劉雪飛 曹宏 杜捷( 白城醫(yī)學高等?？茖W校臨床醫(yī)學院,吉林 白城 7000; 吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院普外科; 白城中心醫(yī)院普外科)

宮頸癌在女性癌癥發(fā)病率中排名第4 位,且近年發(fā)病呈年輕化的趨勢〔1〕。宮頸癌從前期病變發(fā)展到原位癌,最終演變成浸潤癌,屬于一個量變與質(zhì)變的過程,更是造成患者死亡的主要死亡〔2〕。磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B/哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信號通路能夠被外界多種細胞所激活,參與在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中〔3〕。其中PI3K/AKT 通路在維持細胞惡性生物學特征中發(fā)揮重要作用,調(diào)控機體細胞增殖、凋亡中國具有重要作用〔4〕。AKT/mTOR 信號通路為腫瘤相關(guān)的重要信號通路,其活性出現(xiàn)增強,與較多的惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展具有密切聯(lián)系,具有門控分子的別稱〔5〕。miRNA 為一類經(jīng)過基因轉(zhuǎn)錄后,在調(diào)控過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的小分子RNA,其異常的表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著密切聯(lián)系〔6〕。本文選擇建立宮頸癌模型大鼠,在基于PI3K/AKT/mTOR 信號通路下,探究過表達miR-29b 干預作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取40 只SD 健康雌性大鼠,由上海斯萊克動物實驗中心提供,鼠齡8～11月齡,平均(9.5±1.2)月齡,體重219～246 g,平均(231.5±11.07)g。在相對濕度30%～36%、溫度(23.5±1.3)℃的環(huán)境下,進行喂養(yǎng)大鼠1 w,光照12 h/d。本文研究獲醫(yī)院倫理委員會批準。miR-29b 及PI3K、AKT、mTOR mRNA(Sigma 公司);人宮頸癌Hela 細胞及磷酸鹽緩沖液(PBS,Invitrogen 公司);AKT mRNA 抗體(Abcam 公司);糖類抗原(CA)125抗體(Millipore 公司);枸櫞酸緩沖液(Cell Signaling公司)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及鱗狀細胞癌抗原(SCC)抗體及蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天公司);流式細胞儀(美國AI 公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組 隨機選取10 只為正常組,不做任何處理。余下30 只建立宮頸癌大鼠模型。無菌環(huán)境下,在RPMI1640 培養(yǎng)基中放入人宮頸癌Hela 細胞,以37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培育24 h。后在對數(shù)生長期添加0.25%胰酶進行消化,后放置小牛血清培養(yǎng)基中,在消化過程終止后,以4℃、1 500 r/min進行10 min 離心處理,并充分洗滌,將細胞濃度調(diào)整為1×107/ml,使用移液槍吹勻后,將人宮頸癌Hela 細胞懸濁液進行抽取,在需要造模大鼠腋窩下進行注射,每只規(guī)格為0.5 ml,后回籠飼養(yǎng)7 d,當出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)為造模成功。其中隨機選取10 只大鼠為模型組,不做任何處理為模型組。余下20 只沉默miR-29b 組注射0.2 μl/g antago miR-29b,過表達miR-29b 組注射0.2 μl/g ago miR-29b。

1.2.2 HE 染色 對待測標本進行脫蠟、水化等處理之后,將其在0.01 mol/L、95℃的枸櫞酸緩沖液中浸泡,同時進行熱修復,以3% H2O2環(huán)境下培育10 min,滴入山羊血清,26℃環(huán)境中培養(yǎng)30 min,抽離封閉液、添加一抗,將其置于5℃的環(huán)境中過夜培養(yǎng),第2日置入二抗,在37℃恒溫箱中培養(yǎng)30 min,清洗后進行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、封片。

1.2.3 miR-29b 及PI3K、AKT、mTOR mRNA 檢測以RT-PCR 對miR-29b 及PI3K、AKT、mTOR mRNA 表達進行檢測,首先提取細胞總RNA,檢測其RNA 純度、含量,逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA,設(shè)計引物序列,采用2-ΔΔCt方法計算細胞間黏附分子(ICAM)-1 表達,PCR 引物以Primer Premier 6.0 軟件進行設(shè)計(Invitrogen 公司合成)。其中miR-29b上游引物5′-GCGCGCTAGCACCATTTG-3′、下游5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′;PI3K mRNA 上游引物 5′-TTGCTATGGCATCTTATTCGTAACGCA-3′、下游5′-GACTGCTTTGGAGCTGTTCTACTACTA-3′、AKT上游引物 5′-AGTCGTAACTCGTTAGGATGAGCTGTC-3′、下游5′-TCCTGAGTACTCTCGAGT-3′;mTOR mRNA 上游引物5′-CATCGTGCTGTTGG-GTGA-3′、下游5′-GTCCATCTTCTTGTCGAGGC-3′。

1.2.4 腫瘤體積、重量檢測 分別對造模成功的大鼠腫瘤體積、重量進行檢測,在采血后,對經(jīng)過麻醉處死后宮頸癌大鼠的腫瘤進行完整剝離,以游標卡尺對腫瘤的長徑a 與短徑b 進行測量,根據(jù)V=axb2/2 對腫瘤體積計算,使用稱重器測量腫瘤重量,均由同一人員操作進行。

1.2.5 CD3+、CD4+、CD8+檢測 在禁食12 h 后,將大鼠靜脈血3 ml 置入流式管內(nèi),將50 μl 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血及10 μl CD3+、CD4+、CD8+單抗加入其中,在避光孵育20 min 后,將2 ml 溶血素置入,繼續(xù)避光孵育20 min,以2 000 r/min、半徑為8 cm,進行離心處理10 min,去除上清,添加2 ml PBS 進行混勻,后離心處理去除上清,在加入2 ml PBS 重懸混勻后,使用流式細胞儀對外周血T 淋巴細胞亞群CD3+、CD4+及CD8+水平檢測。

1.2.6 CA125、VEGF 及SCC 水平檢測 免疫組化法檢測CA125、VEGF 及SCC 水平,以PBS 作為陰性對照,以CK19＞10 μg/L 為陽性判斷標準,當細胞膜或細胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色為CK19 染色陽性信號。將組織蠟塊進行石蠟切塊,將厚度切為4 μm,以常規(guī)脫蠟、脫水,進行抗原修復,除去離子水孵化,并滴加ICAM-1 為一抗,在4℃置放12 h,進行2 次PBS 清洗,同時滴加聚合梅輔助劑,在37℃下水浴,進行持續(xù)孵化,時間為20 min;2 次PBS 清洗,并進行滴加IgG 多聚體。在37℃下水浴,進行持續(xù)孵化,時間為30 min。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0 軟件進行F檢驗、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 HE 染色 如圖1 所示,HE 染色后,正常組細胞密度較高,且壞死較少,模型組細胞壞死多,細胞排列紊亂,沉默miR-29b 組壞死較多,細胞排列顯著紊亂,過表達miR-29b 組壞死細胞得到降低,細胞排列較為緊密。

圖1 各組宮頸癌組織HE 染色(×400)

2.2 腫瘤體積、瘤重及miR-29b 表達比較 與正常組相比,模型組、沉默miR-29b 組及過表達miR-29b組miR-29b 表達均明顯較低,與模型組相比,沉默miR-29b 組miR-29b 表達明顯較低,過表達miR-29b組明顯較高(均P＜0.05);與模型組相比,沉默miR-29b 組腫瘤體積與瘤重均明顯較高,過表達miR-29b組腫瘤體積與瘤重均明顯較低(P＜0.05)。見表1。

2.3 PI3K、AKT、mTOR mRNA 表達比較 與正常組相比,模型組、沉默miR-29b 組及過表達miR-29b組PI3K、AKT、mTOR mRNA 表達均明顯較高,與模型組相比,沉默miR-29b 組PI3K、AKT、mTOR mRNA 表達均明顯較高,過表達miR-29b 組PI3K、AKT、mTOR mRNA 表達均明顯較低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組腫瘤體積、瘤重、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA 表達比較(±s,n=10)

表1 各組腫瘤體積、瘤重、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA 表達比較(±s,n=10)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與沉默miR-29b 組比較:3)P＜0.05;下表同

組別腫瘤體積(mm3)瘤重(g)miR-29b 表達PI3K mRNAAKT mRNAmTOR mRNA正常組1.05±0.180.11±0.010.07±0.010.05±0.01模型組141.52±15.260.34±0.040.42±0.071)0.52±0.051)0.42±0.041)0.39±0.041)沉默miR-29b 組149.46±16.532)0.41±0.052)0.26±0.051)2)0.64±0.071)2)0.59±0.071)2)0.57±0.071)2)過表達miR-29b 組70.53±9.572)3)0.25±0.032)3)0.94±0.121)2)3) 0.32±0.041)2)3) 0.28±0.031)2)3) 0.26±0.021)2)3)--

2.4 CD3+、CD4+及CD8+指標水平比較 與正常組相比,模型組、沉默miR-29b 組及過表達miR-29b 組CD3+、CD4+指標水平均明顯較低、CD8+指標水平明顯較高(均P＜0.05);與模型組相比,沉默miR-29b組CD3+、CD4+指標水平均明顯較低、CD8+指標水平明顯較高,過表達miR-29b 組CD3+、CD4+指標水平均明顯較高、CD8+指標水平明顯較低(均P＜0.05)。見表2。

2.5 CA125、VEGF 及SCC 水平比較 與正常組相比,模型組、沉默miR-29b 組及過表達miR-29b 組CA125、VEGF 及SCC 水平均明顯較高(均P＜0.05);與模型組相比,沉默miR-29b 組CA125、VEGF 及SCC 水平均明顯較高,過表達miR-29b 組CA125、VEGF 及SCC 水平均明顯較低(P＜0.05)。見表2。

表2 各組CD3+、CD4+及CD8+、CA125、VEGF 及SCC 指標水平比較(±s,n=10)

表2 各組CD3+、CD4+及CD8+、CA125、VEGF 及SCC 指標水平比較(±s,n=10)

組別CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CA125(pg/ml)VEGF(ng/L)SCC(pg/ml)39.42±5.7234.36±4.58模型組25.84±4.261)21.35±3.451)43.57±4.391)74.51±3.261)105.28±10.391) 209.31±23.431)沉默miR-29b 組22.41±3.411)2)18.57±2.461)2)46.89±4.871)2)86.35±9.171)2) 129.33±13.571)2) 235.28±26.451)2)過表達miR-29b 組53.86±6.241)2)3) 51.23±5.711)2)3) 28.73±3.291)2)3) 42.46±5.281)2)3) 63.48±7.151)2)3) 96.73±14.781)2)3)正常組75.29±8.2368.47±7.8920.25±3.438.42±1.35

3 討 論

宮頸癌為高度惡性腫瘤之一,具有較高的死亡率〔7,8〕。關(guān)于宮頸癌的治療,通過進行手術(shù)、放化療等臨床治療手段,均能夠取得較好的效果,但長期的治療效果仍不能達到理想〔9〕。近年來,關(guān)于宮頸癌治療的研究主要集中在基因的靶向治療,尤其是microRNA。相關(guān)研究顯示,microRNA 的異常表達,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要聯(lián)系〔10〕。其中miR-29 作為一類抑癌基因,在惡性腫瘤中為低表達。miR-29b 作為具有代表性一種,能夠?qū)Π┘毎纳L與轉(zhuǎn)移發(fā)揮負性調(diào)控作用〔11〕。

miR-29b 出現(xiàn)于哺乳動物的細胞代謝蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)降解氨基酸分解過程中。其作為一種抑癌因子,能夠促進腫瘤細胞的凋亡、腫瘤基因DNA 甲基化的抑制,減少腫瘤增殖與增加化療敏感性,進而抑制腫瘤進展。相關(guān)研究顯示,在腫瘤細胞的調(diào)控分化、凋亡以及轉(zhuǎn)錄中,均有miR-29b 參與其中〔12〕。通過對腫瘤細胞殺傷,降低腫瘤體積及重量,從而改善機體免疫功能,提升患者生存率。腫瘤體積是病理學有效評價化學與生物治療腫瘤效應(yīng)的指標〔13〕。本文研究結(jié)果說明過表達miR-29b 對宮頸癌大鼠進行干預,能夠促進腫瘤細胞的凋亡。

PI3K 為細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,其能夠?qū)毎男菝摺⒃鲋?、癌變及凋亡進行調(diào)控〔14〕。AKT 屬于PI3K 下游基因,能夠因PI3K 正反饋進行調(diào)控。PI3K/AKT/mTOR 信號通路能夠被外界的多種細胞所激活,進而使得下游蛋白AKT 得到激活〔15〕。AKT 能促進腫瘤細胞的增殖抗凋亡及化療耐受的作用,現(xiàn)已被定義成癌基因〔16〕。mTOR 為AKT 下游底物的底物之一,氨基酸系列高度保守,當通過磷酸化的mTOR 將增強腫瘤細胞的生長及分化相關(guān)蛋白的表達,進而促進腫瘤的發(fā)生〔17〕。同時活化的mTOR 能夠抑制腫瘤細胞的自噬。本研究結(jié)果說明過表達miR-29b 對宮頸癌大鼠進行干預,能夠減少腫瘤增殖。

在宮頸癌小鼠中,出現(xiàn)局部的免疫失衡是導致出現(xiàn)癌癥的主要原因。相關(guān)研究顯示,在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中,免疫系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂在其中有著明顯參與〔18〕。因此,關(guān)于宮頸癌的治療,改善其免疫系統(tǒng)是關(guān)鍵。在免疫功能中,T 細胞是細胞免疫的重要效應(yīng)細胞〔19〕。當T 細胞亞群出現(xiàn)免疫失衡,往往意味著腫瘤標志物水平得到顯著升高。本研究結(jié)果說明過表達miR-29b 對宮頸癌大鼠進行干預,能夠提升宮頸癌大鼠免疫功能。

SCC 是診斷宮頸癌的可靠標志物之一,在鱗狀上皮細胞的癌細胞中分泌。當發(fā)生宮頸癌時,其水平會明顯升高〔20〕。CA125 屬于較為典型的一種高分子糖白,在體腔上皮組織細胞中較多分布,能夠顯著表達腫瘤性疾病,其強度遠高于非腫瘤疾病。相關(guān)研究顯示,在血清中CA125 能夠有效評價婦科腫瘤情況及術(shù)后復發(fā)情況〔21〕。腫瘤新生血管的生成是腫瘤生長的基礎(chǔ),在腫瘤血管的形成中VEGF 發(fā)揮重要作用,其水平的升高能夠顯著提升惡性腫瘤的體積增加〔22〕。本研究結(jié)果說明過表達miR-29b對宮頸癌大鼠進行干預,能夠減少腫瘤新生血管的生成,抑制宮頸癌病情的發(fā)展。

綜上,在PI3K/AKT/mTOR 信號通路下的宮頸癌大鼠,進行過表達miR-29b 干預,能夠顯著改善宮頸癌免疫功能,促進腫瘤細胞的凋亡,減少腫瘤增殖及腫瘤新生血管的生成,使宮頸癌病情得到控制。