王丹丹 (武警吉林省總隊(duì)醫(yī)院外一科,吉林 長春 130052)

結(jié)腸癌是常見的一種腸道惡性腫瘤,隨著人們生活水平及飲食結(jié)構(gòu)的改變,其患病率逐年上升,嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量〔1〕。由于結(jié)腸癌早期癥狀較為隱匿,以此造成大部分患者就診時病情已處于中晚期,導(dǎo)致患者預(yù)后不良〔2,3〕。因此,早期診斷、準(zhǔn)確預(yù)后評估對結(jié)腸癌患者死亡率降低具有重要意義。近年來,長鏈非編碼RNA(LncRNA)成為研究熱點(diǎn),是在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一組轉(zhuǎn)錄物,其表達(dá)與多種惡性腫瘤密切相關(guān)。LncRNA ANCR 主要位于人染色體4q12,且研究證實(shí)在眾多腫瘤中發(fā)揮作用〔4,5〕。核富集轉(zhuǎn)錄體(NEAT)1 是未經(jīng)剪切、長度4 kb 左右的一種非編碼RNA,研究證實(shí)其在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)〔6,7〕。本研究旨在探討老年結(jié)腸癌患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)LncRNA ANCR 和LncRNA NEAT1 表達(dá)與及其與病理特征及預(yù)后關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集武警吉林省總隊(duì)醫(yī)院于2018年1月至2021年1月收治的老年結(jié)腸癌患者83 例的結(jié)腸癌組織及癌旁組織,其中男47 例,女36 例;年齡65～82〔平均(73.42±6.58)〕歲;體重指數(shù)17～28〔平均(23.31±2.16)〕kg/m2;分化程度:低分化35 例,中、高分化48 例;TNM 分期:Ⅰ～Ⅱ期32 例,Ⅲ～Ⅳ期51 例。納入標(biāo)準(zhǔn):①均行根治性手術(shù),且術(shù)后病理證實(shí)為結(jié)腸癌;②年齡≥65 歲;③具有完整的臨床病理資料;④具有完整的隨訪資料,且隨訪終點(diǎn)明確。排除標(biāo)準(zhǔn):①伴其他惡性腫瘤;②伴重要臟器功能障礙者;③伴自身免疫性疾病者。

1.2 標(biāo)本采集及處理 取癌組織與癌旁組織置于肝素鈉抗凝管中,充分混合均勻備用,采用Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液提取PBMC。

1.3 總RNA 提取 依據(jù)Trizol 試劑說明書(昆山遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)提取PBMC 總RNA,焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的蒸餾水溶解。總RNA 濃度和質(zhì)量采用分光光度儀檢測,置于-70℃待用。

1.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 以U6 作為內(nèi)參照,分析LncRNA ANCR 和LncRNA NEAT1 表達(dá)。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸。將其逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-70℃待用。

1.5 實(shí)時熒光定量定量PCR(qRT-PCR) 采用SYBR 法進(jìn)行qRT-PCR 檢測,嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行檢測步驟及反應(yīng)條件。引物由上海生工生物工程有限公司合成,LncRNA ANCR 正義:5′-GCCACTATGTAGCGGGTTTC-3′,反義:5′-GTCTTGCTTTGTCACCCAGG-3′;LncRNA NEAT1 正義:5′-GGCAGGTCTAGTTTGGGCAT-3′,反義:5′-CCTCATCCCTCCCAGTACC-3′;U6 正義:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反義:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)體系20 μl,包括1 μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0.5 μmol/L 特異反向引物、0.5 μmol/L特異前向引物、1×SYBR Green I master-mix。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min,95℃15 s、60℃1 min,共40 個循環(huán),每個樣品設(shè)3 個復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法計算LncRNA ANCR 和LncRNA NEAT1 相對表達(dá)量。

1.6 預(yù)后隨訪 隨訪至2022年6月30日或死亡。主要采用門診復(fù)查、電話及住院檢查等隨訪方式。記錄患者總生存期(OS),OS 指從診斷日起值任何原因的死亡或至隨訪末。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS25.0 軟件χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、Kaplan-Meier 分析、Log-rank 檢驗(yàn)及多因素Logistic 回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織與癌旁組織LncRNA ANCR 和LncRNA NEAT1 表達(dá)比較 癌組織LncRNA ANCR 和LncRNA NEAT1 相對表達(dá)量(3.27±0.81,2.19±0.62)高于癌旁組織(1.00±0.02、0.98±0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 不同病理特征LncRNA ANCR、LncRNA NEAT1 表達(dá)比較 不同性別、年齡、體重指數(shù)、腫瘤直徑、分化程度LncRNA ANCR、LncRNA NEAT1 相對表達(dá)量無明顯差異(P＞0.05);TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期LncRNA ANCR、LncRNA NEAT1 相對表達(dá)量顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移LncRNA ANCR、LncRNA NEAT1 相對表達(dá)量顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.05),見表1。

表1 不同病理特征LncRNA ANCR、LncRNA NEAT1 表達(dá)比較(±s)

表1 不同病理特征LncRNA ANCR、LncRNA NEAT1 表達(dá)比較(±s)

病理特征n LncRNA ANCR相對表達(dá)量t 值P值LncRNA NEAT1相對表達(dá)量t 值P值性別 男473.31±0.720.566＞0.052.17±0.570.364＞0.05 363.21±0.892.22±0.68年齡 65～75 歲453.20±0.940.764＞0.052.16±0.690.508＞0.05女76～82 歲383.34±0.682.23±0.54體重指數(shù) ＞24 kg/m2393.29±0.780.222＞0.052.20±0.600.148＞0.05≤24 kg/m2443.25±0.852.18±0.63腫瘤直徑 ＞5 cm373.36±0.710.923＞0.052.24±0.510.654＞0.05≤5 cm463.20±0.842.15±0.70分化程度 低分化353.32±0.740.488＞0.052.26±0.540.864＞0.05中、高分化483.23±0.892.14±0.68 TNM 分期 Ⅰ～Ⅱ期322.14±0.418.166＜0.051.32±0.459.768＜0.05Ⅲ～Ⅳ期513.98±1.232.74±0.74淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是294.34±1.318.767＜0.052.80±0.6711.987＜0.05否542.70±0.321.05±0.56

2.3 LncRNA ANCR 和LncRNA NEAT1 表達(dá)與預(yù)后關(guān)系 隨訪時間13～52 個月,平均(34.87±9.75)個月。以LncRNA ANCR 相對表達(dá)量中位數(shù)3.27 為界,將患者分為LncRNA ANCR＞3.27 組(n=35)與≤3.27 組(n=48),其OS 時間分別為27 個月和42 個月,LncRNA ANCR≤3.27 患者總體生存情況顯著優(yōu)于LncRNA ANCR＞3.27 患者(P＜0.05)。以LncRNA NEAT1 相對表達(dá)量中位數(shù)2.19 為界,將患者分為LncRNA NEAT1＞2.19 組(n=37)與≤2.19 組(n=46),其OS 時間分別為28 個月和40 個月,LncRNA NEAT1≤2.19 患者總體生存情況顯著優(yōu)于LncRNA NEAT1＞2.19 患者(P＜0.05),見圖1,圖2。

圖1 LncRNA ANCR 表達(dá)與預(yù)后關(guān)系

圖2 LncRNA NEAT1 表達(dá)與預(yù)后關(guān)系

2.4 多因素Logistic 回歸分析影響結(jié)腸癌患者預(yù)后危險因素 TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA ANCR 高表達(dá)和LncRNA NEAT1 高表達(dá)為影響結(jié)腸癌患者預(yù)后獨(dú)立危險因素(P＜0.05)。見表2。

表2 多因素Logistic 回歸分析影響結(jié)腸癌患者預(yù)后危險因素

3 討 論

結(jié)腸癌是發(fā)病率高、致死率高及癌轉(zhuǎn)移率高的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤〔8,9〕。臨床調(diào)查顯示,我國在全球范圍內(nèi)屬結(jié)腸癌高發(fā)地區(qū)之一,且病死率和發(fā)病率呈增長趨勢〔10〕。因此,探索結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制,以此尋找有效的結(jié)腸癌篩查和早期診斷的生物標(biāo)志物,對結(jié)腸癌患者發(fā)病率和病死率降低的關(guān)鍵〔11,12〕。LncRNA 是長度大于200 nt 的一類RNA,雖不編碼蛋白質(zhì),但能夠經(jīng)調(diào)控相關(guān)基因參與機(jī)體多種生物學(xué)活動。近年來,LncRNA 的表觀遺傳修飾成為研究熱點(diǎn),其機(jī)制主要涉及RNA 干擾、染色質(zhì)重構(gòu)、組蛋白修飾及DNA 甲基化〔13〕。研究表明,利用腫瘤組織、細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在惡性腫瘤的進(jìn)化演變,如細(xì)胞發(fā)育、分化等過程中LncRNA 扮演重要角色〔14〕。LncRNA ANCR 主要位于人染色體4q12,是在多個腫瘤中發(fā)揮抑癌或促癌作用的一種LncRNA〔15,16〕。饒德新等〔17〕研究發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌患者血清LncRNA ANCR 表達(dá)高于健康體檢人員,且隨訪1年,LncRNA ANCR 高表達(dá)患者1年總生存期低于LncRNA ANCR 低表達(dá)患者,且與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明,老年結(jié)腸癌患者LncRNA ANCR 表達(dá)與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān);老年結(jié)腸癌患者LncRNA ANCR表達(dá)越高生存時間越短;此外,LncRNA ANCR 高表達(dá)為影響結(jié)腸癌患者預(yù)后獨(dú)立危險因素。

2007年,Hutchinson 等經(jīng)芯片技術(shù)篩選得到維持亞核體paraspeckle 完整性所必需的一種LncRNA,將其命名為NEAT1。LncRNA NEAT1 是細(xì)胞核內(nèi)旁斑的重要組成部分。眾多研究表明,NEAT1顯示了惡性腫瘤驅(qū)動因素的典型特征,由于其負(fù)責(zé)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,且其在惡性腫瘤中的臨床特征和頻繁失調(diào)有關(guān),如患者存活率、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移〔18～21〕。任超等〔22〕研究發(fā)現(xiàn),胃癌患者血清中外泌體和組織LncRNA NEAT1 表達(dá)升高,故可作為輔助診斷胃癌的一種標(biāo)志物。本研究結(jié)果表明,老年結(jié)腸癌患者LncRNA NEAT1 表達(dá)與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān);老年結(jié)腸癌患者LncRNA NEAT1 表達(dá)越高生存時間越短;此外,LncRNA NEAT1 高表達(dá)為影響結(jié)腸癌患者預(yù)后獨(dú)立危險因素。