李清瀚 王大麟 王海濤 (北華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林 132000)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)主要病癥是膝關(guān)節(jié)處的軟骨組織出現(xiàn)退行性病變及膝關(guān)節(jié)周圍出現(xiàn)骨質(zhì)增生的現(xiàn)象〔1,2〕。KOA 的發(fā)病率較高,多發(fā)于中老年人,有研究顯示,近些年KOA 的發(fā)病趨勢(shì)呈現(xiàn)逐年上升〔3〕。目前關(guān)于KOA 的發(fā)病尚未完全闡明,關(guān)節(jié)軟骨的損傷是不可逆的,藥物或手術(shù)治療均不能值KOA 的進(jìn)展,因此,對(duì)于KOA 的治療大多在于緩解炎癥反應(yīng),改善關(guān)節(jié)功能,從而延緩疾病進(jìn)展〔4,5〕。羥基紅花黃色素(HSY)A 可以使過(guò)氧化氫引起的氧化脅迫狀態(tài)得到有效的改善,還能夠起到保護(hù)細(xì)胞及減輕氧化損傷的作用。具有抗炎活性〔6〕。本研究分析HSYA 對(duì)老齡KOA 的干預(yù)作用,明確HSYA 與KOA 的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 一般資料 選取18～21月齡SD 大鼠60 只,平均(18.53±1.42)月齡,體重450～520 g,平均體重(460.75±33.25)g,購(gòu)自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2020-0055,使用許可證號(hào):SYXK(粵)2020-0242,雌雄各半,SD 大鼠均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠,明暗周期12/12 h,相對(duì)濕度45%～50%,溫度18～24℃,不間斷供給水、食物,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.2 分組與建模 在60 只大鼠中隨機(jī)選取12 只作為正常組,其余大鼠均參照改良Hulth 法造模〔7〕,術(shù)前對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉,麻醉藥物采用10%水合氯醛(300 mg/kg),將大鼠固定成呈仰臥位,做右下膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)1 cm 左右入刀,離斷摘除前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)半月板,然后進(jìn)行髕骨復(fù)位,最后進(jìn)行止血包扎。為預(yù)防大鼠出現(xiàn)感染狀況,術(shù)后3 d 將青霉素20 萬(wàn)U/d 肌注到大鼠體內(nèi)。術(shù)后第5 天讓大鼠使用右下肢進(jìn)行活動(dòng),每次活動(dòng)時(shí)間為30 min,共干預(yù)4 w。干預(yù)4 w 后,隨機(jī)抽取造模大鼠4 只及正常組1 只,并采用脫頸法將其處死,對(duì)造模關(guān)節(jié)軟骨面進(jìn)行觀察,當(dāng)大鼠關(guān)節(jié)囊略有增生,關(guān)節(jié)滑液多呈淡黃色及關(guān)節(jié)軟骨表面略顯粗糙,符合早期KOA 樣改變,表示造模成功。

1.3 給藥干預(yù) 造模成功后,將手術(shù)造模成功44 只大鼠隨機(jī)分為模型組、HSYA 低劑量組、HSYA中劑量組、HSYA 高劑量組各11 只,HSYA 凍干粉購(gòu)自成都康邦生物科技有限公司,將0.9%氯化鈉注射液加入HSYA 中稀釋成0.5 mg/ml 的溶液。HSYA 低劑量組給予大鼠濃度為2.5 mg/kg 的HSYA,HSYA 中劑量組給予大鼠濃度為5.0 mg/kg HSYA,HSYA 高劑量組基于大鼠濃度為10.0 mg/kg HSYA,3 組均注射到大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔部位,均注射量為20 μl,1 次/w,連續(xù)給藥3 次,正常組及模型組每日各給予等量的生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。

1.4 病理形態(tài)學(xué)觀察 在喂養(yǎng)及給藥3 w 后,采用脫頸法將大鼠處死,消毒后,準(zhǔn)確剝?nèi)〈笫蟮挠覀?cè)脛骨平臺(tái)、股骨髁中及外側(cè)軟骨組織,迅速固定在4%的多聚甲醛溶液中,在常溫的環(huán)境下固定48 h,隨后流水沖洗數(shù)小時(shí),隨后對(duì)軟骨標(biāo)本進(jìn)行脫鈣處理。用生理鹽水對(duì)脫鈣后的軟骨組織進(jìn)行沖洗,乙醇脫水、浸蠟,石蠟包埋后進(jìn)行厚度為4 μm 切片,鋪片,蘇木素染色,流水沖洗,在此進(jìn)行乙醇脫水,在采用伊紅染色,最后利用濃度為100%的酒精進(jìn)行脫水處理,二甲苯透明,封片。

1.5 大鼠膝關(guān)節(jié)直徑及足趾容積測(cè)量 對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)及足趾容積,分別采用游標(biāo)卡尺,足趾容積儀進(jìn)行測(cè)量,在對(duì)其進(jìn)行對(duì)比。

1.6 炎癥因子檢測(cè) 取大鼠腹主動(dòng)脈血,4℃在環(huán)境下進(jìn)行2 000 r/min 的離心處理,離心20 min,半徑為6 cm,并將上清液保存在-20℃冰箱內(nèi)待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)炎癥因子的含量進(jìn)行檢測(cè),操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-13、MMP 抑制劑(TIMP)-1 檢測(cè) 應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行檢測(cè),取大鼠軟骨組織,剪碎,提取miRNA,具體操作參照試劑盒說(shuō)明書,測(cè)定濃度及純度后,將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa 寶生物工程有限公司,再以cDNA 為模板,加入相關(guān)試劑及引物后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,以GAPDH為內(nèi)參,引物序列:GAPDH 上游引物5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′,下游5′-TGAGCTTGACAAAGTGGTCG-3′,MMP-3 上游引物5′-GCAAATCCCTACTCAGAAG-3′,下游5′-TTTTCCAGTATCCTCCTCAG-3′,MMP-13 上游引物5′-TGACAGGCTCCGAGAAATG-3′,下游5′-CGTTGTATTCACCCACATCAG-3′,TIMP 上游引物5′-GCGTTATGAAATCAAGACCACCA-3′,下游5′-CGCAGTTGTCCAGCGATGAGA-3′,反應(yīng)條件為:95℃3 min,變性95℃12 s,退火62℃40 s,共40 個(gè)循環(huán),實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算MMP-1、MMP-13 和TIMP 的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 通路蛋白相對(duì)表達(dá) 取大鼠待測(cè)軟骨組織100 mg 按1 ∶5加入裂解液裂解、勻漿、提取總蛋白,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后,5%脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗(1 ∶300),孵育過(guò)夜。加入二抗(1 ∶5 000),常溫孵育2 h,顯影、定影、沖洗、晾干,置于凝膠圖像成像分析系統(tǒng),曝光各組蛋白條帶,拍照,計(jì)算各組蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)觀察 正常組軟骨細(xì)胞飽滿大小均一,排列整齊,表面平整,可見雙核結(jié)構(gòu),潮線清晰完整。模型組軟骨組織表面碎裂,軟骨細(xì)胞缺失,細(xì)胞核濃縮,軟骨細(xì)胞出現(xiàn)壞死。HSYA 低劑量組關(guān)節(jié)軟骨表層變薄,軟骨細(xì)胞出現(xiàn)缺失,表面出現(xiàn)裂隙,可清晰的看見軟骨細(xì)胞出現(xiàn)壞死。HSYA 中劑量組關(guān)節(jié)軟骨輕度變薄,軟骨存在小裂隙,多個(gè)軟骨細(xì)胞聚集。HSYA 高劑量組關(guān)節(jié)軟骨變薄,軟骨存在小裂隙,表層細(xì)胞形態(tài)接近于正常。見圖1。

圖1 各組軟骨組織學(xué)觀察(HE 染色,×200)

2.2 各組膝關(guān)節(jié)直徑及足趾容積比較 與正常組相比,模型組、HSYA 低、中、高劑量組膝關(guān)節(jié)直徑、足趾容積均明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比,HSYA 低、中、高劑量組膝關(guān)節(jié)直徑、足趾容積均明顯降低(P＜0.05),與HSYA 低劑量組相比,HSYA中、高劑量組膝關(guān)節(jié)直徑、足趾容積均明顯降低(P＜0.05)。與HSYA 中劑量組相比,HSYA 高劑量組膝關(guān)節(jié)直徑、足趾容積均明顯降低(P＜0.05)。見表1。

2.3 各組炎癥因子表達(dá)比較 與正常組相比,模型組、HSYA 低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17水平均明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比,HSYA低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 水平均明顯降低(P＜0.05),與HSYA 低劑量組相比,HSYA中、高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 水平均明顯降低(P＜0.05)。與HSYA 中劑量組相比,HSYA 高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 水平均明顯降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組膝關(guān)節(jié)直徑及足趾容積、炎癥因子表達(dá)比較(±s,n=11)

表1 各組膝關(guān)節(jié)直徑及足趾容積、炎癥因子表達(dá)比較(±s,n=11)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與HSYA 低劑量組比較:3)P＜0.05;與HSYA 中劑量組比較:4)P＜0.05;表2 同

組別膝關(guān)節(jié)直徑(mm)足趾容積(ml)IL-1β(ng/L)TNF-α(ng/L)IL-6(μg/L)IL-17(μg/L)1±0.0515.41±3.14模型組8.16±0.221)1.66±0.151)20.04±1.121)58.77±5.221)0.67±0.091)36.84±7.551)HSYA 低劑量組8.01±0.181)2)1.62±0.131)2)18.52±1.411)2)43.52±4.741)2)0.51±0071)2)30.71±6.841)2)HSYA 中劑量組7.94±0.161)2)3)1.52±0.101)2)3)13.42±1.371)2)3) 28.84±3.521)2)3)0.39±0.081)2)3)26.72±4.741)2)3)HSYA 高劑量組7.76±0.231)2)3)4) 1.47±0.091)2)3)4) 6.72±1.121)2)3)4) 15.52±3.251)2)3)4) 0.27±0.071)2)3)4) 17.54±2.151)2)3)4)F/P 值20.220/0.0017.316/0.00144.175/0.00147.1正常組7.16±0.111.41±0.086.04±1.115.16±2.170.2 75/0.00122.230/0.00113.038/0.001

2.4 各組信號(hào)核因子(NF)-κB 通路相對(duì)表達(dá)量比較 與正常組相比,模型組、HSYA 低、中、高劑量組核因子κB 抑制因子(IκB)α、NF-κB P65 表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比,HSYA 低、中、高劑量組IκBα、NF-κB P65 表達(dá)均明顯降低(P＜0.05),與HSYA 低劑量組相比,HSYA 中、高劑量組IκBα、NF-κB P65 表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)。與HSYA 中劑量組相比,HSYA 高劑量組IκBα、NF-κB P65 表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組軟骨中NF-κB 通路蛋白表達(dá)

2.5 各組關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表達(dá)對(duì)比 與正常組相比,模型組、HSYA 低、中、高劑量組MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比,HSYA 低、中、高劑量組MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表達(dá)均明顯降低(P＜0.05),與HSYA 低劑量組相比,HSYA 中、高劑量組MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)。與HSYA 中劑量組相比,HSYA 高劑量組MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)。見表2。

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、MMP-13、TIMP-1、信號(hào)NF-κB 通路表達(dá)對(duì)比(±s,n=11)

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、MMP-13、TIMP-1、信號(hào)NF-κB 通路表達(dá)對(duì)比(±s,n=11)

組別MMP-3MMP-13TIMP-1IκBαNF-κ B P65正常組25.42±7.1727.53±4.5216.47±4.081.00±0.011.00±0.01模型組78.24±10.211)81.61±5.721)30.62±4.151)2.53±0.331)2.24±0.391)HSYA 低劑量組61.58±6.571)2)66.67±5.141)2)27.52±5.331)2)2.08±0.241)2)2.02±0.311)2)HSYA 中劑量組41.74±8.831)2)3)47.78±5.881)2)3)23.57±4.581)2)3)1.82±0.171)2)3)1.68±0.251)2)3)HSYA 高劑量組33.14±7.251)2)3)4)35.74±5.691)2)3)4)19.57±4.691)2)3)4)1.34±0.131)2)3)4)1.24±0.151)2)3)4)F/P 值21.060/0.00136.900/0.00112.096/0.00123.055/0.00115.810/0.001

3 討 論

關(guān)節(jié)軟骨作為一種特殊的結(jié)締組織,其軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化率較低,因此軟骨損傷后自我修復(fù)能力較差。同時(shí),軟骨細(xì)胞更新及代謝過(guò)程極為復(fù)雜,由多種細(xì)胞因子參與完成。軟骨細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)降解是導(dǎo)致KOA 軟骨降低的主要因素〔8,9〕。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為KOA 屬“骨痹”范疇,其發(fā)病與肝、脾、腎虧損及風(fēng)、寒、濕、瘀血客于局部密切相關(guān)〔10〕。

HSYA 臨床在心血管疾病的治療中起重要作用,HSYA 具有抗感染作用〔11〕。有相關(guān)研究表明〔12〕,HSYA 能夠使LPS 得到有效抑制,進(jìn)而使TNF-α、IL-1β、IL-6 及其他炎癥因子的表達(dá)出現(xiàn)異常升高的狀態(tài)。HSYA 還可以使髓過(guò)氧化物酶及一氧化氮合酶的活性得到抑制,進(jìn)而緩解了腦組織中的浸潤(rùn)〔13,14〕。有研究顯示,當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)的凋亡及軟骨祖細(xì)胞出現(xiàn)遷移障礙時(shí),其主要原因是因?yàn)殛P(guān)節(jié)軟骨組織中分泌的MMP-1、MMP-13 表達(dá)呈現(xiàn)異常升高的狀態(tài),進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨無(wú)法再生。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),HSYA 可使KOA 大鼠體內(nèi)MMP-1、MMP-13 表達(dá)降低,從而延緩疾病進(jìn)程。

KOA 發(fā)病與炎癥因子之間存在著密切的相關(guān)性,關(guān)節(jié)軟骨合成蛋白多糖組分、蛋白糖胺聚糖及Ⅱ型膠原蛋白均會(huì)因TNF-α 與IL-6 協(xié)同而出現(xiàn)不同程度的影響,協(xié)同IL-1β 在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過(guò)程中起著決定性的作用,IL-1β 對(duì)關(guān)節(jié)軟細(xì)胞代謝及細(xì)胞外基質(zhì)有著顯著影響〔15,16〕。促進(jìn)MMPs 的分泌來(lái)破壞關(guān)節(jié)軟骨成分。本研究顯示,IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 在KOA 模型大鼠體內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá),HSYA 可減輕大鼠體內(nèi)炎癥因子表達(dá),修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷,抑制KOA 的發(fā)生進(jìn)展。

NF-κB 信號(hào)通路是體內(nèi)重要的炎癥通路,其與機(jī)體內(nèi)的炎癥產(chǎn)生和激活均有不同程度的相關(guān)性。在KOA 炎癥發(fā)生過(guò)程中NF-κB 是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄分子,對(duì)KOA 的各個(gè)階段均存在不同程度的影響。NF-κB 可以在生理狀態(tài)下和IκB 進(jìn)行結(jié)合,以復(fù)合物的狀態(tài)存在于機(jī)體內(nèi)〔17,18〕。NF-κB 活化的敏感標(biāo)志是IκB 蛋白的表達(dá),NF-κB P65、IκBα 分別為NF-κB、IκB 蛋白家族成員,二者可以使NF-κB 信號(hào)通路在膝關(guān)節(jié)骨中得到有效的抑制作用〔19,20〕。本研究結(jié)果表明NF-κB 通路激活,經(jīng)HSYA 干預(yù),NFκB P65、IκBα 在KOA 表達(dá)下調(diào),表明HSYA 可抑制NF-κB P65、IκBα 活性,從而改善KOA 臨床癥狀,減輕炎性反應(yīng)。

雖然本文認(rèn)為HSYA 具有改善KOA 的作用,其作用機(jī)制可能與炎癥反應(yīng)及NF-κB 通路有關(guān),但臨床并未有其他研究分析其關(guān)系,因此本研究所得結(jié)果還需后續(xù)研究驗(yàn)證,為KOA 的研究提供新方向。