王 娟,楊晶晶,周仁鵬,胡 偉,魯 超

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥物臨床試驗研究中心,合肥 230601;2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,合肥 230032;3.安徽理工大學(xué),安徽 淮南 232001)

肝纖維化的概念是上世紀50年代由德國科學(xué)家提出的,其被認為是癌前狀態(tài),與增加原發(fā)性肝癌相對死亡率密切相關(guān),占肝癌患者死亡率的一半[1]。因營養(yǎng)代謝和病毒感染等致慢性肝病的各種原因都可引發(fā)肝纖維化,先是肝損傷導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)積聚在肝中,隨后導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化[2-3]。肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機制是由多種細胞、蛋白和各種促纖維化細胞因子等因素共同組成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),其中肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)是其中的主體細胞類型[4]。清除病毒等祛除病因法是目前常規(guī)治療方法,抗炎、針對肝損傷的治療以及抑制ECM產(chǎn)生并促其降解等也是常見治療方式[1-5]。早期肝纖維化很難被發(fā)現(xiàn),晚期時逆轉(zhuǎn)并不能完全避免進展為肝癌的風(fēng)險和嚴重的并發(fā)癥。因此,在整個肝病發(fā)展過程中,對各種致病因素的動物模型進行深入研究,找出緩解甚至逆轉(zhuǎn)早期肝纖維化發(fā)展的機制和藥物,對治療肝病具有極高的價值。常用于制備模型的動物主要有大鼠[6]、小鼠[7]、豚鼠[8]、家兔[9]等,也有使用小型豬[10]、斑馬魚[11]、恒河猴[12]、鴨[13]來進行研究。與其他實驗動物比較,小鼠因與人類基因組同源度高,繁殖快、成本低、操作易上手而成為制備此種模型的首選,如乙型肝炎纖維化模型就以小鼠為主流[14]。大、小鼠造模方式分類大致相同,但在方法操作難易程度、受試藥物用量、纖維化程度、成模率、死亡率等方面有一定區(qū)別。如大鼠沒有膽囊,膽管阻塞性肝纖維化法會比小鼠更適用。以歐強等[15]采用SD大鼠和C57BL/6J小鼠成功建立的模型為例:8周后小鼠模型組的炎癥反應(yīng)和纖維化程度均比大鼠模型組的明顯,從這個角度小鼠更適于該病的實驗研究。目前大鼠模型的研究已較成熟,而小鼠模型的相關(guān)報道較少,故本文綜合國內(nèi)外關(guān)于小鼠肝纖維化模型的研究,基于肝纖維化的不同致病因素,歸納了目前常用模型的成模機制、造模途徑、模型效果、優(yōu)缺點和用途。

1 化學(xué)造模法

1.1 四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化模型

反復(fù)給予CCl4是一種經(jīng)典的、最早、最廣泛地用于誘導(dǎo)毒素介導(dǎo)肝纖維化的模型之一[16]。其機制是CCl4通過CYP450氧化酶激活生成活性自由基再活化貯脂細胞形成脂肪變性,促進纖維化。實驗結(jié)果可能因試劑的劑量、給藥時間和途徑或其他因素而有所不同,腹腔注射、皮下注射和灌胃法是目前CCl4造模法常用的給藥方式。其中,皮下注射40%～60% CCl4溶于橄欖油最常見,每隔2d注射1次,2個月時即可成功造模[17]。缺點是CCl4毒性較大,大劑量注射易導(dǎo)致實驗動物大量死亡而小劑量造模不易成功。

當(dāng)前，自然資源確權(quán)登記就是將相對完整的生態(tài)功能區(qū)域作為一個自然資源登記單元，自然資源統(tǒng)一確權(quán)登記將各類自然資源的質(zhì)量、數(shù)量和保護要求全面摸清，并通過登記的法律手段予以公示明確，落實到每一個產(chǎn)權(quán)人或者使用權(quán)人，有助于充分掌握自然資源家底，并根據(jù)自然資源容量和承載力進行分類開發(fā)和保護，做到自然資源分類施策。

1.2 二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)誘導(dǎo)的肝纖維化模型

DMN是一種有肝親和性毒性的藥物,通過甲基化蛋白質(zhì)、DNA和生物膜脂質(zhì)致使肝中毒性改變,導(dǎo)致肝細胞嚴重壞死和纖維化形成。與CCl4法不同在于損傷是進行性的,在DMN暴露中斷后1～2個月仍可維持穩(wěn)定疾病狀態(tài),因而與人類肝纖維化病理改變更類似。此造模方法已有40余年的歷史,大都參照Jenkins等[18]介紹的方法來制備。王麗娜等[19]將注射頻率由連續(xù)3d改為每2d1次,改良方法的模型更穩(wěn)定,病理可見小葉內(nèi)纖維化和大面積出血性壞死。DMN價格昂貴,具有致癌性,應(yīng)格外留意個人安全。

國立臺北護理健康大學(xué)王采芷教授將OSCE應(yīng)用于二技護理學(xué)生（在長庚和臺南護專等中專學(xué)習(xí)3年后考入大學(xué)的學(xué)生）身體評估檢查與評估課程中，因為二技學(xué)生參加過臨床實習(xí)，有一定的臨床經(jīng)驗。以O(shè)SCE代替?zhèn)鹘y(tǒng)技能考試，要求學(xué)生進行癥狀評估，考查病史訪談、身體檢查與評估診斷能力，結(jié)果表明OSCE能加強學(xué)生身體檢查與評估能力的臨床運用，避免學(xué)生因單純技術(shù)訓(xùn)練而覺得重復(fù)學(xué)習(xí)的情形。

患者不同程度的焦慮，產(chǎn)生應(yīng)激，導(dǎo)致心血管系統(tǒng)發(fā)生變化，血漿中腎上腺素激素水平和NK淋巴細胞增多，影響治療［5］。音樂療法（MT）可以從非藥物干預(yù)方面抑制患者的應(yīng)激反應(yīng)，減輕焦慮和神經(jīng)系統(tǒng)的應(yīng)激，有益治療。

1.3 硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)誘導(dǎo)的肝纖維化模型

日本血吸蟲病是我國有害性最大的寄生蟲病之一,肝遭受損傷后形成蟲卵肉芽腫,再形成纖維化。用血吸蟲尾蚴來制作是這類模型的基礎(chǔ)造模方式,因而不能應(yīng)用于其他類型,只應(yīng)用于血吸蟲病性肝病的藥物研究治療。姜蘇芩[30]采用皮膚敷貼日本血吸蟲尾蚴感染小鼠12周來建模,在感染后分期做組織標本檢測,發(fā)現(xiàn)纖維化程度進行性加重、膠原沉積面積與蟲卵肉芽腫位置息息相關(guān)。小鼠肝在感染后發(fā)生的病理變化與人類有極大的相似性,對研究人類該疾病機制及治療方面具有重要價值。

1.4 其他化學(xué)因素誘導(dǎo)的肝纖維化模型

通過對比柑橘與根系土各元素含量，可得出各元素富集系數(shù)，柑橘硒與鋅元素富集系數(shù)分別為0.036與0.01，四種重金屬富集系數(shù)分別為汞0.052、鎘0.006、砷0.001以及鉛0.002。

2 免疫造模法

2.1 異種血清法

包括單一營養(yǎng)物質(zhì)過剩誘導(dǎo)模型(單純高脂模型)和多種營養(yǎng)物質(zhì)過剩誘導(dǎo)模型(高脂高糖模型與高膽固醇高膽鹽模型)。長期進食高脂飲食后過多脂肪酸作用于肝細胞產(chǎn)生脂毒性,引起肝損傷和炎癥,但單獨給予高糖不能誘發(fā)纖維化,Asgharpour等[39]給小鼠聯(lián)合高果糖-葡萄糖溶液(23.1g/L果糖+18.9g/L葡萄糖)啟動致肥飲食后,發(fā)現(xiàn)小鼠16周后可出現(xiàn)胰島素抵抗(Insulin resistance,IR),大大縮短造模時間和增加纖維化程度。Savard等[40]發(fā)現(xiàn)膽固醇增多可能會抑制脂肪酸β氧化和減少膽汁酸合成,引起肝脂肪變性,添加膽鹽可增強小鼠對膽固醇的吸收并抑制其清除而提高其濃度。該方法比高膽固醇飲食造模周期短且纖維化程度高,但缺點是其未引起IR。

2.2 刀豆素蛋白A法(concanavalin A,Con A)

Beaussier等[31]通過實驗發(fā)現(xiàn)因膽管破壞、膽汁淤積導(dǎo)致肝細胞及膽管細胞受損,在肝內(nèi)產(chǎn)生大量膠原和ECM沉積發(fā)展成肝纖維化。BCM法中最常見的是通過人為結(jié)扎肝外膽管使其阻塞,其結(jié)扎方法包括膽總管結(jié)扎法、膽管結(jié)扎后切斷法和N-丁基-2-氰基丙烯酸鹽逆行性注入法3種方式[32]。該模型成模周期短,對動物的要求不高,肝纖維化穩(wěn)定可靠,且無須與毒性物質(zhì)接觸。但不足之處在于:不僅因不同個體對膽管擴張程度的耐受能力不同而使肝實質(zhì)有不同反應(yīng)致使纖維化程度不均一,且因膽汁泄漏引起的腹膜炎以及膽總管的分離結(jié)扎技術(shù)而致模型死亡率高,一般在30%以上[33]。該模型不適用于通過利膽而發(fā)揮藥效的藥物。

3 血吸蟲肝纖維化動物模型

TAA是一種毒性物質(zhì),進入肝后通過延長肝細胞有絲分裂和阻礙RNA轉(zhuǎn)移來影響相關(guān)酶的代謝過程,最終導(dǎo)致肝細胞壞死,常用于嚙齒動物的纖維化誘導(dǎo)。該模型與人類肝疾病的生化和形態(tài)學(xué)指標特征十分類似,成模率高,通常作為肝纖維化基礎(chǔ)研究的合適動物模型[20]。Seo等[21]采取每周3次連續(xù)7周腹腔注射TAA溶液(200mg/kg)的方法成功造模,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAA可增強小鼠的肝毒性,增加肝功能和纖維化程度,并產(chǎn)生大量膠原纖維,但使小鼠體重減輕。

4 膽管阻塞性肝纖維化(BCM法)模型

Con A是一種來自刀豆的植物凝集素,可刺激T細胞有絲分裂,促進TGF-β、TNF-α等細胞因子的釋放,引起炎癥反應(yīng)并進一步發(fā)展成肝纖維化,與人類病毒性肝炎的免疫病理機制非常接近[27-28]。這種明顯的急性肝損傷可在Balb/c小鼠上出現(xiàn),而在SCID小鼠上不會,使用其他免疫抑制劑也不會引起肝損傷,可見其特異性[27]。Yang等[29]對小鼠反復(fù)注射Con A建模,采用劑量15mg/kg每周1次尾靜脈注射的方法,連續(xù)注射6次后就出現(xiàn)肝纖維化。

5 肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemiareperfusion injury,HIRI)誘導(dǎo)的肝纖維化模型

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6 酒精性肝纖維化(alcoholic liver fibrosis,ALF)模型

我國酒文化底蘊深厚,由飲酒引發(fā)的健康問題日益嚴峻,由ALF引起死亡的肝硬化患者大約為50%[35]。肝是酒精代謝的主要場所,代謝物乙醛及其轉(zhuǎn)化物乙酸通過多種途徑損傷肝結(jié)構(gòu)與功能導(dǎo)致炎癥反應(yīng),同時削弱肝內(nèi)脂肪氧化形成脂肪肝,最終形成ALF。目前常用的模型制備方法為含酒精飲食誘導(dǎo)法和灌胃法。含酒精飲食誘導(dǎo)法的成本更低,操作更簡單,死亡率也更低,常采用Lieber-DeCarli模型和Tsukamoto-French模型[36-37]。灌胃法可控制每只小鼠的酒精攝入量,造模穩(wěn)定性高。蘇俊[38]應(yīng)用白酒灌胃法16周成功復(fù)制模型,觀察到如變性壞死、炎癥和纖維增生等相關(guān)病理表現(xiàn)。此方法非常貼合中國人的飲酒方式。

(1)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)法。此模型是目前提出的一種新型小鼠肝纖維化模型,其過程不出現(xiàn)肝細胞炎癥和死亡,已應(yīng)用于腎、心等其他器官。研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ在肝纖維化組織中的含量顯著增多,長期輸注AngⅡ可誘導(dǎo)HSC活化和促炎作用,可見AngⅡ具有致炎和纖維化的作用,并以此來誘導(dǎo)該疾病模型[22]。(2)D-氨基半乳糖(DGalactosamine,D-Gal N)法。因尿嘧啶核苷酸被大量消耗,致使RNA和蛋白質(zhì)合成減少而引起的肝損傷。多用于誘導(dǎo)急性肝損傷,纖維化程度高,多為三到四期,與人類肝纖維化相似度高,重復(fù)性好,但不足之處是造模所消耗的時間和成本高。Osawa等[23]給小鼠反復(fù)服用D-Gal N持續(xù)8周,誘導(dǎo)了肝細胞凋亡和肝纖維化。(3)二氧化硅(SiO2)誘導(dǎo)的肝纖維化。SiO2可誘導(dǎo)體內(nèi)過量氧自由基損傷肝組織以及誘導(dǎo)TGF-β等細胞因子激活HSC,致使ECM大量沉積,形成肝纖維化。有研究者混合SiO2和超液化碘油于肝右葉實質(zhì)內(nèi)局部注射,12周后可見部分細胞壞死、巨噬細胞結(jié)節(jié)和纖維增生[24]。該法可固定肝纖維化病變部位,成功率高,因而可為介入治療肝癌提供一種實驗可行性方向。但操作較為復(fù)雜,歷時長。

7 營養(yǎng)誘發(fā)模型

營養(yǎng)誘發(fā)模型多用來制作脂肪性肝纖維化模型,包括營養(yǎng)物質(zhì)過剩和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏兩種類型。C57小鼠對代謝綜合征敏感性強,易進展為纖維化,常選用來制備該類模型。

HIRI是指肝缺血再灌注后,不僅不會恢復(fù)肝功能,反而讓肝結(jié)構(gòu)和功能損害更嚴重的現(xiàn)象。在臨床上嚴重肝外傷、肝移植、休克復(fù)蘇時均不可避免出現(xiàn)HIRI,利用HIRI這一操作形成的一種新型肝纖維化模型,既符合臨床實際,也為這方面的研究提供一種新的方向。肝細胞損傷后釋放炎癥因子、細胞因子和自由基促使HSC被大量激活而啟動早期肝纖維化,這些因素在疾病的進程中持續(xù)作用并進一步發(fā)展。左嘉瑋等[34]采用缺血后再灌注8周誘導(dǎo)小鼠肝纖維化,采用半肝阻斷法,造成小鼠肝左外側(cè)葉、左中葉及中葉缺血90min,成功造模。

7.1 營養(yǎng)物質(zhì)過剩誘導(dǎo)模型

有研究證實,血清作為異源抗原刺激實驗動物產(chǎn)生免疫反應(yīng),刺激機體主動釋放細胞因子來激活HSC,使ECM過度沉積導(dǎo)致肝纖維化[25]。此機制與臨床上慢性肝炎所致肝纖維化非常相似,具有強烈的免疫應(yīng)答能力,對肝細胞乃至整個動物的傷害很小,對實驗結(jié)果影響小。豬、牛、馬和血吸蟲等的血清是實驗中常采用的。Zhang等[26]采用每周給Balb/c小鼠注射0.1mL/10g豬血清,6周后小鼠表現(xiàn)為明顯的纖維化變化。適用于肝纖維化機制的研究和免疫調(diào)節(jié)劑的篩選。但造模時間長,因過敏反應(yīng)致實驗動物易死亡。

7.2 營養(yǎng)物質(zhì)缺乏模型

主要有蛋氨酸和膽堿缺乏(methionine and choline-deficient diet,MCD)模型和L-氨基酸膽堿缺乏(choline-deficient L-amino acid-defined diet,CDAA)模型。(1)MCD模型在脂肪性肝纖維化研究中很常見。膽堿、蛋氨酸均缺乏時,谷胱甘肽和卵磷脂合成受阻,導(dǎo)致VLDL合成及分泌障礙,造成TG在肝細胞沉積,并增加抗氧化屏障機制損傷導(dǎo)致氧化應(yīng)激加劇,肝細胞發(fā)生炎癥和壞死[41]。(2)CDAA模型是把膽堿缺乏飲食中相當(dāng)量的蛋白質(zhì)用L-氨基酸和相應(yīng)的混合物來替代。Winkler等[42]用CDAA飲食喂養(yǎng)C57BL/6N小鼠10周后出現(xiàn)周圍肝纖維化,伴有肝脂肪變性和中度肝病。與MCD飲食比較,CDAA飲食在膽堿含量控制上更準確,但缺點是小鼠體質(zhì)量會稍有下降,也不會出現(xiàn)IR。

8 病毒性肝纖維化動物模型

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)與宿主之間的相互作用復(fù)雜,除非病毒被宿主清除,否則宿主將長期攜帶病毒,肝損害無法愈合最終會導(dǎo)致纖維化、硬化甚至癌癥的發(fā)生[43]。據(jù)統(tǒng)計全球每年因HBV感染引起的終末期肝病死亡的超出100萬人[44]。現(xiàn)已證實嚙齒類動物不會感染人類的肝炎病毒,缺乏HBV和HCV感染的通用小動物模型阻礙我們更深入了解病毒生物學(xué)。Bissig等[45]最近描述了一種可調(diào)節(jié)系統(tǒng)、用于重新接種免疫缺陷小鼠,特別是缺少富馬乙酰水解酶、重組激活基因2和IL-2受體的γ鏈的小鼠,結(jié)果顯示出這些具有高水平人類肝嵌合癥的小鼠(嵌合率可達95%)可傳播HBV和HCV,感染HCV的小鼠對抗病毒治療有反應(yīng)。這種模型將為研究HBV和HCV感染以及其他可能的人類肝病性病原體實驗提供實驗可能性,并證明可測試抗病毒藥物。

9 轉(zhuǎn)基因肝纖維化動物模型

基因遺傳因素是肝纖維化中一個重要影響因素,構(gòu)建小鼠轉(zhuǎn)基因肝纖維化模型包括基因敲除、基因突變和基因轉(zhuǎn)染等方法,通過一條明確的途徑來研究肝纖維化的發(fā)病機制。近年來,基于流體動力學(xué)的基因傳遞技術(shù)引起了人們的廣泛關(guān)注?；静襟E是將裸質(zhì)粒DNA大量高速注射到動物尾靜脈,該方法實現(xiàn)了肝中外源基因的高表達,為實驗動物提供了一種高效簡單的轉(zhuǎn)染方法。Yang等[46]運用基于流體動力學(xué)的基因傳遞系統(tǒng)建立了動態(tài)小鼠肝纖維化模型,發(fā)現(xiàn)小鼠肝中的TGF-β可高水平表達,在誘導(dǎo)狀態(tài)下Col1A2和血清α-SMA這兩個纖維化和HSC活化的指標上調(diào)。這種模型代表了一種動態(tài)且可逆的肝纖維化,可用來研究肝纖維生成的早期分子機制或篩選用于臨床的抗纖維化藥物。但缺點是誘導(dǎo)的時間短暫,纖維化水平并未達到大規(guī)模(小葉纖維化)。其他基因模型還有Ob/ob、Db/db、Foz/Foz、SREBP-1c轉(zhuǎn)基因等[47]。

10 復(fù)合模型

由于單一因素造模總有弊端,且肝纖維化的形成本身受各方面因素影響,因此部分研究者們可根據(jù)自己的模型需要,組合各種因素建立更穩(wěn)定和更精準機制的理想動物模型。這種將多種因素方法結(jié)合起來建立肝纖維化動物模型的方法稱之為復(fù)合模型。馮勁立等[48]以內(nèi)毒素脂多糖肝纖維化模型與DMN誘導(dǎo)法相結(jié)合形成復(fù)合型模型,既能提高造模的穩(wěn)定性,還能更好模擬疾病生理條件。

11 總結(jié)

在小鼠動物模型發(fā)展史上已有多種模型,從純化學(xué)試劑和酒精引起烈性肝損傷到AngⅡ“無炎癥”誘導(dǎo)、基因誘導(dǎo)等微損傷模型,各種模型各有特點。其中以CCl4誘導(dǎo)法較成熟,但其造模時間、給藥方式和劑量無統(tǒng)一的標準。免疫性肝纖維化模型的主動誘導(dǎo)特性與人類肝纖維化形成機制最為接近,臨床基礎(chǔ)研究的適用性更強,便于推廣,但模型中所用蛋白的種類以及攻擊階段蛋白的增加量和時間各有不同。其他模型中的酒精用量、接種病毒用量等均無統(tǒng)一的標準,故而在模型的重復(fù)性方面就存在差異。大多數(shù)模型與我國肝纖維化的主要病因仍有較大差距,因其不存在病毒復(fù)制且不維持進行性肝實質(zhì)損傷的過程?，F(xiàn)有成模技術(shù)均不能符合所有肝纖維化理想要求,僅能根據(jù)各個模型的發(fā)生機制、建立方法和病理特點,結(jié)合研究目的選擇不同的成模方法,以盡量滿足研究需求。

因此筆者認為,今后的研究應(yīng)加強機理、病理學(xué)方面的研究,建立能客觀反映人肝纖維化發(fā)病機制的、涉及肝炎病毒的動物模型,可應(yīng)用組學(xué)技術(shù)在蛋白、基因和代謝等方面尋求多種病因,以期找到共同致病因素的支點,針對關(guān)鍵基因和目標蛋白藥物的研發(fā),使其能預(yù)防肝硬化、肝癌等嚴重并發(fā)癥,最終改善肝纖維化患者的預(yù)后。目前興起的表觀遺傳學(xué)在肝纖維化機制上的研究或許可為我們打開新的大門。筆者還認為,由于人類的肝纖維化是多種因素共同作用的結(jié)果,因此可首選復(fù)合造模法,其次是選擇成模方法成熟的如CCl4誘導(dǎo)法。希望通過一代又一代研究者的摸索,可以改良造模方法,縮短造模時間,提高成模率,建立在給藥劑量、方式和時間以及纖維化程度評判標準上有更統(tǒng)一標準的模型,以期為肝纖維化基礎(chǔ)研究做出更大貢獻。