曾衛(wèi)湘，張 穎，張建文，鄧 瓊，梁 輝，張劍波，王 鑄

(1.河源長(zhǎng)安醫(yī)院泌尿外科,廣東河源 517000； 2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳龍華醫(yī)院泌尿外科,廣東深圳 518109)

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是最常見的男性惡性腫瘤之一[1]。雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy,ADT)可以有效減緩腫瘤進(jìn)展、提高患者生活質(zhì)量，但是隨著病程進(jìn)展，激素依賴型轉(zhuǎn)化為去勢(shì)抵抗前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)[2-3]。研究表明，多種細(xì)胞因子、激酶以及下游級(jí)聯(lián)信號(hào)因子通過雄激素受體(androgenreceptor,AR)相互作用或雄激素非依賴途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[2]。在低水平激素環(huán)境下其他替代途徑，包括MAPK通路、Wnt/β-catenin以及c-Myc等信號(hào)在促進(jìn)CRPC轉(zhuǎn)化過程中也發(fā)揮重要作用[2, 4]。目前針對(duì)AR介導(dǎo)的CRPC轉(zhuǎn)化，人們已開發(fā)了多個(gè)靶向藥物，如AR拮抗劑恩雜魯胺、雄激素合成關(guān)鍵酶CYPl7阻斷劑阿比特龍、PARP抑制劑等[5-6]；多靶點(diǎn)藥物如Cabozantinib封閉c-Met、VEGFR2、KIT等多個(gè)蛋白[7]；Galeterone同時(shí)阻斷AR及CYPl7A1活性[8]，但是針對(duì)AR相互作用因子的綜合性研究尚鮮見報(bào)道。本研究篩選了AR及其9個(gè)相互作用因子，系統(tǒng)分析了AR及其相互作用因子在PCa中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系，揭示了其相互作用及GO功能富集，為PCa進(jìn)展機(jī)制研究及其預(yù)后評(píng)估提供了一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 STRING 分析STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)是一個(gè)旨在收集、評(píng)估和整合蛋白質(zhì)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)。目前該數(shù)據(jù)庫存儲(chǔ)約14 094個(gè)物種的6 760萬個(gè)蛋白質(zhì)，有超過20億個(gè)蛋白相互作用信息。本研究通過STRING數(shù)據(jù)庫分析AR蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中不同顏色連線代表相互作用確定的不同依據(jù)，包括基于認(rèn)證過的數(shù)據(jù)庫、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、基因鄰近、共表達(dá)、同源推測(cè)和文本挖掘等?；緟?shù)設(shè)置為Interaction score 大于0.4，物種設(shè)定為 Homo sapiens。

1.2 UALCAN 分析UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)是一個(gè)用于分析癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)的全面、交互式網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)。UALCAN可訪問包括TCGA和CBTTC等數(shù)據(jù)庫，可提供諸如描述蛋白質(zhì)編碼、miRNA編碼和lincRNA編碼基因的表達(dá)譜和患者生存信息的圖表和繪圖等功能。本研究利用從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)項(xiàng)目獲得的數(shù)據(jù)，輸入Prostatecancer，獲得正常對(duì)照組樣本52例，腫瘤樣本497例，分別比較分析了AR及其相互作用因子基因在對(duì)照組以及腫瘤組中的表達(dá)水平。

1.3 cBioPortal分析cBioPortal(https://www.cbioportal.org/)是基于TCGA數(shù)據(jù)庫，集數(shù)據(jù)挖掘、數(shù)據(jù)整合及可視化的綜合性開放平臺(tái)。整合了包括TCGA，GEO和ICGC等腫瘤研究項(xiàng)目。數(shù)據(jù)類型包括體細(xì)胞突變、DNA copy-number alterations(CNAs)、mRNA和microRNA(miRNA)表達(dá)、DNA甲基化、蛋白質(zhì)富集、磷酸化蛋白富集等。本研究以prostatecancer為關(guān)鍵詞提取了全部16個(gè)PCa相關(guān)研究的基因測(cè)序數(shù)據(jù)，總計(jì)5 937例患者的6 222個(gè)樣本。分析了AR及其相互作用因子在不同類型PCa樣本中的表達(dá)變異情況及其總生存率。

1.4 GO富集分析GO Term分為3大類，每一類從不同的層面解釋基因的生物學(xué)功能，分別包括生物途徑(biology process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)3部分。橫坐標(biāo)富集指數(shù)為L(zhǎng)og10(observed/expected)，表示該GO term的富集強(qiáng)度。使用Benjamini-Hochberg程序?qū)γ總€(gè)類別內(nèi)的多次試驗(yàn)進(jìn)行校正，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AR及其相互作用因子的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)STRING分析顯示，AR與NCOR1、NCOR2、NCOA2、NRIP1、RAN、EP300、SOX9、PXN以及TNK2的相互作用均經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并有相關(guān)文獻(xiàn)驗(yàn)證(圖1)。其相互作用網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)為10，邊數(shù)21，平均節(jié)點(diǎn)度4.2，平均局部聚類系數(shù)0.89，預(yù)期邊數(shù)4，PPI富集(P<0.000 1)。

圖1 AR及其相互作用因子的STRING蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2 AR及其相互作用因子在PCa中的表達(dá)水平UALCAN分析顯示RAN、TNK2、PXN以及NRIP1在前列腺癌組織中顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)；相反NCOR1在前列腺癌組織中顯著下調(diào)(P<0.05)。NCOR2、NCOA2、EP300、SOX9、RAN表達(dá)水平改變不顯著(圖2)。

A：SOX9；B：RAN；C：TNK2；D：EP300；E：PXN；F：NRIP1; G：NCOR2；H：NCOR1；I：NCOA2；J：AR。圖2 AR及其相互作用因子在PCa中的表達(dá)

2.3 AR及相互作用因子在不同PCa類型中的變異結(jié)果表明，在近30%的各類PCa樣本中存在AR及其相互作用因子的表達(dá)變異，主要包括基因擴(kuò)增、基因突變、深度缺失以及多重變異4個(gè)類型。其中AR的變異率為18%，主要包括基因擴(kuò)增和突變。NCOA2的變異率為9%，主要變異類型為基因擴(kuò)增。在神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌中的變異類型主要表現(xiàn)為基因擴(kuò)增(8.7%)，而在CRPC中則主要表現(xiàn)為基因突變(11.43%，圖3)。

圖3 AR及其相互作用因子在PCa中的表達(dá)變異分析

2.4 AR及其相互作用因子在不同PCa類型中的表達(dá)變異及對(duì)預(yù)后的影響cBioPortal結(jié)果表明，AR的主要變異類型是基因擴(kuò)增和突變。其中突變主要發(fā)生在CRPC：NCOR1突變主要存在于NEPC，而PXN主要存在于CRPC；NCOA2的主要變異類型為基因擴(kuò)增，主要發(fā)生于PCa。其中AR、TNK2、NCOR1、PXN、NCOA2表達(dá)異常對(duì)患者總生存率均存在顯著影響(圖4)。

2.5 AR及其相互作用因子變異組對(duì)PCa預(yù)后的影響結(jié)果顯示AR及其相互作用因子變異的PCa總生存率顯著下降，變異組(n=95)的中位生存期為70個(gè)月(95%CI，60～105個(gè)月)，而未變異組(n=45)的中位生存期為141個(gè)月(95%CI，115.13～NA個(gè)月)(P<0.001)(圖5A)；變異組(n=22)無病生存期110.16個(gè)月[95%CI，64.66個(gè)月未觀察到(not available, NA)]，未變異組(n=93)無病生存期NA，P=0.010 2(圖5B)。

A：AR；B：TNK2；C：NCOR1；D：NCOA2；E：PXN圖4 AR及其相互作用因子在不同前列腺癌類型中的變異情況及其對(duì)總生存期的影響

A：總生存期分析；B：無病生存期分析圖5 綜合分析AR及其相互作用因子變異與前列腺癌預(yù)后關(guān)系

2.6 AR及其相互作用因子的GO富集見圖6。

圖6 AR及其相互作用因子GO富集分析

GO富集分析顯示前列腺生長(zhǎng)時(shí)pre-mRNA內(nèi)含子結(jié)合以及組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物具有最高的富集指數(shù)。其中，AR和SOX9與前列腺生長(zhǎng)有關(guān)，SOX9和EP300與pre-mRNA內(nèi)含子結(jié)合有關(guān)，而NCOR1、NRIP1以及NCOR2與組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物相關(guān)(圖6)。

3 討 論

AR信號(hào)通路的異?；罨徽J(rèn)為是PCa進(jìn)展及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素[9]。研究認(rèn)為CRPC進(jìn)展機(jī)制可概括為AR依賴型和AR非依賴型兩種[10]。AR蛋白作為網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)節(jié)點(diǎn)，在接受抗AR藥物阻斷后，網(wǎng)絡(luò)中其他蛋白的信號(hào)仍然能夠通過其他節(jié)點(diǎn)和途徑進(jìn)行傳導(dǎo)[4]。除了經(jīng)典的AR信號(hào)通路外，AR旁路以及替代途徑是目前研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前的研究以及藥物開發(fā)靶點(diǎn)多集中在阻斷AR信號(hào)或者雄激素合成途徑，但是針對(duì)AR相互作用因子的檢測(cè)或者治療靶點(diǎn)研究較少，尤其是AR相互作用因子的綜合性研究尚鮮見報(bào)道。

本研究系統(tǒng)地分析了AR及其9個(gè)相互作用蛋白分子在PCa中的表達(dá)、相互作用及其對(duì)PCa預(yù)后的影響。研究發(fā)現(xiàn)NRIP1、TNK2、PXN、RAN 4個(gè)蛋白在PCa組織中顯著上調(diào)表達(dá)，NCOR1顯著下調(diào)表達(dá)；TNK2、PXN以及NCOR1的表達(dá)改變均顯著降低總生存率。TNK2作為非受體酪氨酸蛋白和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸化AR的pTyr(267)位點(diǎn)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散和遷移、細(xì)胞存活、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[11]。有研究認(rèn)為通過TNK2抑制劑阻斷TNK2，使恩扎魯胺的PCa細(xì)胞致敏，并降低AR和AR-V7水平，可以有效減緩CRPC腫瘤的生長(zhǎng)[12]；TNK2阻斷有望成為靶向PCa干細(xì)胞(prostate cancer stem cell, PCSC)的一種新的治療方法[13]；PXN作為核外MAPK信號(hào)與雄激素以及生長(zhǎng)因子調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄事件之間的關(guān)鍵蛋白，是影響PCa去勢(shì)敏感和去勢(shì)抵抗的關(guān)鍵因子[14-15]；NCOR1參與PCa細(xì)胞線粒體膜電位的維持，NCOR1的低表達(dá)有助于PCa的進(jìn)展[16-17]。因此，靶向TNK2、PXN以及NCOR1在內(nèi)的AR相互作用因子有望作為ADT治療的有益補(bǔ)充，進(jìn)一步減緩CRPC進(jìn)展。

本研究將AR及其9個(gè)相互作用因子的表達(dá)及變異進(jìn)行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)其在PCa中的變異類型主要為基因擴(kuò)增和基因突變，而且顯著降低總生存率以及無病生存期。因此，AR及其相互作用因子的表達(dá)及變異有可能作為一個(gè)有效指標(biāo)用來評(píng)估PCa的進(jìn)展及其預(yù)后。另外，將AR及其相互作用因子綜合分析其GO功能富集，發(fā)現(xiàn)富集指數(shù)最高的是與前列腺生長(zhǎng)相關(guān)的pre-mRNA內(nèi)含子結(jié)合以及組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物等功能。其中，AR和SOX9參與前列腺細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控，SOX9和EP300與pre-mRNA內(nèi)含子結(jié)合有關(guān)；而NCOR1、NRIP1以及NCOR2與組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物相關(guān)。有研究表明組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白脫乙?；?HDACs)催化的蛋白質(zhì)乙?；腔蜣D(zhuǎn)錄的主要表觀遺傳調(diào)控機(jī)制[18]，因此NCOR1、NCOR2以及NRIP1可能參與了CRPC表觀遺傳調(diào)控過程。

綜上所述，AR相互作用因子有望作為AR之外的候選靶點(diǎn)，通過小分子抑制劑阻斷AR相互作用因子可作為ADT治療手段的有益補(bǔ)充；AR及其相互作用因子的綜合分析也為揭示CRPC進(jìn)展的分子機(jī)制提供了一定的依據(jù)。但是本研究也存在一定的局限性，分析的樣本數(shù)據(jù)來源多個(gè)項(xiàng)目研究或者多個(gè)數(shù)據(jù)庫，不同研究在數(shù)據(jù)采集和處理方面可能存在一定的差異；研究結(jié)論有待實(shí)驗(yàn)研究和大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步的驗(yàn)證。