張俊華，楊松潤，彭莉莉，王 亮，楊明秀，徐曉鳳，倪 哲，李培寧

（東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030）

近年來，黑龍江省水稻播種面積逐年增加，但因氣溫變化大、播種密度大和管理防控措施不到位等情況，黑龍江省水稻立枯病發(fā)生嚴重，秧苗大面積死亡，嚴重影響水稻品質與產量[1]。

尖孢鐮孢菌（FusariumoxysporumSchelcht）是引起水稻立枯病主要病原真菌。該菌可侵染100多種不同植物[2]，根據(jù)其植物寄主范圍，如雙子葉植物豆類、單子葉植物香蕉等，表現(xiàn)出復雜的致病特性和遺傳多樣性[3]，被列為世界第5大植物病原真菌[4]。尖孢鐮孢菌主要通過分泌細胞壁降解酶和毒素侵害宿主植物[5-6]。細胞壁降解酶負責降解細胞壁，促進尖孢鐮孢菌侵入與增殖，其中降解產生的果膠阻塞宿主植物導管導致萎蔫[7]。毒素抑制宿主植物防御反應，促進病菌侵染[6]。Zhang等發(fā)現(xiàn)尖孢鐮孢菌具有譜系特異性染色體，宿主范圍廣泛[8]。由于尖孢鐮孢菌遺傳背景復雜，水稻立枯病防治主要集中在化學藥劑上，缺少高效防治方法。認識水稻立枯病菌致病機制是減輕病害重要手段，是尋求水稻秧苗發(fā)病有效防治策略的重要突破口[9]。

根癌農桿菌介導的遺傳轉化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）自1995年成功轉化釀酒酵母，至今已有100多種真菌轉化體系構建成功[10]。該方法可使T-DNA隨機插入真菌基因組，打斷不同位點基因，獲得大量突變體。具有操作簡單、轉化效率高、單次插入概率高的優(yōu)點，被廣泛用于了解宿主與病原物相互作用機制[11]。目前，關于水稻立枯病菌多集中在生物學特性、致病力分化和遺傳多樣性分析等方面研究，未見水稻立枯病菌致病機理的報道[12]。明確水稻立枯病菌致病力關聯(lián)基因及功能，深入解析水稻立枯病菌致病分子機制，對農田水稻立枯病防控具有重要意義。

本研究利用ATMT建立尖孢鐮孢菌T-DNA突變體庫，獲得具有對真菌發(fā)育有影響和致病力降低的T-DNA插入突變體，定位到突變位點。該信息有助于確定新的致病位點，為深入鑒定基因功能提供研究方向，為水稻立枯病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料、菌株及質粒

供試水稻品種為龍粳31；供試菌株為Fo21，東北農業(yè)大學植物病理教研室從水稻立枯病株分離獲得高致病力尖孢鐮孢菌菌株，根癌農桿菌AGL-1和雙元載體pBHt2用于尖孢鐮孢菌遺傳轉化，由吉林大學秦慶明教授和張世宏教授饋贈。質粒pBHt2具有潮霉素抗性表達框，試驗開始前轉入根癌農桿菌AGL-1中備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potatodextrose agar，PDA）；LB培養(yǎng)基（Luria-bertani，LB）；誘導培養(yǎng)基（Induction medium，IM），按張鍵等方法配置[13]。

1.1.3 主要試劑

抗生素（利福平、卡那霉素、潮霉素B、頭孢霉素、羧芐霉素）、乙酰丁香酮、嗎啉乙磺酸和其他藥劑國產分析純均購自北京酷來搏科技有限公司；2×TaqPCR Master Mix購自北京康為世紀生物科技有限公司；限制性內切酶EcoRⅠ購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；地高辛雜交檢測試劑盒Ⅱ購自羅氏公司；膠回收純化試劑盒購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 尖孢鐮孢菌突變體構建

參考Mullins等方法進行農桿菌介導遺傳轉化[14]，并稍有改進。將含有雙元載體pBHt2的根癌農桿菌AGL-1在含有25μg·mL-1利福平和50μg·mL-1卡那霉素LB固體培養(yǎng)基中劃線活化，挑單菌落加入與上述相同濃度抗生素LB液體培養(yǎng)基，28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～16 h。取1 mL菌液7 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，沉淀使用IM液體培養(yǎng)基清洗兩次，最終加入1 mL含有200μmol·L-1乙酰丁香酮IM液體培養(yǎng)基，28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)4～6 h。將誘導菌液使用含有200μmol·L-1乙酰丁香酮IM液體培養(yǎng)基稀釋至OD600≈0.3，以1∶1體積比將誘導菌液和106個·mL-1分生孢子混勻。取200μL混合液涂布在覆蓋無菌玻璃紙的含200μmol·L-1乙酰丁香酮IM固體培養(yǎng)基中，25℃完全黑暗條件下培養(yǎng)2 d。然后取下玻璃紙，轉移至含有150μg·mL-1頭孢霉素、300μg·mL-1羧芐霉素和80μg·mL-1潮霉素B的PDA固體培養(yǎng)基上，其中150μg·mL-1頭孢霉素、300μg·mL-1羧芐霉素用于避免根癌農桿菌AGL-1生長，80μg·mL-1潮霉素B用于篩選尖孢鐮孢菌突變體。在25℃培養(yǎng)2 d后揭去玻璃紙，待長出突變菌落后，轉移至含有80μg·mL-1潮霉素B的PDA固體培養(yǎng)基。

1.2.2 CTAB法提取病原菌突變體DNA

參考Kuhad等DNA提取方法[15]，稍加改進，刮取菌絲用液氮研磨，將其放入1.5 mL離心管中。取650μL預熱CTAB緩沖液加入離心管中并于55℃金屬浴1 h。加入等量氯仿/異戊醇（24∶1）緩慢搖勻，12 000 r·min-1離心15 min。吸取上清于新1.5 mL離心管中，再次加入等量氯仿/異戊醇（24∶1）緩慢搖勻，12 000 r·min-1離心10 min。吸取上清于新1.5 mL離心管中，加入2.5倍體積預冷無水乙醇，-20℃沉淀1 h，12 000 r·min-1離心15 min，將沉淀使用70%酒精洗滌并在通風廚中吹干殘留酒精，30～50μL ddH2O溶解。

1.2.3 陽性突變體PCR鑒定

根據(jù)質粒pBHt2的T-DNA片段上潮霉素抗性片段，通過Primer Premier 6設計并使用引物對HPH-F:TCGCCCTTCCTCCCTTTATTTCAG和HPHR:CTACACAGCCATCGGTCCAGAC作PCR驗證，檢測突變體T-DNA插入片段。PCR反應體系為：5μL 2×Taq PCR Master Mix(Dye)、0.4μL上游引物、0.4μL下游引物、0.5μL基因組DNA，ddH2O補至10μL。PCR反應程序根據(jù)康為世紀2×TaqPCRMaster Mix(Dye)商品說明書操作。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.2.4 突變體遺傳穩(wěn)定性測定

隨機選擇10個突變體在不含抗生素PDA固體培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d，并在相同條件下轉接培養(yǎng)4次，最后接種在含80μg·mL-1潮霉素B抗性的PDA固體培養(yǎng)基上，根據(jù)突變體生長情況判斷突變體是否穩(wěn)定遺傳。

1.2.5 致病力測定

參考Klosterman等分生孢子浸根接種方法測定致病力[16]，并稍改進，使用打孔器打2個直徑為5 mm菌餅加入到PDA液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)3 d；使用無菌紗布過濾，并用血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子數(shù)量，調整至107個·mL-1分生孢子懸浮液；取30 mL 107個·mL-1分生孢子懸浮液接種至水稻幼苗根系，以無菌水為對照。分級標準和病情指數(shù)計算公式參照劉金鑫方法[17]。

1.2.6 生長速率測定

使用打孔器打直徑為5 mm突變體菌餅接種到PDA固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d，以野生型Fo21為對照，觀察菌落生長速度。每個菌株3次重復。

1.2.7 孢子產量測定

使用打孔器打直徑為5 mm突變體菌餅接種到PDA固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)10 d，加入5 mL無菌水并使用無菌毛筆刮取分生孢子，使用無菌紗布過濾并用血球計數(shù)板測定分生孢子產量。每個菌株3次重復。

1.2.8 Southern blot檢測

檢測方法按照地高辛雜交檢測試劑盒Ⅱ（Roche）操作指南進行。首先，采用CTAB法提取致病力降低突變體DNA，使用EcoR I將基因組DNA酶切，酶切片段通過電泳在1%瓊脂糖凝膠上分離，然后轉移至帶正電尼龍膜上。使用HPH-F和HPH-R引物PCR擴增并作DIG標記，最后將尼龍膜與DIG標記的探針雜交、洗膜和免疫檢測。

1.2.9 側翼序列擴增

利用Hi TAIL-PCR擴增T-DNA插入位點左右兩端側翼未知序列，分別在T-DNA左臂和右臂邊界處設計特異性嵌套引物為L1～L3和R1～R3，并與簡并引物LAD1～LAD4和接頭序列AC1組合進行三輪PCR（見表1）。第一次PCR反應體系為：12.5μL 2×TaqPCR Master Mix(Dye)、1μL特異性引物L1/R1、1μL簡并引物LAD、9.5μL ddH2O、1μL基因組DNA。第二次PCR反應體系為：12.5μL 2×TaqPCR Master Mix(Dye)、1μL特異性引物L2/R2、1μL接頭序列引物AC1、9.5μL ddH2O、1μL稀釋40倍的第一次PCR產物。第三次PCR反應體系為：25μL 2×TaqPCR Master Mix(Dye)、2μL特異性引物L3/R3、2μL接頭序列引物AC1、19μL ddH2O、2μL稀釋10倍的第二次PCR產物。反應程序參考Liu等擴增方法[18]。

表1 Hi TAIL-PCR引物序列Table 1 Hi TAIL-PCR primer sequence

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析，若P＜0.05，則差異顯著。

2 結果與分析

2.1 尖孢鐮孢菌T-DNA突變體構建

根癌農桿菌與尖孢鐮孢菌共培養(yǎng)后，通過抗生素篩選，每個平板長出150～200個突變體（見圖1A），隨機選取10個突變體并利用引物對HPH-F和HPH-R進行PCR驗證，發(fā)現(xiàn)除野生型Fo21外均擴增出1 000 bp左右片段（見圖1B），說明T-DNA片段成功插入尖孢鐮孢菌基因組中，構建尖孢鐮孢菌T-DNA突變體。

圖1 尖孢鐮孢菌突變體篩選與鑒定Fig.1 Screening and identification of Fusarium oxysporum mutants

2.2 突變體遺傳穩(wěn)定性測定

在不含抗生素選擇壓力下培養(yǎng)4代后轉移至80μg·mL-1潮霉素B抗性的PDA固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3 d，以野生型Fo21為對照，發(fā)現(xiàn)突變體仍正常生長（見圖2）。說明多次轉接培養(yǎng)的突變體仍具有潮霉素B抗性，表明T-DNA可穩(wěn)定插入尖孢鐮孢菌基因組中，不隨抗生素缺失而丟失，適合用于后續(xù)致病力降低突變體的篩選。

圖2 突變體遺傳穩(wěn)定性測定Fig.2 Determination of genetic stability in mutants

2.3 致病力降低突變體篩選

從691個突變體中選取34個菌落形態(tài)變化的突變體測定致病力（見圖3）。以野生型Fo21為對照，有16個突變體致病力顯著降低，分別降低15.36%～76.92%。選取其中致病力降低最為嚴重的6個突變體B9、B92、C36、D65、E17、F78開展后續(xù)研究。

圖3 致病力降低突變體篩選Fig.3 Screening for mutantswith reduced pathogenicity

2.4 致病力降低突變體菌落形態(tài)特征

25℃培養(yǎng)7 d后，觀察致病力降低突變體菌落形態(tài)變化（見圖4）。與野生型Fo21相比，發(fā)現(xiàn)突變體B9、C36、D65、E17、F78產生大量氣生菌絲，突變體B92、C36、D65、E17菌落色素產生異常，其中突變體B92最終形成純白色菌落。

圖4 野生型菌株Fo21和6個致病力降低的突變體菌落形態(tài)特征比較Fig.4 Comparison of colony morphology of wild type Fo21 and six mutants with reduced pathogenicity

2.5 致病力降低突變體生長速率

25℃培養(yǎng)7 d后，測定致病力降低突變體菌落直徑（見圖5），與野生型Fo21（8.32 cm）相比，4個突變體B9、C36、D65、E17生長速率顯著降低，其菌落直徑分別為7.10、7.47、5.34、5.51 cm。突變體B92和F78菌落直徑分別為8.29和8.27 cm，與野生型菌株差異不顯著。

圖5 野生型菌株Fo21和6個致病力降低的突變體菌落直徑測定Fig.5 Colony diameter of wild type Fo21 and six mutantswith reduced pathogenicity

2.6 致病力降低突變體產孢量分析

25℃培養(yǎng)10 d后，測定孢子產量（見圖6）。6個突變體B9、B92、C36、D65、E17、F78產孢數(shù)量分別為2.56×107、3.15×107、1.12×107、0.73×107、1.0×107、2.96×107個·mL-1，與野生型Fo21（3.81×107個·mL-1）相比，均顯著降低。分別降低32.81%、17.32%、70.60%、80.84%、73.75%、22.31%。

圖6 野生型菌株Fo21和6個致病力降低的突變體孢子產量測定Fig.6 Number of conidia of wild type Fo21 and six mutants with reduced pathogenicity

2.7 Southern blot分析

利用Southern blot檢測T-DNA插入數(shù)量（見圖7）。以野生型Fo21為對照，發(fā)現(xiàn)突變體B92有2個條帶，其余突變體B9、C36、D65、E17、F78僅有一個條帶，說明突變體B92有2個T-DNA插入到基因組中，其余突變體均有1個T-DNA插入到基因組。

圖7 致病力降低突變體Southern blot檢測Fig.7 Southern blot analysis of mutants with reduced pathogenicity

2.8 致病力降低突變體側翼序列分析

對6個致病力降低的突變體進行Hi TAIL-PCR擴增（見圖8）。結果表明，第一輪擴增，特異性較差，幾乎無條帶；第二輪擴增，特異性較強，獲得清晰條帶；第三輪擴增，特異性進一步增強，第二輪與第三輪擴增片段相差100 bp左右，與試驗設計一致，表明成功擴增T-DNA突變體插入位點的側翼序列。

圖8 6個致病力降低突變體插入位點側翼序列擴增Fig.8 Amplification of insertion sites flanking sequence of six mutants with reduced pathogenicity

對上述T-DNA插入位點側翼序列使用膠回收純化試劑盒純化后送至上海生工生物工程股份有限公司獲得序列信息，在NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，確定T-DNA插入到尖孢鐮孢菌不同基因位點，主要有3種T-DNA插入位點類型，分別為基因上游、基因編碼區(qū)和基因下游（見表2）。

表2 6個致病力降低突變體插入位點分析Table 2 Analysis of insertion sites of six mutants with reduced pathogenicity

3 討論與結論

篩選水稻立枯病菌致病相關基因有助于深入了解和防治水稻立枯病，為發(fā)現(xiàn)水稻立枯病新防治手段提供理論依據(jù)。因原生質體轉化方法受裂解酶、原生質體質量與數(shù)量影響，而ATMT克服對原生質體的依賴，孢子、菌絲等均可作為轉化材料。近年來ATMT已成為絲狀真菌T-DNA插入突變常用手段，可成功篩選致病相關新位點[19-20]。

突變體穩(wěn)定遺傳是后續(xù)功能基因注釋和生物學特性研究基礎，Martínez-Cruz等發(fā)現(xiàn)突變體可能發(fā)生T-DNA丟失而恢復野生型，與基因組中大量轉座子有關。例如，在白粉菌中，突變體僅在有抗生素情況下才穩(wěn)定存在[21]。本研究成功構建尖孢鐮孢菌T-DNA突變體庫，對尖孢鐮孢菌突變體遺傳穩(wěn)定測試表明，潮霉素B抗性特性可穩(wěn)定遺傳給后代，利用ATMT研究可進一步篩選致病位點、基因功能研究。但尖孢鐮孢菌僅從根部侵染，發(fā)病周期緩慢，導致土傳病原真菌研究滯后。本研究采用分生孢子浸根接種方法篩選致病力降低的突變體，與傳統(tǒng)方法相比，癥狀更明顯，發(fā)病時間更短[16]，最終通過測定34個菌落形態(tài)變化突變體致病力，獲得16個致病力降低的突變體，選取其中6個致病力降低最為嚴重的突變體測定生長速度和孢子產量，其突變體菌絲生長和產孢量也發(fā)生變化，說明突變體T-DNA插入位點可能影響尖孢鐮孢菌生長發(fā)育、致病力等方面，因此鑒定6個致病力降低突變體T-DNA插入數(shù)量和位點。Southern blot結果表明6個致病力降低的突變體中有一個突變體B92為兩個T-DNA插入，其余均為單個T-DNA插入，與Chen等研究T-DNA插入具有高單個插入頻率一致[22-24]，說明更大概率為單個位點發(fā)生突變，可高效篩選導致表型、致病力等變化的基因。目前用于擴增側翼序列方式較多，如反向PCR、質粒拯救、外源接頭PCR、熱不對稱性PCR等。其中反向PCR受限制性內切酶影響且易形成假陽性片段，質粒拯救雖效率高但操作繁雜，外源接頭PCR受限制性內切酶影響且效率較低[25-26]。熱不對稱性PCR主要是基于特異性引物與簡并引物進行高和低退火溫度交替循環(huán)組成。本次參考Liu等方法加入接頭序列，提高熱不對稱性PCR效率[18]。6個致病力降低突變體的T-DNA插入位點側翼未知序列被成功擴增，隨后在NCBI上作Blast比對，得到插入位點。

本研究首次篩選水稻立枯病菌致病位點，發(fā)現(xiàn)使用ATMT可短時間內獲得大量突變體，成功篩選到致病力顯著降低的突變體，確定T-DNA插入數(shù)量和位點，為水稻立枯病發(fā)病原因提供更深層次理解，為基因功能研究提供候選條件，為發(fā)現(xiàn)水稻立枯病菌新致病機制提供可能。