賈海明 李英 白文輝 李宗龍( 青海紅十字醫(yī)院乳腺科,青海 西寧 80000;2 綿陽市第三人民醫(yī)院乳腺科)

據(jù)統(tǒng)計(jì),2018年全球乳腺癌新確診病例高達(dá)210 萬例,死亡病例達(dá)63 萬例〔1〕。雖然化療、放療和內(nèi)分泌治療在消除腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤生長(zhǎng)、減少乳腺癌復(fù)發(fā)方面表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì),但往往伴隨著較大的副作用和耐藥性。因此,尋找具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物可能為乳腺癌治療提供替代策略。蘇木是一種廣泛分布于東南亞的藥用植物,其心材入藥具有活血散瘀、祛風(fēng)止痛功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,蘇木提取液還可誘導(dǎo)胃癌、口腔癌、頭頸癌凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)〔2～4〕。然而蘇木提取液在乳腺癌中抗腫瘤作用鮮有報(bào)道。增殖細(xì)胞核抗原反義RNA(PCNA-AS)1 基因是最近發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼(lnc)RNA,有報(bào)道稱結(jié)直腸癌中PCNA-AS1 異常表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)及TNM 分期顯著相關(guān)〔5〕。PCNA-AS1 表達(dá)增加促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖〔6〕。然而,PCNA-AS1 在乳腺癌中的功能仍不清楚。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討蘇木提取液對(duì)乳腺癌細(xì)胞T-47D 增殖、凋亡、遷移的影響,研究其抗腫瘤作用是否與調(diào)控PCNA-AS1 相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 乳腺癌細(xì)胞T-47D 購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫;PCNA-AS1 小干擾RNA(si-NC)及其對(duì)照(si-PCNA-AS1)、PCNA-AS1 過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-PCNA-AS1)及其對(duì)照(pcDNA)購于廣州銳博生物公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于上海貝博生物公司;山羊抗兔IgG 二抗、兔源B 細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2 相關(guān)X蛋白(Bax)、GAPDH 蛋白購于美國(guó)CST 公司;MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購于大連Takara 生物公司。

1.2 蘇木提取液的制備 參照文獻(xiàn)〔2〕方法制備蘇木提取液,取即生藥蘇木煎煮3 次,每次40 min,合并煎液后將其沉淀、濃縮,3 000 r/min 離心20 min。然后超濾,分離提純制得。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 T-47D 細(xì)胞接種含有RPMI1640 培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗、0.2 U/ml 胰島素)的培養(yǎng)瓶,放入37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每?jī)商鞊Q液1 次,80%融合時(shí)以胰酶消化細(xì)胞按照1 ∶3比例傳代。正常培養(yǎng)的T-47D 細(xì)胞為對(duì)照組。用含25、50、100 μg/ml蘇木提取液的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h分別為蘇木低劑量組、中劑量組、高劑量組,按照下述方法步驟檢測(cè)T-47D 細(xì)胞增殖、遷移、凋亡及PCNA-AS1 表達(dá)變化。將對(duì)數(shù)期T-47D 細(xì)胞接種6 孔板,細(xì)胞60%融合時(shí)利用Lipofectamine 2000 將si-NC、si-PCNA-AS1 分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞,收轉(zhuǎn)染48 h 細(xì)胞按照RT-qPCR 步驟檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染si-NC、si-PCNA-AS1 的細(xì)胞為si-NC 組、si-PCNA-AS1 組。用含100 μg/ml蘇木提取液的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染si-NC、si-PCNA-AS1 細(xì)胞48 h 分別為蘇木高劑量+pcDNA組、蘇木高劑量+ pcDNA-PCNA-AS1。

1.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 將轉(zhuǎn)染48 h 或未轉(zhuǎn)染T-47D 細(xì)胞接種96 孔板,按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同劑量的蘇木提取液,孵育細(xì)胞48 h 后,更換為新鮮完全培養(yǎng)基,每孔中添加10 μl CCK-8 溶液在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。在450 nm 波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度(OD)值。細(xì)胞存活率以實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組OD 值比值表示。

1.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成 每組取5×102個(gè)細(xì)胞鋪于6 孔板,放入培養(yǎng)中常規(guī)培養(yǎng),當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見菌落形成時(shí)用4%多聚甲醛固定10 min,再用0.1%結(jié)晶紫染色30 min,顯微鏡下統(tǒng)計(jì)菌落形成數(shù)(大于50 個(gè)細(xì)胞菌落為有效菌落)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收獲上述各組細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次,用1×結(jié)合緩沖液重懸。按照凋亡檢測(cè)試劑盒說明用Annexin V-FITC/PI 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率為早期凋亡(Annexin V-FITC 陽性,PI 陰性)率和晚期凋亡(Annexin V-FITC 陽性,PI 陽性)率之和。

1.7 Western 印跡檢測(cè)Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá) RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞,4℃下1 000 r/min 離心15 min收集上清,用蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取等量的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h,再用特異性一抗(稀釋比例均為1 ∶2 000)在4℃下與膜反應(yīng)過夜,再用相應(yīng)的二抗在室溫孵育膜1 h。利用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色反應(yīng),以Image J 軟件分析各條帶灰度值。目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值

1.8 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 每組取5×105個(gè)細(xì)胞鋪于6 孔板,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合為一層時(shí)用無菌移液槍槍頭垂直在細(xì)胞表面劃一條直線,記為劃痕0 h 并拍照。放入37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%培養(yǎng)箱24 h 為劃痕24 h 并拍照。劃痕愈合率=(0 h劃痕距離-24 h 劃痕距離)/0 h 劃痕距離×100%

1.9 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)PCNA-AS1 表達(dá) TRIzol 試劑提取各組細(xì)胞總RNA,使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA,再用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒熒光定量PCR 上進(jìn)行RT-qPCR。以GAPDH 為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算PCNA-AS1 表達(dá)量。PCNA-AS1 上游引物5′-TTTGGACATACTGGTGAGG-3′,下游5′-A AGGTGTTGGAGGCACTC-3′;GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 蘇木提取液對(duì)T-47D 增殖凋亡的影響 相較于對(duì)照組,蘇木低、中、高劑量組T-47D 細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)、Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05),Bax 蛋白表達(dá)量、凋亡率顯著升高(P＜0.05)。且蘇木低、中、高劑量組3 組間T-47D 細(xì)胞上述指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1、表1、圖2。

圖1 蘇木提取液對(duì)T-47D 凋亡的影響

圖2 蘇木提取液對(duì)T-47D 凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.2 蘇木提取液對(duì)T-47D 遷移及PCNA-AS1 表達(dá)的影響 相較于對(duì)照組,蘇木低、中、高劑量組T-47D細(xì)胞劃痕愈合率降低(P＜0.05),PCNA-AS1表達(dá)量降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),見表1。

表1 蘇木提取液對(duì)T-47D 細(xì)胞存活率、克隆形成、凋亡、T-47D 遷移及PCNA-AS1 表達(dá)的影響(±s,n=3)

表1 蘇木提取液對(duì)T-47D 細(xì)胞存活率、克隆形成、凋亡、T-47D 遷移及PCNA-AS1 表達(dá)的影響(±s,n=3)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與蘇木低劑量組比較,2)P＜0.05;與蘇木中劑量組比較,3)P＜0.05

分組存活率(%) 克隆形成數(shù)(個(gè)) 凋亡率(%)BaxBcl-2PCNA-AS1劃痕愈合率(%)10.78±0.060.97±0.0666.27±3.67蘇木低劑量組86.52±3.671)106.33±6.181)10.29±0.511)0.26±0.021)0.62±0.041)0.80±0.041)50.76±2.571)蘇木中劑量組 68.24±3.331)2) 82.33±5.731)2) 15.73±0.781)2) 0.44±0.031)2)0.42±0.031)2)0.66±0.031)2) 43.22±1.861)2)蘇木高劑量組 47.82±2.801)2)3) 65.67±5.251)2)3) 23.34±0.861)2)3) 0.64±0.041)2)3) 0.23±0.021)2)3) 0.33±0.021)2)3) 35.00±1.551)2)3)F 值190.19853.706370.463190.400105.523136.00081.835 P 值對(duì)照組100.00±0.00125.00±7.356.54±0.340.14±0.0 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

2.3 干擾PCNA-AS1 對(duì)T-47D 增殖凋亡的影響相較于si-NC 組,si-PCNA-AS1 組T-47D 細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)、Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05),Bax 蛋白表達(dá)量、凋亡率顯著升高(P＜0.05)。見圖3、圖4、表2。

圖3 干擾PCNA-AS1 對(duì)T-47D 凋亡的影響

圖4 干擾PCNA-AS1 對(duì)T-47D 凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.4 干擾PCNA-AS1 對(duì)T-47D 遷移的影響 相較于si-NC 組,si-PCNA-AS1 組T-47D 細(xì)胞PCNA-AS1 表達(dá)量顯著降低,劃痕愈合率顯著降低(P＜0.05)。見表2。

表2 干擾PCNA-AS1 對(duì)T-47D 存活率、克隆形成及凋亡、T-47D 遷移的影響(±s,n=3)

表2 干擾PCNA-AS1 對(duì)T-47D 存活率、克隆形成及凋亡、T-47D 遷移的影響(±s,n=3)

組別存活率(%) 克隆形成數(shù)(個(gè)) 凋亡率(%)BaxBcl-2PCNA-AS1 劃痕愈合率(%)10.78±0.060.98±0.0566.33±3.74 si-PCNA-AS1 組54.46±2.9869.67±5.7920.84±0.790.53±0.040.31±0.020.37±0.0235.68±2.24 t 值26.6499.50628.39316.38312.87119.62012.177 P 值si-NC 組100.00±0.00 124.67±8.186.54±0.370.14±0.0 0.0000.0010.0000.0000.0000.0000.000

2.5 過表達(dá)PCNA-AS1 對(duì)蘇木提取液處理的T-47D增殖凋亡的影響 相較于蘇木高劑量+pcDNA 組,蘇木高劑量+pcDNA-PCNA-AS1 組T-47D 細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)、Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高,Bax 蛋白表達(dá)量、凋亡率降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。見表3、圖5、圖6。

圖5 過表達(dá)PCNA-AS1 對(duì)蘇木提取液處理的T-47D 凋亡的影響

圖6 過表達(dá)PCNA-AS1 對(duì)蘇木提取液處理的T-47D 凋亡蛋白表達(dá)的影響

表3 過表達(dá)PCNA-AS1 對(duì)蘇木提取液處理的T-47D 細(xì)胞存活率、克隆形成凋亡及遷移的影響(±s,n=3)

表3 過表達(dá)PCNA-AS1 對(duì)蘇木提取液處理的T-47D 細(xì)胞存活率、克隆形成凋亡及遷移的影響(±s,n=3)

組別存活率(%) 克隆形成數(shù)(個(gè)) 凋亡率(%)BaxBcl-2PCNA-AS1 劃痕愈合率(%0.23±0.020.33±0.0234.98±1.62蘇木高劑量+pcDNA-PCNA-AS1 組 92.07±4.33 110.00±6.68 7.68±0.480.20±0.020.63±0.050.85±0.0555.80±2.64 t/P 值14.773/0.000 9.440/0.001 26.626/0.000 14.152/0.000 12.865/0.000 16.725/0.000 11.642/0.000蘇木高劑量+pcDNA 組48.09±2.80 65.67±4.64 23.36±0.900.64±0.05)

2.6 過表達(dá)PCNA-AS1 對(duì)蘇木提取液處理的T-47D遷移的影響 相較于蘇木高劑量+pcDNA 組,蘇木高劑量+pcDNA-PCNA-AS1 組T-47D 細(xì)胞PCNAAS1 表達(dá)量和劃痕愈合率顯著升高(P＜0.05)。見表3。

3 討 論

文獻(xiàn)證實(shí)蘇木活性化合物巴西木素、氧化巴西木素與順鉑聯(lián)合可協(xié)同誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯〔7〕。氧化巴西木素對(duì)皮膚癌細(xì)胞具有顯著毒性作用〔8〕。蘇木乙酸乙酯提取物通過激活活性氧途徑促進(jìn)急性髓性白血病細(xì)胞分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔9〕。蘇木查耳酮還可誘導(dǎo)caspase 依賴和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)依賴性人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡〔10〕。本研究提示,蘇木提取液顯著降低T-47D 細(xì)胞存活率和克隆形成能力,抑制細(xì)胞遷移,并呈劑量依賴效應(yīng)。凋亡是抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的最重要原因。Bax 和Bcl-2 是評(píng)估細(xì)胞凋亡的重要信號(hào),促凋亡蛋白Bax 表達(dá)增加、抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)降低可有效促進(jìn)線粒體釋放凋亡效應(yīng)因子并誘導(dǎo)凋亡發(fā)生〔11〕。Naik Bukke 等〔12〕研究表明巴西木素A 通過調(diào)控Bcl-2 蛋白表達(dá)可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 凋亡。本研究說明,蘇木提取液可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)T-47D 細(xì)胞凋亡。

越來越多研究表明lncRNA 表達(dá)異常在腫瘤的啟動(dòng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔13〕。PCNA-AS1位于染色體20p12.3,研究指出非小細(xì)胞肺癌組織中PCNA-AS1 表達(dá)上調(diào),與晚期TNM 分期呈正相關(guān),敲減PCNA-AS1 顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制體內(nèi)腫瘤形成〔14〕。此外,PCNA-AS1 高表達(dá)還與胃癌細(xì)胞的侵襲表型相關(guān)〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染si-PCNA-AS1 干擾PCNAAS1 表達(dá)顯著抑制T-47D 細(xì)胞存活、克隆形成和遷移能力,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。既往研究證實(shí)在乳腺癌中多種中藥化合物的抗腫瘤作用與調(diào)控lncRNA 表達(dá)有關(guān),如槐耳提取物通過下調(diào)lncRNA H19 表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞存活率并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔16〕。黃芩素的抗腫瘤作用與上調(diào)lncRNA 配對(duì)盒基因8 反義RNA1(PAX8-AS1)表達(dá)相關(guān)〔17〕。本研究提示,蘇木提取液可能通過調(diào)控PCNA-AS1 表達(dá)進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞T-47D 增殖、凋亡和遷移。下調(diào)PCNA-AS1表達(dá)是介導(dǎo)蘇木提取液對(duì)乳腺癌細(xì)胞T-47D 發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制。然而,關(guān)于蘇木在乳腺癌中發(fā)揮抗腫瘤作用的主要活性成分仍需進(jìn)一步探究。

綜上,蘇木提取液可抑制乳腺癌細(xì)胞T-47D 增殖和遷移,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其抗腫瘤作用是通過下調(diào)PCNA-AS1 表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。