趙 磊，楊笑薇，周慧敏，左 韜

0引言

干眼是由淚液的質、量及動力學異常導致的淚膜不穩(wěn)定或眼表微環(huán)境失衡的慢性眼表疾病，可伴眼表炎性反應、組織及神經(jīng)異常，造成眼部不適癥狀和(或)視功能障礙[1]。其中，淚膜不穩(wěn)定與眼表上皮細胞損傷互為因果，可形成惡性循環(huán)加重干眼病情[2]。干眼的相關研究一直是眼科專業(yè)領域的焦點，中醫(yī)藥在干眼治療方面具有獨特優(yōu)勢，充分發(fā)揮中醫(yī)藥治療干眼的優(yōu)勢是我國干眼研究中需要重點加強的內(nèi)容[3]。杞參方是左韜教授基于臨床經(jīng)驗用于治療干眼的中藥方劑，前期研究顯示，杞參方能夠有效改善干眼患者的眼部癥狀、淚液分泌量和淚膜破裂時間，值得進一步對其進行深入研究[4]。

滲透壓一度被認為是干眼病診斷的金標準，正常人的淚膜滲透壓約在300～310(平均302)mOsm/L[5]。而與之相比，干眼患者的淚液滲透壓分布在306～441(平均343)mOsm/L,可以高達360mOsm/L[6]；500mOsm/L高滲誘導體外培養(yǎng)的角膜或結膜上皮細胞已經(jīng)成為了用于模擬干眼疾病狀態(tài)的經(jīng)典模型，并且被廣泛地用于干眼發(fā)病機制等方面的基礎實驗研究[7-8]。TFOSDEWS Ⅱ得出結論，干眼的核心機制是蒸發(fā)誘導的淚液高滲，淚液高滲直接損害眼表，引起炎癥反應，其中以絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)與核因子κB介導的最為常見[9]。MAPK作為主要信號傳遞者，擔負著從細胞表面到核內(nèi)部的信號傳遞工作，調(diào)控著許多常見的生理活動，如炎癥、細胞凋亡、腫瘤細胞的侵襲等[10]。JNK為MAPK的亞族。研究證實，細胞炎性因子在干眼發(fā)病過程中表達明顯增強，而炎性因子的表達釋放與JNK通路的激活密切相關[11-12]。水通道蛋白5(Aquaporin 5，AQP5)c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal Kinase 1，JNK 1)AQP5在角膜上皮層中豐富存在，為水分子通過角膜上皮屏障提供主要途徑，并且發(fā)揮著調(diào)節(jié)炎癥、角膜損傷、細胞凋亡等作用[13]。Ren等[8]研究證實JNK/AQP5信號通路是500mOsm/L滲透壓誘導的人角膜上皮細胞(human corneal epithelial cells,HCECs)干眼模型的重要調(diào)控通路，故而本研究引入了JNK1/AQP5信號通路進行杞參方治療干眼的作用初探，從而在細胞實驗方面證實杞參方顆粒治療干眼的效應機制。

1材料和方法

1.1材料實驗藥品：杞參方顆粒組成：熟地黃20g、山藥9g、山茱萸9g、牡丹皮9g、澤瀉6g、茯苓6g、枸杞子6g、菊花6g、人參3g、麥冬9g、五味子6g、通草6g、黃精9g、葛根9g，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。實驗試劑及儀器：人12-SV40角膜上皮細胞株(CRL-11135)；NaCl粉劑，美國Sigama公司；細胞活力檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)，北京Solarbio公司；白介素-6(Interleukin 6,IL-6)檢測試劑盒(SEA079Mu)與腫瘤壞死因子-α(tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)檢測試劑盒(SEA133Mu)，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；Anti-Caspase-1抗體、Anti-JNK1抗體[EPR17557](ab199380)、Anti-JNK1(phospho T183+Y185)抗體[EPR20763](ab215208)，abcam公司；AQP5抗體(D-7)：sc-514022，Santa Cruz Biotechnology公司。MK3型酶標儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；371型細胞培養(yǎng)箱，美國熱電公司；DM IL型倒置顯微鏡，德國徠卡公司；EP300型電泳儀與Tanon-4200SF凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。本研究通過倫理委員會審核并認真執(zhí)行(No.210000420200010)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和保存HCECs用包含10%胎牛血清、100U/mL青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在5% CO2、37℃細胞孵育箱中培養(yǎng)，每1～2d換液。當細胞生長至80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化，消化時間約為37℃，5min，按1∶3傳代培養(yǎng)。細胞凍存:取生長狀態(tài)良好的細胞，0.25%胰蛋白酶，37℃，5min消化后調(diào)整細胞數(shù)至2×106～2×107/mL，離心去上清液，加等量細胞凍存液(10% DMSO+90%胎牛血清)重懸，加入凍存管，放入凍存盒，-80℃冰箱過夜后放入液氮長期保存。

1.2.2制作高滲透壓干眼模型HCECs造模在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中加入無菌500mOsm/L滲透壓的飽和氯化鈉溶液，培養(yǎng)基pH值均為7.2±0.2。

1.2.3血清制備

1.2.3.1空白血清的制備成年雄性Wistar大鼠10只，SPF級，體質量220～240g，于實驗動物中心屏障級動物房內(nèi)，自由攝食飲水，適應性喂養(yǎng)2d，禁食12h后，給予蒸餾水灌胃。每日2次，連續(xù)3d。末次灌胃1h后開始采血。采用腹主動脈采血法，血液入15mL離心管，室溫靜置1h，待有血清析出后，3000r/m離心15min。分離血清，56℃水浴滅活40min，0.22μm濾膜過濾除菌。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2杞參方含藥血清的制備成年雄性Wistar大鼠30只，SPF級，體質量220～240g，于實驗動物中心屏障級動物房內(nèi)，自由攝食飲水，適應性喂養(yǎng)2d，禁食12h后，給予杞參方顆粒蒸餾水沖服灌胃，每日2次，連續(xù)3d。參考《藥理實驗方法學》與人折算，大鼠劑量即按照成人日劑量的6.36倍分沖備用；人每日用量為1.88g/(kg·d)，折算后大鼠最終等效劑量為11.98g/(kg·d)，則杞參方高、中、低劑量分別為23.96、11.98、5.99g/(kg·d)。每日2次灌胃。末次灌胃1h后開始采血。血液室溫靜置1h，待有血清析出后，3000r/min離心15min。分離血清，56℃水浴滅活40min，0.22μm濾膜過濾除菌。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4實驗分組空白組：正常條件培養(yǎng)的角膜上皮細胞；模型組：模型細胞加入10%空白血清；西藥組：模型細胞加入0.3%玻璃酸鈉滴眼液；杞參方高劑量組：模型細胞加入15%杞參方高劑量含藥血清；杞參方中劑量組：模型細胞加入15%杞參方中劑量含藥血清：杞參方低劑量組：模型細胞加入15%杞參方低劑量含藥血清。

1.2.5實驗指標

1.2.5.1CCK-8法檢測不同藥物干預對HCECs存活率的影響細胞以1×104/mL的密度接種于96孔板中，每孔接種100μL，將培養(yǎng)板置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h；吸去96孔板中舊培養(yǎng)基后，分別加入100μL培養(yǎng)基滲透壓為500mOsm/L的含空白血清、0.3%玻璃酸鈉滴眼液、不同濃度杞參方顆粒含藥血清的培養(yǎng)基到96孔板中，每組設3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h；吸去96孔板中舊培養(yǎng)基，將CCK-8試劑和完全培養(yǎng)基1∶9稀釋配制成10%的工作濃度，加入96孔板中，設3個只含CCK-8工作液的復孔為空白孔，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h；用酶標儀檢測在450nm處的吸光度值(A)，計算細胞存活率。計算公式：存活率=[(A實驗孔-A空白孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%。

1.2.5.2ELISA法檢測各組細胞外液炎癥因子TNF-α和IL-6表達情況將試劑盒中的標準品凍干粉用1mL標準品稀釋劑稀釋后，每孔濃度為X、X/2、X/4、X/8、X/16、X/32pg/mL。制作標準品稀釋液(0pg/mL)以便后期空白孔加樣。將標準品、稀釋后標準品、待測血清依次加入酶標板中。最后使用標準品稀釋液(0pg/mL)加入空白孔。置于37℃水浴鍋中，孵育2h。在酶標板中，每孔加入100μL工作液A，將封板膜黏貼于酶標板上，水浴鍋孵育1h。棄去酶標板內(nèi)的反應液，將酶標板倒扣于濾紙上拍擊，使孔內(nèi)殘留的液體流干。用洗板液重復進行5次洗板。滴加工作液B在酶標板中，重復以上步驟。通過酶標儀進行檢測，于450nm波長測定各孔的OD值，通過測量所得標準曲線計算出目的蛋白的濃度。

1.2.5.3免疫細胞化學法檢測各組HCECs的凋亡因子caspase-1和AQP5的蛋白表達情況制作細胞片后進行染色：(1)1×PBS緩沖液洗滌切片3次，各5min；(2)3%H2O2滴加在切片上，室溫靜置10min；(3)PBS洗3次，各5min；(4)使用正常山羊血清進行封閉，室溫10～15min，甩去多余液體。(5)滴加一抗(1∶400)50μL，置于濕盒內(nèi)，4℃抗體孵育過夜。(6)1×PBS洗3次，各5min；(7)滴加試劑A(生物素標記的抗鼠/兔IgG)50μL，室溫靜置20min；(8)1×PBS洗3次，各5min；(9)滴加試劑B(HRP標記的鏈霉親和素)50μL，室溫靜置20min；(10)1×PBS洗3次，各5min；DAB顯色；蘇木精復染，鏡下觀察并采集照片，測定5個隨機視野的平均光密度值，以其平均值作為該樣本中目的蛋白表達水平。

1.2.5.4Western-blotting法檢測各組HCECs的AQP5和JNK1及p-JNK1蛋白表達情況將HCECs以3×105個/孔的密度接種于12孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)18～24h至細胞鋪滿瓶底85%左右，棄去舊培養(yǎng)基，分別給予正常等滲培養(yǎng)基和培養(yǎng)基滲透壓為500mOsm/L的含空白血清、0.3%玻璃酸鈉滴眼液、不同濃度杞參方顆粒含藥血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，收集細胞備用。相同實驗重復3次。提取各組細胞總蛋白質，BCA法測定蛋白質的濃度，然后根據(jù)每個樣品孔的吸光度，計算樣品的蛋白質濃度。調(diào)整蛋白濃度，變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離；300mA恒流模式電流轉膜1h。室溫封閉2h。將膜分別泡入一抗(1∶500)稀釋液抗體中，4℃孵育過夜。次日，回收一抗，將PVDF膜泡入TBST緩沖液中，洗膜5min×6次。將PVDF膜泡入山羊抗兔HRP標記的二抗(用TBST 1∶5000稀釋)中，于搖床緩慢搖動、室溫孵育2h?；厥斩?，將PVDF膜泡入TBST緩沖液中，洗膜5min×6次。將ECL發(fā)光試劑A和試劑B按照1∶1比例混合，滴在PVDF膜的蛋白面上，然后通過伯樂Imaging System化學發(fā)光成像分析儀成像。通過Quantity-one分析軟件對蛋白條帶進行OD定量分析。以目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶的OD比值來表示目的蛋白的相對表達水平。

統(tǒng)計學分析：采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1CCK-8法檢測各組HCECs存活率比較各組HCECs的存活率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與空白組相比，各組HCECs存活率均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比，各用藥組HCECs存活率均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與西藥組相比，杞參方高劑量組HCECs存活率顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其余各組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2ELISA法檢測各組細胞外液炎癥因子TNF-α和IL-6情況各組細胞外液炎癥因子TNF-α和IL-6比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與空白組相比，各組細胞外液炎癥因子TNF-α、IL-6表達水平均顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比，各用藥組的TNF-α、IL-6表達水平均減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與西藥組相比，杞參方各劑量組的TNF-α、IL-6表達水平均減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組細胞存活率和細胞外液TNF-α及IL-6含量比較

2.3免疫細胞化學法檢測各組HCECs凋亡因子caspase-1及AQP5的蛋白表達情況比較各組HCECs凋亡因子caspase-1及AQP5的蛋白表達情況比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與空白組相比，各組HCECs中caspase-1、AQP5蛋白表達水平均顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比，各用藥組的AQP5表達水平均減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；西藥組、杞參方高、中劑量組caspase-1表達水平較模型組均減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與西藥組相比，杞參方高劑量組caspase-1、AQP5及杞參方中劑量組的AQP5蛋白表達水平顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其余各組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2，圖1、2。

表2 各組細胞蛋白表達情況比較

圖1 免疫細胞化學法檢測各組caspase-1蛋白表達情況 A:空白組;B:模型組;C:西藥組;D:杞參方高劑量組;E:杞參方中劑量組;F:杞參方低劑量組。

2.4Westernblotting法檢測各組JNK1和p-JNK1及AQP5的蛋白表達情況比較Western blotting法檢測各組JNK1蛋白表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但p-JNK1和AQP5的蛋白表達情況比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與空白組相比，各組p-JNK1和AQP5蛋白表達均顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比，各組p-JNK1及杞參方高、中劑量組的AQP5蛋白表達均減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與西藥組相比，杞參方高、中劑量組AQP5蛋白表達水平減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2，圖3。

圖3 Western blotting法檢測各組JNK1和p-JNK1及AQP5的蛋白表達情況比較。

3討論

杞參方由杞菊地黃丸和生脈飲再加通草、黃精、葛根組合而成。杞菊地黃丸為滋陰潤目之名方。相關Meta分析[14-15]顯示，杞菊地黃丸聯(lián)合西藥治療干眼的療效要優(yōu)于西藥組。杞菊地黃丸不僅改善干眼的癥狀和無表面麻醉淚液分泌試驗(SchirmerⅠtest，SⅠt)，還可降低淚液中IL-1β、IL-8的表達水平[16]。生脈飲具有益氣養(yǎng)陰生津之效，亦有抑制細胞凋亡和抗氧化作用[17]。加葛根以補津液、通經(jīng)絡、升陽氣；加黃精補氣養(yǎng)陰，潤肺，健脾，益腎；加通草以行肺胃經(jīng)氣，清勢利水，通利三焦；諸藥同用，共奏益氣養(yǎng)陰生津之效。

與空白組相比，各組HCECs中p-JNK1蛋白表達水平均顯著增高；與模型組相比，杞參方用藥組HCECs中p-JNK1蛋白表達水平減少。Western blotting法檢測HECEs中JNK1蛋白表達，統(tǒng)計學比較差異均無統(tǒng)計學意義。在未受刺激的細胞內(nèi)，MAPK處于靜止狀態(tài)，處于細胞漿內(nèi)。當細胞受到相關因素刺激后，MAPK被激活而發(fā)生逐級磷酸化，磷酸化后的MAPK蛋白則會進入細胞核內(nèi)，故而出現(xiàn)如上結果。郭宣妮等[18]發(fā)現(xiàn)干眼組患者淚液中p-JNK1蛋白表達水平與淚膜破裂時間(break up time，BUT)和SⅠt均呈顯著負相關，與角膜熒光素染色(fluorescent，F(xiàn)L)評分呈顯著正相關，與本研究的模型組p-JNK1蛋白表達水平均顯著增高的結果一致。通過干預以JNK為核心的信號轉導通路可抑制干眼狀態(tài)下的炎性信號向細胞凋亡進行轉導[19-20]。杞參方可減少HCECs的JNK1的磷酸化的蛋白表達，可為杞參方對干眼起到抗炎及抗細胞凋亡的作用。本研究發(fā)現(xiàn)杞參方用藥組的HCECs細胞存活率顯著增加，且AQP5蛋白表達顯著減少。Ren 等[8]發(fā)現(xiàn)高滲環(huán)境刺激下的HCECs干眼模型的JNK的磷酸化和AQP5的表達均明顯升高，同時炎癥因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和凋亡因子caspase-1也升高，促進細胞的炎癥反應和凋亡，并且證實了JNK/AQP5通路在干眼模型中發(fā)揮了重要作用。Shankardas等[21]也證實AQP5的下調(diào)增加了HCECs的增殖和遷移。但是Kumari等[22]研究表明，上調(diào)AQP5在角膜上皮劃傷環(huán)境下通過促進細胞遷移和增殖，發(fā)揮促進角膜創(chuàng)傷愈合的獨特功能。出現(xiàn)以上截然不同的結果，考慮為在機械性角膜劃傷環(huán)境下，AQP5高表達可以促進角膜細胞向傷口位置遷移和增殖，從而修復角膜損傷，而一旦受傷區(qū)域被修復，則會對細胞遷移和增殖產(chǎn)生接觸抑制反應；而在高滲環(huán)境下，通過下調(diào)AQP5可以抑制炎癥反應與細胞凋亡，從而對HCECs進行保護作用。AQP5調(diào)控機制與角膜細胞所處環(huán)境而不同，因此設計針對AQP5的研究策略要有差異性。

圖2 免疫細胞化學法檢測各組AQP5蛋白表達情況 A:空白組;B:模型組;C:西藥組;D:杞參方高劑量組;E:杞參方中劑量組;F:杞參方低劑量組。

本研究發(fā)現(xiàn)杞參方治療組的TNF-α、IL-6明顯低于模型組，且HCECs存活率均顯著增加，證實杞參方可減少細胞外液炎癥因子TNF-α、IL-6的表達水平治療干眼。相關研究也證實，高滲透壓可通過JNK通路促進小鼠角膜上皮IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放，并促進細胞凋亡[23-24]。并且，干眼患者的淚液炎癥因子IL-6、TNF-α與眼部癥狀、BUT、SⅠt、FL及干眼程度密切相關，可作為反映疾病程度的靈敏、可靠的標志物[25-26]。本研究通過ELISA法檢測細胞外液炎性因子TNF-α、IL-6的表達作為炎癥指標，具有一定的科學性與研究意義。

綜上，杞參方可通過降低高滲誘導HCECs的JNK1的磷酸化和AQP5的蛋白表達，降低細胞外液炎癥因子TNF-α、IL-6和HCECs的凋亡因子caspase-1的表達，最終有效抑制炎癥反應和細胞凋亡。