裴翔 劉丹 歐陽茹 黎俊森 陳鉛琴 孫軍萍 孫加鳳 黎宗保 張麗(海南省第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,海南 三亞 572000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病引起的一種進展性微血管并發(fā)癥,是慢性腎病(CKD)和終末期腎病(ESRD)的主要病因之一〔1〕。目前DN 發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不明確,但越來越多的證據(jù)表明線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂可能是重要因素之一〔2～4〕。線粒體質(zhì)量控制是機體為了確保線粒體功能的相對穩(wěn)定,形成的以維持線粒體數(shù)目、形態(tài)及功能的特定機制,其中包括線粒體的生物合成、融合與分裂及線粒體自噬〔5〕。以上過程出現(xiàn)任何異常有可能影響線粒體的功能,從而導致細胞的損傷、凋亡或死亡。線粒體融合促使線粒體形成長管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),有助于受損線粒體的修復,線粒體融合蛋白(MFN)及視神經(jīng)萎縮蛋白(OPA)參與調(diào)控線粒體融合。與線粒體融合相對應(yīng),線粒體分裂使其由長管網(wǎng)絡(luò)狀向短片狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,促進線粒體的降解過程,動力相關(guān)蛋白(Drp)-1 與位于線粒體外膜的線粒體分裂因子(MFF)受體結(jié)合后介導線粒體的分裂。線粒體自噬是細胞及時清除損傷、衰老或過剩線粒體的機制,對正常線粒體的穩(wěn)定及活動維持具有重要意義,PTEN 誘導假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)通路是目前較為公認的介導線粒體自噬的途徑之一,人微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)-3Ⅱ蛋白常被用作自噬形成的標志〔6〕。

黃芪甲苷(AS-Ⅳ)是羊毛脂醇型四環(huán)三萜皂苷,是黃芪的主要活性成分之一,極性較高,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗細胞凋亡等作用,并在對DN 的保護作用上得到廣泛的認可〔7～9〕,但其作用機制目前尚未闡明。本研究基于線粒體質(zhì)量控制過程中相關(guān)蛋白的調(diào)控研究AS-Ⅳ對DN 小鼠腎臟的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級2 型糖尿病模型C57BL/KSJ-db/db 小鼠,雄性,20 只,8 周齡;SPF 級非糖尿病性C57BL/KSJ-db/m 小鼠,雄性,10 只,8 周齡;均由南京大學模型動物研究中心提供。本實驗獲得動物倫理委員會批準。

1.2 藥物、主要試劑和儀器 AS-Ⅳ(純度≥98%)購于上海醫(yī)藥發(fā)展有限公司。應(yīng)用Accu-Chek 性能血糖監(jiān)測系統(tǒng)(Roche,德國)從小鼠尾部采集的血液樣品中測定其血糖水平。過碘酸雪夫(PAS)染色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。應(yīng)用小鼠白蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量裝置(Bethyl 實驗室,美國) 測量24 h 尿蛋白濃度。Drp-1、MFF、OPA、MFN、PINK1、Parkin、LC-3 Ⅱ抗體購于Santa Cruz 公司。

1.3 動物模型及分組 C57BL/KSJ-db/db 小鼠20只適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w 后,每周監(jiān)測小鼠空腹血糖及體質(zhì)量,當血糖＞16.7 mmol/L,尿蛋白高于對照組,即確認DN 小鼠造模成功〔7〕。選取造模成功的小鼠,采用隨機數(shù)字表法分為DN 組和AS-Ⅳ組,AS-Ⅳ組小鼠以0.2 g/kg AS-Ⅳ每日進行灌胃飼養(yǎng),DN 組繼續(xù)以標準飼料喂養(yǎng);對照組為C57BL/KSJ-db/m 小鼠,同樣以標準飼料喂養(yǎng),每組6 只。

1.4 標本采集 造模12 w 后,在代謝籠中收集3組小鼠24 h 尿液,而后對小鼠進行注射麻醉,眼球取血并脫頸處死,迅速采集小鼠雙側(cè)腎臟,稱重并計算腎重指數(shù)(KI),KI=雙側(cè)腎臟質(zhì)量/小鼠體重×100%。稱重后將左腎置于4%多聚甲醛溶液中固定,待進行病理檢查;右腎置于-80℃冷凍。離心出血清后采用Roche 全自動生化儀檢測血肌酐及血尿素氮,應(yīng)用ELISA 檢測尿液中的24 h 蛋白含量。

1.5 形態(tài)學檢測 取固定后的腎臟組織在分級濃度乙醇中脫水,包埋于石蠟中,切成4 μm 厚片,應(yīng)用PAS 染色以評價兩組小鼠腎小球及腎小管的病理變化。由一位具有10年以上診斷經(jīng)驗的病理醫(yī)師在雙盲條件下觀察每只小鼠的至少20 個腎小球和50 個近端小管(每組6 只),采用NIS-Elements Basic Research 軟件定量分析小鼠腎小球系膜基質(zhì)分數(shù)(系膜基質(zhì)面積/腎小球面積×100%)及近端腎小管面積。

1.6 Western 印跡法檢測 將冷凍的腎皮質(zhì)在干冰下切成塊,在含有蛋白酶抑制劑的裂解液中均漿,離心取上清,應(yīng)用Bradford 蛋白測定法測量蛋白濃度。樣品在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h 后,將膜與一級抗體孵育,稀釋濃度為Drp-1(1 ∶1 000)、MFF(1 ∶1 000)、OPA(1 ∶1 000)、MFN(1 ∶1 000)、PINK1(1 ∶500)、Parkin(1 ∶1 000)、LC-3Ⅱ(1 ∶500),4℃過夜,而后將膜與相應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)二級抗體孵育1 h,超敏發(fā)光液顯色,凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶,ImageJ 計算條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0 軟件進行單因素方差檢驗、SNK-q檢驗、t檢驗、配對t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 3組體重、血糖及KI 的比較 3 組造模12 w后體重均顯著增加,DN 組體重與對照組及AS-Ⅳ組相比顯著升高(P＜0.05),AS-Ⅳ組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。對照組與AS-Ⅳ組治療前后血糖并無明顯變化(P＞0.05),而DN 組血糖顯著升高,且明顯高于對照組及AS-Ⅳ組(P＜0.05)。DN 組KI 與對照組相比顯著升高(P＜0.05),與AS-Ⅳ組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 3 組體重、血糖及腎重指數(shù)、腎功能指標的比較(±s,n=6)

表1 3 組體重、血糖及腎重指數(shù)、腎功能指標的比較(±s,n=6)

與對照組比較:1)P＜0.05;與DN 組比較:2)P＜0.05;與治療前比較:3)P＜0.05;下表同

組別體重(g)血糖(mmol/L)治療前治療后治療前治療后KI(%)血肌酐(μmol/L)血尿素氮(mmol/L)24 h 尿蛋白(mg/L)對照組25.5±0.1333.92±1.643)6.13±0.576.17±0.4911.07±0.6613.79±0.911 4.13±2.5111.03±0.74 DN 組28.9±0.97 40.53±1.471)3) 19.37±1.90 28.50±1.841)3) 23.75±3.581) 16.33±2.581) 19.28±3.021) 40.53±2.391)AS-Ⅳ組28.2±1.10 34.20±2.332)3) 20.00±1.4417.59±2.032)19.13±1.8914.02±1.202) 15.59±2.972) 29.01±2.222)

2.2 3組腎功能指標的比較 DN 組與對照組相比較,血肌酐、血尿素氮及24 h 尿蛋白均顯著升高(P＜0.05),而AS-Ⅳ組相較于DN 組均顯著降低(P＜0.05)。見表1。

2.3 3組腎臟組織形態(tài)學比較 對照組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)基本正常,DN 組腎小球細胞肥大,系膜擴張,腎小球及腎小管系膜基質(zhì)明顯增厚,胞質(zhì)內(nèi)糖原增多(箭頭所示)。見圖1。與DN 組相比較,AS-Ⅳ組肥大的腎小球得到顯著改善,腎小球系膜基質(zhì)分數(shù)及近端腎小管面積均下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

圖1 3 組腎臟組織PAS 染色(×400)

表2 3 組腎小球系膜基質(zhì)分數(shù)、近端腎小管面積比較(±s,n=6)

表2 3 組腎小球系膜基質(zhì)分數(shù)、近端腎小管面積比較(±s,n=6)

組別腎小球系膜基質(zhì)分數(shù)(%)近端腎小管面積(μm2)8.23±1.41 126±129 DN 組13.25±2.11)1 278±1461)AS-Ⅳ組9.87±1.82)1 089±852)對照組

2.4 3組腎臟組織中線粒體質(zhì)量控制相關(guān)蛋白表達水平的比較 與對照組相比較,DN 組腎臟組織中OPA、Mfn、PINK1、Parkin、LC-3 Ⅱ蛋白表達量降低,Drp-1、MFF 蛋白表達量升高,其中Drp-1、OPA、PINK1、LC-3Ⅱ蛋白表達量差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與DN 組相比,AS-Ⅳ組腎臟組織中Drp-1、MFF、Mfn 蛋白表達量降低,OPA、PINK1、Parkin、LC-3Ⅱ蛋白表達量升高,其中Drp-1 及LC-3 Ⅱ蛋白表達量差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖2、表3。

圖2 3 組腎臟組織線粒體質(zhì)量控制相關(guān)蛋白表達

表3 3 組腎臟組織線粒體質(zhì)量控制相關(guān)蛋白表達的比較(±s,n=6)

表3 3 組腎臟組織線粒體質(zhì)量控制相關(guān)蛋白表達的比較(±s,n=6)

組別Drp-1MFFOPAMfnPINK1ParkinLC-3Ⅱ8±0.341.02±0.141.23±0.14 DN 組2.33±0.21)1.24±0.251.37±0.151)2.12±0.30.81±0.171)0.95±0.150.65±0.31)AS-Ⅳ組0.91±0.32)1.17±0.291.46±0.382.07±0.411.02±0.31.03±0.180.94±0.22)對照組0.83±0.210.98±0.172.55±0.142.44±0.151.6

3 討 論

AS-Ⅳ對DN 引起的腎臟損傷具有一定的保護作用已被證實〔10〕,本研究驗證了AS-Ⅳ對于由2 型糖尿病引發(fā)的DN 損傷具有一定的保護及治療作用;PAS 染色結(jié)果也證實在經(jīng)過AS-Ⅳ治療后的小鼠腎臟組織,腎小球及腎小管病理變化程度均較DN 組有所緩解。

有研究表明,當腎臟細胞線粒體損傷時,線粒體進行過度分裂并發(fā)生去極化,導致其失去功能〔11〕。本研究結(jié)果提示,AS-Ⅳ對糖尿病腎臟細胞的保護作用可能與抑制線粒體的過度分裂有關(guān)。高糖會導致腎小管細胞自噬功能的下降及自噬體清除能力的減低,這與DN 的發(fā)病機制可能有密切的關(guān)系〔12,13〕。在CKD 中,線粒體自噬水平以降低為主,而自噬水平的升高對多種腎臟疾病具有保護作用〔14〕,PINK1/Parkin 信號通路是介導線粒體自噬的主要途徑,當線粒體受損時,PINK1 堆積在線粒體外膜同時磷酸化泛素及E3 泛素連接酶Parkin,Parkin 通過聯(lián)合LC3Ⅱ,將泛素化線粒體傳遞入自噬小體,形成線粒體自噬〔15〕。LC3Ⅱ是自噬體形成的關(guān)鍵蛋白,是評價自噬水平的指標,自噬增強可導致LC3Ⅱ上調(diào)。本研究結(jié)果表明,線粒體自噬水平升高,起到保護腎臟細胞受損的作用,PINK1 及Parkin 蛋白表達亦均有上升趨勢,提示AS-Ⅳ有可能通過增強PINK1/Parkin 信號通路,從而介導更多自噬小體的形成,除此之外,是否還有其他介導自噬的途徑參與其中,則需進一步研究證實。