趙文燕，佘 磊

0引言

幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)是兒童時(shí)期常見(jiàn)的慢性風(fēng)濕性疾病，外周關(guān)節(jié)炎為其主要表現(xiàn)，目前有學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病是由遺傳和環(huán)境因素引起的[1]。JIA常伴有淋巴結(jié)、皮膚、肝臟等全身多系統(tǒng)受累，而JIA相關(guān)性葡萄膜炎(juvenile idiopathic arthritis-associated uveitis，JIA-U)是JIA最嚴(yán)重的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，其在JIA患兒中具有極高的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，通常主要表現(xiàn)為慢性前葡萄膜炎，并且早期無(wú)任何眼部不適癥狀，當(dāng)出現(xiàn)虹膜黏連等癥狀時(shí)已嚴(yán)重威脅到患兒的視力，所以早期檢測(cè)和治療極為必要[2-3]。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cell，Breg)是在機(jī)體免疫反應(yīng)中起負(fù)調(diào)節(jié)作用的一類(lèi)B細(xì)胞，并可通過(guò)細(xì)胞因子的分泌及細(xì)胞表面分子間的相互作用介導(dǎo)免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)，有研究表明其免疫能力主要由其所分泌的白介素10(interleukin 10，IL-10)所介導(dǎo)[4-5]。CD1d(hi)CD5+CD19+Breg是Breg的亞群之一，已被報(bào)道在毒性彌漫性甲狀腺腫[6]、原發(fā)性干燥綜合征[7]等多種免疫性疾病中具有重要作用[5]。有研究報(bào)道稱(chēng)Breg與JIA的發(fā)生密切相關(guān)，但其是否參與JIA-U的發(fā)生還未見(jiàn)報(bào)道[8]。因此本研究通過(guò)檢測(cè)JIA-U患兒外周血中CDld(hi)CD5+CD19+Breg水平，探究其在JIA-U中的變化及意義，以期為JIA-U的早期檢測(cè)和判斷疾病嚴(yán)重程度提供數(shù)據(jù)支持。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取2018-04/2020-05本院確診收治的JIA-U患兒95例作為JIA-U組，其中活動(dòng)期43例，靜止期52例。70例JIA患兒作為JIA組，其中活動(dòng)期33例，靜止期37例。另選同時(shí)期正常健康體檢兒童75例作為對(duì)照組。根據(jù)JIA-U疾病嚴(yán)重程度評(píng)分：房水細(xì)胞或房閃陽(yáng)性、睫狀充血、虹膜黏連、角膜后沉著物、玻璃體有細(xì)胞或者視網(wǎng)膜病變各1分[9]。JIA-U及JIA納入標(biāo)準(zhǔn)：符合青少年JIA國(guó)際風(fēng)濕病協(xié)會(huì)聯(lián)盟(ILAR)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[10]，JIA-U在此基礎(chǔ)上接受常規(guī)眼科篩查評(píng)估確診；臨床資料完整；患兒未接受糖皮質(zhì)激素等藥物手段治療；患兒均未患其它全身性免疫系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：患兒患有先天性心臟病、有過(guò)敏傾向等其他疾病。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：既往身體健康且健康體檢結(jié)果正常；排除標(biāo)準(zhǔn)：近期服用糖皮質(zhì)激素或抗生素。所有受試者均通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者及其家屬知情同意并簽署同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：CK-E10155)購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司；藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)標(biāo)記的鼠抗人CD1d抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的鼠抗人CD5抗體、多甲藻素葉綠素蛋白(peridininchlorophyll- protein，PerCP)標(biāo)記的鼠抗人CD19抗體、IgG1-PerCP-cyTM(貨號(hào)：550255、555352、561295、550795)購(gòu)自BD Biosciences；鼠抗人IgG1-FITC、IgG1-PE(貨號(hào)：sc-2855、sc-2866)購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology；RPMI Medium 1640、胎牛血清(貨號(hào)：BL1098、ZCNXQ03-KIL)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。Thermo賽默飛世爾Multiskan FC酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2.2樣品采集及CD1d(hi)CD5+CD19+Breg檢測(cè)患兒于就診當(dāng)日抽取靜脈血4mL，健康體檢兒童抽取等量靜脈血，肝素鈉抗凝一部分離心取血漿，一部分密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，5min，1500r/min離心棄上清，PBS兩次洗滌后再次用PBS重懸細(xì)胞調(diào)整濃度為1×106/mL，吸取100μL，加入CD1d-PE、CD5-FITC、CD19-PerCP各10μL混勻，而每個(gè)樣本的同型對(duì)照加入IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP-cyTM各10μL，30min室溫避光孵育后加入紅細(xì)胞裂解液混勻靜置15min，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)并用Cell Quest軟件進(jìn)行分析。

1.2.3ELISA檢測(cè)IL-10水平取1.2.2中血漿標(biāo)本根據(jù)IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)處理樣本，在450nm處檢測(cè)OD值，計(jì)算血漿IL-10水平。

2結(jié)果

2.1一般資料三組受試者年齡、性別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與JIA組相比，JIA-U組JIA病程、JIA亞型差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組一般資料比較

2.2各組外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的比例變化對(duì)照組、JIA組、JIA-U組患兒外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例分別為(2.64±0.72)%、(1.96±0.35)%、(1.31±0.20)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=174.176，P<0.01)；與對(duì)照組相比，JIA組、JIA-U組患兒外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與JIA組相比，JIA-U組CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。與靜止期相比，活動(dòng)期JIA及JIA-U患者CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 活動(dòng)期與靜止期JIA及JIA-U患者外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的比例比較

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的比例結(jié)果 A：CD19設(shè)門(mén)圖；B：對(duì)照組；C：JIA組；D：JIA-U組。

2.3各組IL-10的表達(dá)情況對(duì)照組、JIA組、JIA-U組患兒血漿中IL-10水平分別為20.33±5.16、31.22±4.79、43.35±6.74pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=339.327，P<0.01)；與對(duì)照組相比，JIA組、JIA-U組患兒血漿中IL-10水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與JIA相比，JIA-U組IL-10水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與靜止期相比，活動(dòng)期JIA及JIA-U患者IL-10水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 活動(dòng)期與靜止期JIA及JIA-U患者外周血IL-10的表達(dá)比較

2.4JIA-U患兒CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與IL-10的相關(guān)性JIA-U患兒CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與IL-10呈負(fù)相關(guān)(r=-0.377，P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 JIA-U患兒CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與IL-10表達(dá)的相關(guān)性。

2.5CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與JIA-U患者病情嚴(yán)重程度評(píng)分的相關(guān)性CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與JIA-U患者病情嚴(yán)重程度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.225，P=0.028)，見(jiàn)圖3。

圖3 CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與JIA-U患者病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

2.6Logistic回歸分析影響因素JIA-U發(fā)生的因素選取上述檢測(cè)指標(biāo)中存在顯著性差異的指標(biāo)作為自變量，對(duì)CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例、JIA亞型、關(guān)節(jié)炎病程、IL-10水平進(jìn)行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，四者均對(duì)JIA-U發(fā)生存在影響(P<0.05)。多因素分析發(fā)現(xiàn)，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg低比例、JIA少關(guān)節(jié)型、關(guān)節(jié)炎病程<4a、IL-10高水平均是影響JIA-U發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 Logistic回歸分析影響JIA-U發(fā)生的因素

3討論

JIA具有與慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎相同的癥狀，而葡萄膜炎是JIA的最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，是一種常見(jiàn)的眼部炎癥性疾病，其特征是虹膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜等部位出現(xiàn)炎癥癥狀，解剖學(xué)將其分為前葡萄膜炎、中葡萄膜炎、后葡萄膜炎和全葡萄膜炎，并且在慢性前葡萄膜炎發(fā)作時(shí)可能無(wú)癥狀表現(xiàn)，若不能得到及時(shí)有效的治療，可導(dǎo)致患兒失明[2，11-13]。因此JIA-U的早期檢測(cè)和治療對(duì)患者的健康十分重要。

B細(xì)胞在自身免疫疾病的發(fā)生機(jī)制中具有重要作用，可通過(guò)產(chǎn)生抗體或呈遞抗原促進(jìn)T細(xì)胞活化，除此之外，還可通過(guò)促進(jìn)炎癥因子的分泌或抑制T細(xì)胞增殖來(lái)調(diào)節(jié)免疫功能[14]。Breg是一類(lèi)僅可以通過(guò)分泌IL-10發(fā)揮其免疫抑制功能的B細(xì)胞，CDld(hi)CD5+CD19+是Breg的其中一個(gè)表型，研究表明其數(shù)量、功能的異常是自身免疫疾病發(fā)生的重要機(jī)制[15-16]。有研究學(xué)者將能夠分泌IL-10的CDld(hi)CD5+B細(xì)胞亞群稱(chēng)為B10細(xì)胞[16]。許多研究發(fā)現(xiàn)，Breg在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[16]、JIA[17]等關(guān)節(jié)炎疾病中具有重要作用，并參與其發(fā)生發(fā)展。如產(chǎn)生IL-35的B細(xì)胞(i35-Bregs)可治療葡萄膜炎等自身免疫或傳染性疾病[18]。CD19+CD24hiCD38hiBreg在JIA患兒外周血中比例與健康對(duì)照組相比顯著降低[17]。IL-10是一種免疫抑制因子，可通過(guò)抑制促炎因子的產(chǎn)生及T細(xì)胞活化達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在JIA患兒中IL-10水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)中顯著增加，這與IL-10的基因多態(tài)性有關(guān)，如：IL-10-1082 AA基因變體與多關(guān)節(jié)青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(pJIA)的易感性之間存在顯著正相關(guān)性[20]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)自身免疫性葡萄膜炎模型大鼠血清中IL-10含量顯著高于對(duì)照組，二者的含量升高可能是機(jī)體自然恢復(fù)機(jī)制的作用[19]。JIA-U患兒血清中IL-10水平高于JIA患者，其水平升高是眼部炎癥的危險(xiǎn)因素[21]。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，JIA組、JIA-U組患兒外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例依次顯著降低，而IL-10水平依次顯著增加，與前人研究結(jié)果相一致，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與IL-10表達(dá)及JIA-U患者病情嚴(yán)重程度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，該結(jié)果表明CD1d(hi)CD5+CD19+Breg參與JIA-U的發(fā)生發(fā)展，IL-10水平的升高可能是由T淋巴細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞所分泌，該機(jī)制與機(jī)體自身免疫功能的恢復(fù)有關(guān)。而本研究進(jìn)一步探究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與靜止期相比，活動(dòng)期JIA及JIA-U患者CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例顯著降低，IL-10水平顯著增加，該結(jié)果表明，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例隨著疾病活躍程度增大而降低，而IL-10水平隨疾病活躍程度增大而增多。

研究顯示，發(fā)病年齡≤6歲、關(guān)節(jié)炎病程<4a、少關(guān)節(jié)型是造成JIA-U發(fā)生的危險(xiǎn)因素[22]。而本研究多因素分析發(fā)現(xiàn)，除了關(guān)節(jié)炎病程、關(guān)節(jié)亞型是影響JIA-U發(fā)生的危險(xiǎn)因素外，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg低比例、IL-10高水平也是影響JIA-U發(fā)生的危險(xiǎn)因素，與前人研究結(jié)果部分一致。這表明，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的數(shù)量異?？赡芘cJIA-U的發(fā)生有關(guān)，該結(jié)果為JIA-U的早期檢查提供了一個(gè)潛在的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，而發(fā)病年齡未納入危險(xiǎn)因素這點(diǎn)與前人研究存在差異可能是因?yàn)榧{入病例數(shù)量欠缺所造成的。

綜上所述，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg在JIA-U患兒外周血中比例顯著降低，其可能參與JIA-U的發(fā)生發(fā)展，有作為JIA-U疾病早期監(jiān)測(cè)及嚴(yán)重程度判斷檢測(cè)指標(biāo)的潛能。本研究不僅為JIA-U的早期檢測(cè)和判斷疾病嚴(yán)重程度提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)支持，還為其靶向治療研究提供了參考。但由于病例樣本量的局限，研究可能出現(xiàn)一些統(tǒng)計(jì)缺陷，因此，在未來(lái)的研究中會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。