王 嵐，李 妍，孫子雯，李玉婷，胡竹林

0引言

細(xì)菌性角膜炎(bacterial keratitis,BK)是臨床最常見(jiàn)的角膜炎之一，銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)和金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus,SAU)是BK的常見(jiàn)病原菌[1-3]，可極具破壞性地造成角膜組織損傷，并且易導(dǎo)致角膜瘢痕形成和角膜新生血管形成等后遺癥出現(xiàn)，造成視力永久性損傷。因此研究其發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)有效藥物就顯得尤為重要。白介素-17(interleukin-17,IL-17)是抵抗多種微生物，尤其是細(xì)胞外細(xì)菌和真菌的關(guān)鍵因子[4]。多項(xiàng)臨床及基礎(chǔ)研究表明IL-17參與了角膜炎的發(fā)生發(fā)展，但I(xiàn)L-17在角膜炎癥反應(yīng)中發(fā)揮保護(hù)作用還是破壞作用取決于感染的病原微生物和宿主的類(lèi)型[5-6]。建立穩(wěn)定、具有代表性的動(dòng)物模型，可以加快基礎(chǔ)研究發(fā)展的速度。本研究采用近年來(lái)研究眼科疾病新興的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樹(shù)鼩(tree shrew)構(gòu)建銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌性角膜炎動(dòng)物模型，并關(guān)注IL-17在樹(shù)鼩角膜炎模型發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)情況，初步探討IL-17在BK感染免疫中的作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康樹(shù)鼩6～12月齡72只，雌雄兼用，體質(zhì)量120±10g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供[SCXK(滇)K2020-0004]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室[SYXK(滇)K2020-0006]，所有操作符合昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求[倫理審批號(hào)：KMMU2020175]。

1.1.2實(shí)驗(yàn)菌株銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC29523)由云南大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。

1.1.3試劑與儀器胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB;Solarbio,北京)，胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA;Solarbio,北京),冷凍高速離心機(jī)(Heraeus,德國(guó))，前段照相儀(Topcon,日本)，共焦激光角膜顯微鏡(HRT,德國(guó))。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌懸液制備將活化后PA、SAU標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于TSA平板，置于37℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24～48h，分別挑取PA、SAU單菌落至TSB培養(yǎng)液中，置于37℃恒溫?fù)u床，180r/min轉(zhuǎn)速下，振蕩培養(yǎng)24h。取菌懸液在室溫下，以7500r/min轉(zhuǎn)速，離心5min，棄上清并用PBS重懸，用細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)菌濃度至1×109CFU/mL。

1.2.2動(dòng)物模型的建立均選取樹(shù)鼩右眼作為實(shí)驗(yàn)眼，并在實(shí)驗(yàn)前檢查，證實(shí)無(wú)眼前節(jié)疾病。72眼隨機(jī)分為3組，PA組、SAU組和生理鹽水對(duì)照組，每組各24眼。模型組樹(shù)鼩使用3%戊巴比妥鈉(2mL/kg)腹腔注射麻醉后，碘伏常規(guī)消毒術(shù)眼3遍，鋪一次性洞巾，鹽酸奧布卡因眼液點(diǎn)術(shù)眼，行表面麻醉。待麻醉生效后，使用5mm環(huán)鉆定位于角膜中央，輕壓環(huán)鉆，在角膜表面形成壓痕，在壓痕內(nèi)使用30G針頭在角膜表面制造“#”字型劃痕。分別吸取5μL PA菌懸液和SAU菌懸液(1×109CFU/mL)滴于劃痕處，待角膜表面菌液稍干燥后，覆蓋制備好的隱形眼鏡于角膜表面。使用5-0絲線縫合瞼緣。對(duì)照組操作步驟中除將滴加菌懸液5μL改為等量生理鹽水外，其余步驟同模型組。術(shù)后24h拆除縫線，觀察造模情況。

1.2.3感染癥狀觀察使用眼科裂隙燈行前段檢查，觀察感染癥狀。使用眼表活體共焦顯微鏡觀察角膜組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。觀察時(shí)間點(diǎn)為：接種細(xì)菌后第1、4、7、14d。

1.2.4組織病理學(xué)檢查在接種細(xì)菌后第1、4、7、14d隨機(jī)選取模型組和對(duì)照組樹(shù)鼩，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)過(guò)量麻醉處死3只樹(shù)鼩，在無(wú)菌環(huán)境下摘取角膜，制作石蠟切片。行蘇木素-伊紅(HE)染色后，觀察角膜組織的病理改變。

1.2.5感染菌鑒定將成功感染的樹(shù)鼩麻醉，用無(wú)菌手術(shù)刀片刮取病灶周?chē)M織，細(xì)菌培養(yǎng)后使用CTAB法[7]對(duì)細(xì)菌DNA提取，進(jìn)行DNA擴(kuò)增測(cè)序后鑒定感染菌種，確定角膜炎模型是否建立成功。

1.2.6檢測(cè)IL-17在樹(shù)鼩BK模型中的表達(dá)造模后第1、4、7、14d各時(shí)間點(diǎn)對(duì)模型組和對(duì)照組樹(shù)鼩角膜進(jìn)行取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組處死3只樹(shù)鼩，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量，ELISA檢測(cè)IL-17蛋白表達(dá)。樹(shù)鼩IL-17及內(nèi)參GAPDH基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2結(jié)果

2.1裂隙燈檢查結(jié)果對(duì)照組樹(shù)鼩在角膜損傷后可看見(jiàn)劃痕處角膜上皮缺損，并未見(jiàn)炎癥反應(yīng)。第7d時(shí)上皮已完全再生，角膜完全恢復(fù)透明。模型組樹(shù)鼩在裂隙燈下觀察，感染1d后已出現(xiàn)角膜水腫、炎性滲出及基質(zhì)混濁。感染4d后，角膜浸潤(rùn)加重，范圍擴(kuò)大至全角膜。感染7d后，周?chē)悄に[較前減輕，病灶逐漸局限，膿性分泌減少。感染14d后，炎癥進(jìn)一步減輕，角膜上皮逐漸修復(fù)，周?chē)悄ら_(kāi)始恢復(fù)透明(圖1)。

圖1 裂隙燈檢查結(jié)果(×16) A、B、C、D分別為對(duì)照組樹(shù)鼩角膜損傷后1、4、7、14d的前段照相圖片;E、F、G、H分別為PA組樹(shù)鼩感染后1、4、7、14d的前段照相圖片；I、J、K、L分別為SAU組樹(shù)鼩感染后1、4、7、14d的前段照相圖片。

2.2共聚焦顯微鏡檢查結(jié)果共聚焦檢查結(jié)果顯示，對(duì)照組樹(shù)鼩角膜僅有上皮組織結(jié)構(gòu)稍有改變，基質(zhì)層及內(nèi)皮層組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)正常。第7d時(shí)上皮缺損已完全修復(fù)。在共聚焦顯微鏡下，模型組樹(shù)鼩角膜感染后1d，角膜上皮可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)不清。感染后4d，基質(zhì)層可見(jiàn)大量的炎癥細(xì)胞聚集，形成塊狀的高反光區(qū)壞死區(qū)域。感染后7d，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，高反光區(qū)域減少。14d時(shí)角膜上皮開(kāi)始進(jìn)行修復(fù)，僅見(jiàn)少量的炎癥細(xì)胞反光影，可重見(jiàn)角膜上皮細(xì)胞(圖2)。

圖2 角膜組織活體共聚焦檢查(×800) A、B、C、D分別為對(duì)照組樹(shù)鼩角膜損傷后1、4、7、14d共聚焦顯微鏡下的表現(xiàn)；E、F、G、H分別為PA組樹(shù)鼩角膜感染后1、4、7、14d共聚焦顯微鏡下的表現(xiàn)；I、J、K、L分別為SAU組樹(shù)鼩角膜感染后1、4、7、14d共聚焦顯微鏡下的表現(xiàn)。

2.3組織病理學(xué)檢查結(jié)果對(duì)照組樹(shù)鼩在角膜損傷后1d，可在劃痕損傷部位見(jiàn)角膜上皮脫落。損傷后第4d，角膜逐漸修復(fù)，仍可看見(jiàn)劃痕部分的上皮細(xì)胞缺損。第7d,角膜上皮層已趨于平整，但上皮細(xì)胞僅生長(zhǎng)1～2層。第14d，在HE染色下可見(jiàn)角膜上皮具有完整的結(jié)構(gòu)和正常的細(xì)胞形態(tài)，角膜各層連接緊密。模型組樹(shù)鼩感染后1d的角膜組織HE染色可見(jiàn)角膜上皮缺如，炎癥細(xì)胞募集于角膜基質(zhì)。感染后4d，基質(zhì)層炎癥細(xì)胞有更廣范圍的浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞為主，并且角膜組織腫脹明顯，SAU組樹(shù)鼩角膜甚至出現(xiàn)纖維素性滲出、細(xì)胞壞死，形成潰瘍?cè)?。感染?d，炎癥細(xì)胞的數(shù)量已減少，角膜上皮開(kāi)始生長(zhǎng)修復(fù)。感染后14d角膜上皮基本修復(fù)，但基質(zhì)內(nèi)仍有少量炎癥細(xì)胞和壞死組織，且易形成瘢痕(圖3)。

圖3 角膜病理切片 A、B、C、D分別為對(duì)照組樹(shù)鼩角膜損傷后1、4、7、14d的HE染色結(jié)果;E、F、G、H分別為PA組樹(shù)鼩角膜感染后1、4、7、14d的HE染色結(jié)果;I、J、K、L分別為SAU組樹(shù)鼩角膜感染后1、4、7、14d的HE染色結(jié)果。

2.4菌種鑒定模型組樹(shù)鼩角膜組織進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)后提取DNA并進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。將測(cè)序樣本的DNA與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中DNA序列進(jìn)行比對(duì)，并使用MEGA7軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。比對(duì)結(jié)果顯示PA組測(cè)序樣本屬于假單胞桿菌屬，與PA的同源性為100%(圖4A)，SAU組建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也證實(shí)了該菌與SAU的DNA有100%的相似性(圖4B)。DNA鑒定結(jié)果表明PA模型組和SAU模型組樹(shù)鼩感染的病原微生物與所接種的菌種一致。

若路燈上電時(shí)間不離散，當(dāng)大量路燈同時(shí)接入網(wǎng)絡(luò)時(shí)，會(huì)對(duì)網(wǎng)絡(luò)造成一定沖擊。建議采取隨機(jī)數(shù)*離散間隔的方式，來(lái)區(qū)分不同路燈終端的接入時(shí)間，具體模型建議如下：

圖4 模型組測(cè)序樣本的基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) A：PA組；B：SAU組。

2.5感染成功率PA組24只實(shí)驗(yàn)眼僅有1眼未出現(xiàn)角膜炎癥臨床表現(xiàn)，并且刮取角膜組織未見(jiàn)微生物生長(zhǎng)，其余23只實(shí)驗(yàn)眼均可見(jiàn)PA感染病灶，造模成功率為96%。SAU組所有實(shí)驗(yàn)眼均可觀察到明顯的角膜感染癥狀，造模成功率為100%。

2.6IL-17在樹(shù)鼩BK模型中的表達(dá)QPCR結(jié)果表明，對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。感染后第1d，SAU組和PA組的IL-17 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第4d，兩個(gè)模型組的IL-17 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。感染后第7d，SAU組和PA組的表達(dá)量較前減少(P<0.01)，到14d時(shí)繼續(xù)降低，降至與感染初期水平相似，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。比較相同時(shí)間點(diǎn)SAU組與PA組角膜IL-17 mRNA的表達(dá)量，除了感染后第4d SAU組的表達(dá)量高于PA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其余各時(shí)間點(diǎn)兩組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SAU組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，除了第1、14d IL-17mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PA組，除第4d所呈現(xiàn)的較高的IL-17 mRNA表達(dá)量與第1、7、14d有顯著差異(P<0.01)，其余各時(shí)間點(diǎn)間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2，圖5。

表2 三組樹(shù)鼩不同時(shí)間點(diǎn)角膜IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖5 不同組別樹(shù)鼩角膜IL-17 mRNA的表達(dá) aP<0.05 vs 對(duì)照組1d；dP<0.01 vs 對(duì)照組4d；fP<0.01 vs 對(duì)照組7d；gP<0.05 vs 對(duì)照組14d；jP<0.01 vs SAU組4d；lP<0.01 vs SAU組7d；nP<0.01 vs PA組4d。

ELISA檢測(cè)的SAU組和PA組角膜IL-17蛋白濃度變化趨勢(shì)一致，感染后1d，IL-17蛋白表達(dá)升高，感染后第4d達(dá)到高峰，隨后表達(dá)量降低，整個(gè)病程中，兩個(gè)模型組IL-17蛋白濃度均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，相同時(shí)間點(diǎn)SAU組與PA組角膜IL-17蛋白濃度間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SAU組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，除了第1、7d IL-17蛋白濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PA組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較與SAU組相似，除了第1、7d IL-17蛋白濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3，圖6。

圖6 不同組別樹(shù)鼩角膜IL-17蛋白的表達(dá)量 aP<0.01 vs 對(duì)照組1d；dP<0.01 vs 對(duì)照組4d；fP<0.01 vs 對(duì)照組7d；hP<0.01 vs 對(duì)照組14d；jP<0.01 vs SAU組4d；lP<0.01 vs SAU組14d；nP<0.01 vs PA組4d;pP<0.01 vs PA組14d。

表3 三組樹(shù)鼩不同時(shí)間點(diǎn)角膜IL-17蛋白表達(dá)量

3討論

目前用于研究角膜炎的動(dòng)物模型種類(lèi)較多，但尋找一種生理病理狀態(tài)更接近人類(lèi)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)于研究角膜炎發(fā)病機(jī)制、治療靶點(diǎn)和藥物研究則更有意義[8]。樹(shù)鼩與人的親緣關(guān)系較近，并且角膜組織結(jié)構(gòu)完整，各層在角膜總厚度的占比也與人類(lèi)非常相似[9]，研究角膜疾病比兔和鼠更具有優(yōu)勢(shì)，是建立角膜炎的理想動(dòng)物模型[10-11]。目前已有學(xué)者利用樹(shù)鼩成功建立了真菌性和病毒性角膜炎模型[12-14]，但至今未見(jiàn)有細(xì)菌性的樹(shù)鼩角膜炎動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)菌性角膜炎中較為常見(jiàn)且破壞性強(qiáng)的PA和SAU作為感染菌株，樹(shù)鼩作為造模動(dòng)物構(gòu)建細(xì)菌性角膜炎模型。

本次研究?jī)蓚€(gè)模型組成功感染的樹(shù)鼩中除了SAU組有1眼出現(xiàn)了角膜穿孔，PA組有1眼未感染成功，其余的都呈現(xiàn)完整的病程發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。感染后的臨床表現(xiàn)與活體共聚焦顯微鏡檢查、病理組織學(xué)結(jié)果相符。SAU組和PA組雖然在臨床表現(xiàn)上稍有不同，但是總體趨勢(shì)相同。感染后1d的樹(shù)鼩呈現(xiàn)出角膜水腫，淺基質(zhì)層有炎性浸潤(rùn)。隨后炎癥反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，感染第4d病情最為嚴(yán)重，角膜混濁加重，炎性滲出增多，共聚焦顯微鏡檢查可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞聚集，角膜結(jié)構(gòu)被破壞，病理切片結(jié)果表明角膜組織腫脹明顯，炎細(xì)胞浸潤(rùn)至全基質(zhì)層。樹(shù)鼩感染7d時(shí)，角膜炎癥反應(yīng)開(kāi)始消退，炎癥細(xì)胞減少，角膜上皮從周?chē)蛑醒肟焖龠M(jìn)行重構(gòu)，第14d角膜大部分已逐漸透明，可見(jiàn)虹膜和瞳孔，HE染色可見(jiàn)角膜上皮已基本修復(fù)，共聚焦顯微鏡檢查也重見(jiàn)角膜組織結(jié)構(gòu)。從病理切片中觀察到，樹(shù)鼩細(xì)菌性角膜炎發(fā)生時(shí)，炎性細(xì)胞主要以中性粒細(xì)胞為主，其中第4d為炎癥高峰期，中性粒細(xì)胞數(shù)量最多，且聚集于變性壞死組織周?chē)?，與臨床表現(xiàn)相符。這與樹(shù)鼩真菌性角膜炎的情況類(lèi)似[12,15]，但不同的是，樹(shù)鼩角膜感染鐮刀菌后期可見(jiàn)單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，而在本研究中，模型組整個(gè)病程都為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，即使進(jìn)入愈合期，也少見(jiàn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。這可能是樹(shù)鼩對(duì)真菌和細(xì)菌的易感性不同，啟動(dòng)的免疫機(jī)制有所不同或啟動(dòng)時(shí)間存在差異。

IL-17是固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁[16]，可發(fā)揮多種作用。在Taylor等[5]的研究中，小鼠真菌性角膜炎的保護(hù)性免疫與IL-17有關(guān)。小鼠感染曲霉菌和鐮刀菌48h后，角膜感染臨床表現(xiàn)最為嚴(yán)重，ELISA結(jié)果也顯示IL-17在感染后48h表達(dá)量最高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，采用抗IL-17治療的小鼠角膜未檢測(cè)出IL-17，并且角膜混濁比未接種中和抗體的小鼠更為嚴(yán)重。然而Me等[17]和De Winter等[18]的研究都證明在小鼠銅綠假單胞菌性角膜炎模型中，在炎癥高峰對(duì)IL-17進(jìn)行阻斷，角膜病理?yè)p傷可減輕，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)菌負(fù)荷量減少，證明了IL-17發(fā)揮了病理作用。在我們的研究中，IL-17的表達(dá)水平與樹(shù)鼩角膜感染嚴(yán)重程度呈正相關(guān),這一表達(dá)趨勢(shì)與小鼠細(xì)菌和真菌性角膜炎的相關(guān)研究相似。但I(xiàn)L-17在樹(shù)鼩BK中介導(dǎo)組織損傷還是保護(hù)性免疫無(wú)法確定。在本實(shí)驗(yàn)中IL-17的表達(dá)在PA和SAU組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，樹(shù)鼩角膜感染SAU和PA后，IL-17在BK的發(fā)生發(fā)展所起的作用可能具有相似性，為探討IL-17在BK中所起的具體作用提供了理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于雖然SAU組和PA組成功感染的樹(shù)鼩到觀察終點(diǎn)病情都趨于好轉(zhuǎn)，但觀察期太短，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可延長(zhǎng)觀察時(shí)間，以期能更好地觀察完整的病程。并且僅研究了IL-17在樹(shù)鼩BK中的表達(dá)情況，下一階段可進(jìn)一步研究IL-17的細(xì)胞來(lái)源及IL-17參與樹(shù)鼩BK的具體作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)樹(shù)鼩對(duì)PA、SAU易感，在未使用免疫抑制劑的情況下，僅使用劃痕法即可建立高感染率的角膜炎模型。該模型建立方法難度適中，具有較高可重復(fù)性，是開(kāi)展銅綠假單胞菌性角膜炎和金黃色葡萄球菌性角膜炎基礎(chǔ)研究的良好模型。與此同時(shí)，IL-17參與樹(shù)鼩金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌性角膜炎發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。但還需明確IL-17在樹(shù)鼩角膜抗菌免疫中所起其具體作用是快速啟動(dòng)炎癥反應(yīng)清除細(xì)菌控制感染，還是放大炎癥效應(yīng)，造成組織感染。