付豪永 王月田 孫浩林 (北京大學第一醫(yī)院骨科,北京 100034)

終板炎(Modic)改變是老年人下腰痛(LBP)最重要的原因之一。LBP 導致全球疾病勞力喪失,成為世界范圍內主要健康負擔〔1,2〕。LBP 發(fā)病因素復雜多樣,但其主要為多因素共同作用的結果。既往研究發(fā)現(xiàn),腰椎間盤退行性變是LBP 發(fā)生的原因之一〔3,4〕。但是目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn),Modic 也能夠引起LBP 改變,而且是中重度LBP 的主要原因之一。Modic 改變椎間盤中存在高水平的活性氧(ROS),它與許多年齡相關疾病的發(fā)病機制有關,包括椎間盤疾病(IVDD)。髓核細胞中,氧化應激抑制細胞增殖,誘導過早衰老,并促進基質分解代謝加重退變。所以,ROS 可能作為Modic 改變發(fā)生發(fā)展的關鍵刺激因素。焦亡是炎性細胞死亡的過程,能夠誘導強烈的炎癥反應,使細胞腫脹,細胞破裂和促炎因子釋放,保護宿主免受病原微生物感染〔5〕。然而,焦亡過度激活會導致炎癥性疾病,如膿毒癥和自身免疫性疾病。在外界刺激存在時,經(jīng)典途徑對病原體相關分子模式(PAMPs)和損傷相關分子模式(DAMP)作出反應〔6,7〕。然后,外界刺激會促使模式識別受體(PRR)招募凋亡相關斑點蛋白,其含有CARD C 端招募域(ASC)的接頭蛋白并激活效應器半胱氨酸天冬氨酸前體(pro-caspase)-1,形成炎癥小體復合物。隨著pro-caspase-1 成熟為Caspase-1,引起GSDMD-N 末端的暴露形成細胞膜孔,使細胞內合成的白細胞介素(IL)-1β 和IL-18 炎癥因子通過細胞膜孔釋放至細胞外,引起炎癥反應的發(fā)生〔8,9〕。鑒于焦亡在下腰痛伴Modic 改變椎間盤中存在以下幾個問題:尚無確切報道;Modic 改變中高ROS 水平是否會引起炎癥反應和焦亡,三者之間的關系如何。因此,本文將驗證髓核細胞內ROS、焦亡、炎癥之間的關系。

1 材料與方法

1.1 髓核組織標本收集及納入、排出標準 納入的髓核組織樣本來源于北京大學第一醫(yī)院住院患者,均來自本課題組經(jīng)椎間孔鏡(PELD)隊列。在研究開展前,每名捐贈髓核組織的患者均簽署知情同意書, 并且本研究已通過倫理委員會審批(No.2020417)。納入標準:①根據(jù)術前影像學資料,診斷為腰椎間盤突出癥,腰椎管狹窄癥,退變性腰椎滑脫癥,腰椎退變性側彎且Pfirrmann 分級Ⅲ～Ⅴ級,磁共振影像顯示伴有(Modic 組13 例)或不伴有Modic 改變的患者(對照組14 例);②年齡40～70 歲,性別不限。排除標準:①合并腫瘤疾病,傳染病,如脊柱結核感染等;②拒絕參加本研究;③既往有脊柱手術病史。對照組男8 例,女6 例,平均年齡(55.26±7.39)歲;Modic 組男8 例,女5 例,平均年齡(58.40±8.02)歲。兩組性別、年齡基線資料無顯著差異(P＞0.05)。

1.2 髓核組織免疫組化染色 通過免疫組化染色法檢測Modic 組,對照組椎間盤內ASC 蛋白表達差異,方法如下:分離髓核組織:手術室所取標本在超凈臺中用磷酸緩沖液(PBS)反復沖洗,洗盡血漬。加入4%多聚甲醛覆蓋整個髓核組織,4℃過夜。切片機將蠟塊切割為5 μm 的薄片,用溫水使其平整,覆蓋于玻璃片上,用烤箱烘干備用。系列處理后,封片后觀察結果。

1.3 Modic 髓核檢測ROS 將對數(shù)期髓核細胞1×105接種至共聚焦培養(yǎng)皿中,加入8% FBS/F12 培養(yǎng)基,放入孵箱中培養(yǎng)。待髓核細胞貼壁后,加入2 ml DCFH-DA 工作液,37℃孵箱孵育30 min。加入2 ml Hochest33258 染液,37℃孵箱繼續(xù)孵育30 min。上機進行熒光檢測。

1.4 大鼠髓核細胞的提取 酒精噴布大鼠尾部消毒,獲取整根大鼠尾部。用手術刀在大鼠尾部皮膚縱向切開,借助紗布沿切口剝離大鼠尾部皮膚,兩手持椎間盤兩側椎體,用力向不同方向擠壓針刺的破口椎間盤,將白色凝膠狀髓核擠出。并加入2% Ⅱ型膠原酶1.5 h 后,完全培養(yǎng)基終止消化,得到單細胞懸液,進行髓核細胞培養(yǎng)。

1.5 髓核細胞乳酸脫氫酶(LDH)檢測細胞活力在96 孔板內接種1×104個/孔,共100 μl,在孵箱內37℃,5% CO2培養(yǎng)24 h 貼壁。吸除培養(yǎng)基,加入不同濃度H2O2100 μl 在孵箱內孵育3 h。每孔加入10 μl LDH 液。細胞孵箱內繼續(xù)孵育2 h。取出96 孔板,用酶標儀檢測吸光值。

1.6 掃描電鏡觀察髓核細胞膜結構 利用不同濃度H2O2處理10 cm 皿P3 代髓核細胞,后將0.05%胰酶加入至培養(yǎng)皿中,將細胞消化為細胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄上清液。吸取1 ml 戊二醛固定液,沿離心管壁輕輕滴加覆蓋樣品,固定過夜。使用不同濃度的乙醇使樣品脫水,在CO2臨界點烘干機中干燥。用雙面導電膠帶把樣品黏附于上樣臺中,離子濺射后通過電子顯微鏡觀察拍照。

1.7 免疫熒光檢測髓核細胞氧化應激模型Hochest33258/PI 雙染 加入2 ml Hochest33258,37℃,5% CO2孵箱培養(yǎng)30 min。用535 nm 激發(fā)波長,615 nm 發(fā)射波長的濾光器的熒光顯微鏡觀察細胞。

1.8 生物信息學分析胞外刺激對髓核細胞表觀遺傳學影響 在Pubmed 網(wǎng)站檢索GSE42611 數(shù)據(jù)集,將數(shù)據(jù)集內兩組不同處理方式的細胞樣品進行分組,進入G2R 分析差異基因。將獲得的差異基因整理為Excel 形式,按照FDR-校正P＜0.01 并且差異倍數(shù)(FC)＜-1 或＞1 對差異基因進一步篩選,進行基因本體論數(shù)據(jù)庫(GO)與京都基因和基因組百科全書(KEGG)的分析。GO 富集分析,涵蓋生物學三大層次,如細胞組分(CC),分子功能(MF),生物過程(BP)。KEGG 分析,涵蓋細胞生化過程,如代謝、膜轉運、信號傳遞、酶反應等,將差異基因與生物在線基因組數(shù)據(jù)庫內基因集進行比對。

1.9 Western 印跡 從4℃冰箱中取出預制膠,用電泳液清洗干凈,將玻璃板安裝至電泳槽內,加入預制膠電泳液,使其充滿于兩板之間。各泳道依次加入樣品蛋白及蛋白預染液。取相應長寬的聚偏氟乙烯(PVDF)膜,并將其放入甲醇中活化1 min,取出放入電轉液中30 min。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測髓核細胞氧化應激模型IL-18 合成與分泌 過氧化氫母液10 mmol/L 成不同濃度的 H2O2。每孔按照1×105個/ml接種至96 孔板,加入不同濃度H2O2處理3 h。檢測不同濃度過氧化氫刺激髓核細胞后合成和分泌IL-18 的情況,具體步驟同說明書。

1.11 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0 軟件進行t檢驗或單因素方差分析,GraphPad Prism9.0 繪制圖片。

2 結 果

2.1 兩組術前腰椎功能及疼痛程度視覺模擬評分(VAS) 術前磁共振影像學見圖1。Modic 組腰部VAS〔(5.60±2.66)分〕顯著高于對照組〔(3.50±2.25)分,P＜0.05〕。

圖1 Modic 組不同核磁加權象

2.2 Modic 改變椎間盤標本HE 染色病理學觀察相比對照組,Modic 組切片組織完整性較差,髓核細胞核漲大,細胞質內容物含量較多,有明顯的形態(tài)學改變,提示Modic 改變髓核細胞的通透性可能發(fā)生改變。見圖2。

圖2 Modic 改變椎間盤標本(HE 染色,×10)

2.3 Modic 改變臨床組織標本焦亡的Western 印跡和實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測 依據(jù)經(jīng)典Modic 改變影像學診斷指標和Pfirrmann 分類標準,納入分級為Ⅳ級伴或不伴Modic 改變組織進行髓核組織切片,行免疫組化ASC、CD3+、CD8+蛋白染色如圖3 所示,箭頭表示兩組各蛋白染色的陽性細胞,Modic 組炎癥和焦亡相關蛋白均高于對照組。與對照組比較,Modic 組焦亡相關ASC 蛋白含量較高,炎癥相關蛋白CD3+,CD8+顯著升高。Modic 組髓核組織中NLRP3 表達量(0.72±0.14)較對照組(0.36±0.14)明顯增加(P＜0.05)。見圖4。用10 例患者行生物學重復,qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)與對照組(1.00±0.00、1.00±0.00)比較,ASC(7.52±3.21)、IL-1β mRNA 表達量(1.98±0.26)在Modic 組顯著增加(P＜0.05)。

圖3 兩組焦亡相關蛋白(免疫組化染色,×10)

圖4 Western 印跡檢測兩組NLRP3 蛋白表達

2.4 Modic 改變臨床標本ROS 含量 與對照組相比,Modic 組免疫熒光顯示細胞內ROS 水平更高。見圖5。因此,在Modic 改變中可能存在調節(jié)ROS水平并起到平衡作用機制的功能基因或通路。

圖5 免疫熒光比較不同組間ROS 水平(×100)

2.5 處理后細胞活力檢測和胞外LDH 釋放檢測3 次平行試驗檢測胞外LDH 釋放發(fā)現(xiàn),當H2O2濃度在400 μmol/L(吸光值0.16±0.27)和500 μmol/L(吸光值0.5 ± 0.15)時,相較于0 μmol/L(吸光值-0.17±0.16),細胞膜完整性受到嚴重破壞,大量LDH 從細胞內釋放,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。100、200、300 μmol/L H2O2處理后LDH 釋放吸光值分別為-0.10±0.12、0.11±0.08、-0.03±0.25。

2.6 髓核細胞焦亡形態(tài)學特征 0、400、500 μmol/L濃度H2O2處理髓核細胞3 h,掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),0 μmol/L處理的髓核細胞,細胞膜完整,而400、500 μmol/L 處理的細胞膜出現(xiàn)較多孔隙,同時細胞膜周圍出現(xiàn)大量空泡。見圖6。

圖6 倒置顯微鏡掃描電鏡觀察不同濃度H2O2 處理髓核細胞3 h 焦亡形態(tài)

2.7 氧化應激模型髓核細胞PI 陽性率檢測 當400 μmol/L 及以上H2O2處理時髓核細胞PI 染色陽性細胞增多。見圖7。

圖7 髓核氧化應激模型免疫熒光檢測PI 陽性細胞(×100)

2.8 生物信息學分析胞外刺激對髓核細胞表觀遺傳學影響 GO 條目明顯富集于“對氧水平反應”,“細胞因子調節(jié)”“IL-1 反應”“正向調控細胞死亡”,受到胞外刺激與髓核細胞活性氧水平顯著相關。同時,髓核細胞與IL-1 及細胞內其他炎癥因子產生也存在顯著功能富集。胞外刺激對髓核細胞本身發(fā)生凋亡、鐵死亡等細胞死亡顯著富集。KEGG 通路明顯富集于“PI3K-AKT 信號通路”“TNF 信號通路”“NOD 樣受體信號通路”“細胞因子受體相互作用”相關通路。其中PI3K-AKT 能夠調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等細胞表型。TNF、NOD 樣受體通路與細胞的炎癥等表型相關。見圖8。

圖8 生物信息學GEO 數(shù)據(jù)庫分析胞外刺激對髓核細胞表觀遺傳學影響

2.9 ELISA 檢測氧化應激模型IL-18 水平改變 氧化應激后髓核細胞釋放至胞外的IL-18 水平在300、500 μmol/L H2O2刺激時顯著升高(P＜0.05,P＜0.001);實驗結果表示氧化應激后髓核細胞內合成的IL-18 水平在300、400、500 μmol/L H2O2刺激時顯著升高(P＜0.05,P＜0.001)。見表1。

表1 ELISA 檢測不同濃度H2O2 刺激時髓核細胞氧化應激炎癥因子改變(±s,pg/ml,n=3)

表1 ELISA 檢測不同濃度H2O2 刺激時髓核細胞氧化應激炎癥因子改變(±s,pg/ml,n=3)

與0 μmol/L H2O2 比較:1)P＜0.05,2)P＜0.001

指標0 μmol/L300 μmol/L400 μmol/L500 μ mol/L IL-18 合成23.96±1.7628.01±2.181)32.43±0.972)34.41±0.162)IL-18 釋放30.18±3.1333.87±1.281)32.97±0.5444.41±2.722)

3 討 論

下腰痛作為世界上最嚴重的致殘性疾病之一,會對老年人造成嚴重的不良后果,不僅增加醫(yī)療負擔也使患者損失工作能力〔10〕。有研究報道LBP 的發(fā)病因素復雜多樣,其中椎間盤發(fā)生Modic 改變是一個重要因素〔11,12〕。通過研究,發(fā)現(xiàn)Modic 改變中存在氧化應激狀態(tài)。同時,根據(jù)既往研究報道,亞細胞毒性濃度的H2O2可以增加細胞內ROS 水平,激活應激相關通路。同時,退變椎間盤中羧甲基賴氨酸的存在表明氧化應激也可能是導致椎間盤退變的一個因素。因此基于研究結果和現(xiàn)有文獻報道,做出假設ROS 可能是存在于Modic 改變椎間盤內刺激因素之一。基于Modic 改變髓核細胞內高ROS水平,炎癥相關蛋白高表達,認為Modic 改變患者下腰痛可能與炎癥相關。為了進一步驗證ROS 水平升高與髓核細胞發(fā)生炎癥反應和焦亡的關系,本研究利用H2O2刺激椎間盤髓核細胞,以構建高ROS水平的氧化應激細胞模型。通過免疫熒光檢測不同濃度H2O2處理后,髓核細胞內ROS 水平,發(fā)現(xiàn)400 μmol/L,500 μmol/L 均能過有效提高細胞內活性氧水平,且細胞活力有保證。根據(jù)既往研究報道焦亡有三大特征〔13〕,如細胞膜孔形成、細胞脹大溶解和細胞內容物釋放。本研究利用掃描電鏡對細胞膜進一步深入觀察,發(fā)現(xiàn)處理后的髓核細胞比對照組有更多的“膜孔”,膜孔的增加為椎間盤髓核細胞焦亡的發(fā)生提供有力證據(jù)。

為定量準確的驗證處理后的椎間盤髓核細胞的細胞膜完整性發(fā)生損害,本研究檢測了LDH 的細胞外釋放量。細胞生物學中可知,細胞膜結構的破壞會導致細胞質內的酶釋放到培養(yǎng)液里,其中包括酶活性較為穩(wěn)定的LDH,通過檢測從質膜破裂細胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH 的活性,就可以定性的反應細胞膜完整性,是膜完整性的重要指標〔14〕。

為了得到生物信息學方面的多層次認證,本研究通過挖掘GEO 發(fā)現(xiàn),類似于胞外ROS 刺激的其他外界刺激如TNF-α 和IL-1β 對椎間盤髓核細胞干預,顯著富集椎間盤髓核細胞內活性氧水平條目和炎癥因子產生等條目,而炎癥因子的產生是焦亡的一大特征〔15〕。最重要的是,該基因集明顯富集于多種調控性細胞死亡如凋亡、焦亡、鐵死亡等,為本研究在生物信息學層面提供支持。綜上,椎間盤髓核細胞內ROS 水平升高,會導致髓核細胞焦亡和炎癥狀態(tài)的發(fā)生。