)現(xiàn)退變椎間盤組織中高表達IL-1β、IL-6、TNF-α 和IFN-γ 等多種炎癥細胞因子。CD4 淋巴細胞標志物和各種淋巴細胞產(chǎn)物的高表達狀態(tài)也在退變椎間盤組織中被發(fā)現(xiàn)。

活化的CD4+T 細胞分化為Th1 和Th2 兩個亞群。每個亞群都具有相互作用和細胞因子分泌的形式〔14〕。這種分類方法一直沿用到2005年,直到對產(chǎn)生IL-17A 的Th17 進行了描述〔15〕。Th17 細胞能夠產(chǎn)生大量的促炎細胞因子,包括IL-17A、TNF-α、IL-22 和IL-26。近年的科學研究證明Th17 淋巴細胞在炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用,包括類風濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病和多發(fā)性硬化癥〔3～6〕。IL-17 是一種促炎性細胞因子,主要由Th17 淋巴細胞在產(chǎn)生IL-23 后被激活而產(chǎn)生。IL-17 可以通過不同的信號通路促進炎癥反應,其中一些信號通路被干擾素(IFN)γ〔16〕等其他淋巴細胞產(chǎn)物調(diào)節(jié),從而促進其他細胞因子、蛋白酶、一氧化氮(NO)和前列腺素(PG)E2 的合成。鑒于突出的椎間盤組織激活免疫反應的理論基礎及在突出的椎間盤碎片中浸潤和活化的淋巴細胞的發(fā)現(xiàn),進一步探究Th17 淋巴細胞在IVD 發(fā)病機制中的潛在作用具有重要意義。

受到抗原激活后初始T 淋巴細胞(CD45RO-或CD45RA+)向活化和記憶T 淋巴細胞(CD45RO+)轉(zhuǎn)化〔17〕,本研究結(jié)果提示,升高的Th17 細胞可能參與IVD 發(fā)病機制。髓核組織與循環(huán)系統(tǒng)接觸導致淋巴細胞活化進而導致免疫反應及細胞因子的募集,Th17 細胞可以作為檢測腰椎退行性變疾病進展的一種生物學指標,或許成為治療腰椎退行性變疾病的新靶點。

研究發(fā)現(xiàn),IL-17A 在退變和疝出的IVD 手術(shù)組織中都有高水平的表達,IL-17A 促進NO 合酶和環(huán)氧化物酶(COX)-2 上調(diào)、NO 和PGE2 產(chǎn)生及IL-6釋放〔18〕。增多的CD4+IL-17A+、CD4+CCR6+細胞在IVD 中被發(fā)現(xiàn),同時Pene 等〔19〕研究也表明CD4+CCR6+可能是分泌IL-17 細胞因子的一個特征性細胞標志物。此外,Shamji 等〔20〕和Gabr 等〔21〕的研究支持了這一發(fā)現(xiàn),認為IL-17A 通過影響許多炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,在IVD 炎癥反應中起著重要作用。老年性腰椎退變一旦纖維環(huán)破裂,大量的CCL20 釋放出來,吸引外周血表達CCR6 的Th17 細胞。Th17 細胞經(jīng)趨化性轉(zhuǎn)移至病變部位后,在細胞通路誘導下分泌多種炎性細胞因子并與巨噬細胞及其他炎性細胞產(chǎn)生的細胞因子形成炎癥環(huán)境。從而增強巨噬細胞的募集進而導致髓核組織吸收和以坐骨神經(jīng)痛為表現(xiàn)的不良炎癥性周圍神經(jīng)病變。