劉俊岑 劉牧云 安薇 孫曉茹 馬立哲 呂順莉 孫暢

1海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433；2海軍第905醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200050

【提要】 為進(jìn)一步探索慢性胰腺炎易感基因及其致病機(jī)制，研究者需準(zhǔn)確地構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，掌握不同動(dòng)物模型的優(yōu)劣。本文總結(jié)幾種慢性胰腺炎轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其病理表現(xiàn)，探討轉(zhuǎn)基因小鼠在慢性胰腺炎機(jī)制研究中的應(yīng)用價(jià)值。

CP是由基因、環(huán)境及其他多種因素引起的以胰腺纖維化和炎癥反應(yīng)為特征的一種進(jìn)行性慢性疾病[1]。患者常伴隨腹痛、腹瀉、消瘦、黃疸等臨床表現(xiàn)，可出現(xiàn)胰源性門靜脈高壓、假性囊腫、膽道或十二指腸梗阻等并發(fā)癥，需要接受藥物、內(nèi)鏡甚至外科手術(shù)治療。CP是胰腺癌的危險(xiǎn)因素，其中又以遺傳性CP發(fā)生胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)最高[2]。遺憾的是，目前并沒有阻止或逆轉(zhuǎn)CP進(jìn)展的有效藥物問世。由于致病基因多樣、致病機(jī)制復(fù)雜，研究者們尚不能完全掌握CP 的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，因此準(zhǔn)確地構(gòu)建動(dòng)物模型十分必要。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因穩(wěn)定整合到動(dòng)物受體的細(xì)胞基因組中得來的。轉(zhuǎn)基因技術(shù)包括目的基因的構(gòu)建、篩選載體與受體、基因?qū)搿Ⅲw外培養(yǎng)等步驟?；虼虬屑夹g(shù)屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其實(shí)質(zhì)是同源重組及基因的置換和定點(diǎn)突變，有小鼠胚胎干細(xì)胞打靶技術(shù)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列核酸酶技術(shù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nucleases，CRISPR/Cas9)等。胚胎干細(xì)胞打靶技術(shù)是通過同源重組將目的基因打入胚胎干細(xì)胞中，并將胚胎干細(xì)胞注入囊胚中形成嵌合胚胎，再將其注入假孕小鼠體內(nèi)形成嵌合體小鼠，嵌合體小鼠與野生型小鼠交配構(gòu)建動(dòng)物模型[3]?；虼虬屑夹g(shù)中構(gòu)建目的基因常用的基因敲除方法包括利用基因同源重組進(jìn)行基因敲除[4]或以Cre/loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)性基因敲除方法[5]。而CRISPR/Cas9技術(shù)則是以Cas9蛋白和小向?qū)NA(sgRNA)為主，通過同源介導(dǎo)的雙鏈DNA修復(fù)引入外源DNA片段[6]。本文介紹幾種近年已發(fā)表的轉(zhuǎn)基因小鼠CP模型。

一、陽離子胰蛋白酶原突變(PRSS1)基因相關(guān)突變介導(dǎo)的胰腺炎模型

PRSS1突變使胰酶提前激活，引發(fā)自身消化導(dǎo)致遺傳性胰腺炎[7]。PRSS1R122H是該功能獲得性突變的一種常見突變[8]。Gui等[9]利用Galk介導(dǎo)的重組工程技術(shù)，將R122H突變導(dǎo)入含有人PRSS1全長基因的細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)中，通過原核注射BAC克隆獲得PRSS1R122H轉(zhuǎn)基因小鼠，并經(jīng)反復(fù)腹腔注射雨蛙素建立CP模型。與對(duì)照組C57BL/6小鼠相比，PRSS1R122H轉(zhuǎn)基因小鼠腺泡細(xì)胞丟失、纖維化、腺泡-脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化、胰腺上皮內(nèi)瘤變(precancerous pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN))明顯，細(xì)胞間隙纖維蛋白沉積增加，凝血酶表達(dá)活躍，提示PRSS1R122H轉(zhuǎn)基因小鼠不可自發(fā)而需在膽堿凝集素或雨蛙素刺激下才能形成CP，與攜帶PRSS1R122H基因的兒童不會(huì)在10歲前發(fā)病，即需要外界刺激這一臨床觀察結(jié)果一致。同時(shí)該研究進(jìn)一步證實(shí)聯(lián)合使用抗凝劑與抗胰蛋白酶藥物可顯著改善小鼠CP。Huang等[10]使用Cre/loxp系統(tǒng)構(gòu)建PRSS1R122H小鼠。結(jié)果表明，無論以高脂(LPS)飼養(yǎng)還是酒精飼養(yǎng)的PRSS1R122H小鼠胰腺炎癥反應(yīng)較同樣飼養(yǎng)方式的PRSS1小鼠或野生型小鼠更重。該模型的致病機(jī)制為上調(diào)小鼠熱休克蛋白(Heat shock protein 70, HSP70)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2)的表達(dá)，下調(diào)小鼠糜蛋白酶C(chymotrypsin C,CTRC)表達(dá)，共同導(dǎo)致DNA損傷、凋亡、膠原沉積等。這一小鼠模型可用于研究脂多糖、乙醇或高脂飲食誘發(fā)胰腺炎的機(jī)制。Tan等[11]向PRSS1Tg小鼠(絲氨酸蛋白酶1轉(zhuǎn)基因小鼠)腹腔反復(fù)注射雨蛙素誘導(dǎo)CP，野生型C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組。結(jié)果表明，與野生型小鼠比較，PRSS1Tg小鼠胰腺組織內(nèi)炎細(xì)胞浸潤及細(xì)胞間質(zhì)增多，腺泡線粒體腫脹、核固縮和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞明顯，炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF-α)水平顯著升高。由此可見，雨蛙素處理的PRSS1Tg小鼠比野生型小鼠能夠更好地模擬人類CP進(jìn)展，可以作為胰腺炎發(fā)病機(jī)制研究的模型。在另一項(xiàng)研究中， Jancsó等[12]構(gòu)建攜帶小鼠胰蛋白酶原T7亞型突變的pTrapT7-intein-mouse-T7質(zhì)粒，通過同源重組在野生型小鼠C57BL/6N胚胎干細(xì)胞中插入c.71A>G(p.K24R) 突變，最后得到與人類PRSS1突變p.K23R相似的P.K24R突變的T7K24R小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T7K24R小鼠的胰蛋白酶原自激活速度是野生型小鼠的5倍，但T7K24R小鼠不會(huì)自發(fā)形成CP。在雨蛙素反復(fù)注射后3 d后，T7K24R小鼠出現(xiàn)腺泡細(xì)胞丟失、炎細(xì)胞浸潤、彌散纖維化以及胰腺重量減輕等CP病理特征；10 d后，C57BL/6N小鼠胰腺組織基本恢復(fù)正常，而T7K24R小鼠CP明顯加重?？梢娺@種PRSS1突變模型對(duì)外界刺激較敏感，可以在明確的時(shí)間點(diǎn)被誘導(dǎo)CP起病。

二、陰離子胰蛋白酶原(PRSS2)基因相關(guān)突變介導(dǎo)的胰腺炎模型

PRSS2是人胰腺分泌的常見亞型，其高比例表達(dá)與胰腺炎相關(guān)[13]。Wan[14]等利用BAC構(gòu)建了PRSS2轉(zhuǎn)基因小鼠，一部分PRSS2小鼠出現(xiàn)自發(fā)性局灶性胰腺炎癥，雨蛙素刺激下全部PRSS2小鼠進(jìn)展為CP；野生型C57BL小鼠無CP病理改變。這種PRSS2小鼠模型可測試特異性胰蛋白酶原亞型優(yōu)勢的效應(yīng)。為進(jìn)一步明確細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原激活的生物學(xué)作用，有研究使用大鼠PRSS2基因培育了成對(duì)堿性氨基酸裂解酶(paired basic amino acid-cleaving enzyme ，PACE)-胰蛋白酶原(Try)轉(zhuǎn)基因小鼠品系。結(jié)果表明，PACE-胰蛋白酶原激活可致腺泡細(xì)胞死亡，不導(dǎo)致纖維化或CP[15]。此模型適用于降低胰酶活性藥物的臨床前評(píng)估。Zhan等[16]將Try小鼠與BAC小鼠雜交，得到胰腺腺泡細(xì)胞中PACE-胰蛋白酶原(Try/BAC)的特異性靶向表達(dá)。將對(duì)照小鼠CreERT(BAC)與Prss2(Try/BAC)小鼠均使用雨蛙素反復(fù)腹腔注射誘導(dǎo)CP，結(jié)果顯示，與BAC小鼠相比，Try/BAC小鼠的胰酶活性顯著增加。6周后，BAC小鼠無CP病理改變，而所有Try/BAC小鼠胰腺組織CP病理改變明顯。該動(dòng)物模型有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)胰蛋白酶原不同亞型在發(fā)病機(jī)制中的作用及促進(jìn)CP治療方法的更新。

三、絲氨酸轉(zhuǎn)肽酶抑制因子Kazal 1型(SPINK1)基因相關(guān)突變介導(dǎo)的胰腺炎模型

SPINK1蛋白是胰腺腺泡細(xì)胞分泌的一種抗蛋白酶，可延緩胰蛋白酶原轉(zhuǎn)化為胰蛋白酶的自激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在中國人群中SPINK1c.194+2T>C功能喪失型突變可能與特發(fā)性CP有關(guān)，使患者糖尿病發(fā)病時(shí)間提前[18]。攜帶c.194+2T>c突變的患者內(nèi)鏡治療不能明顯緩解腹痛，內(nèi)分泌功能可持續(xù)惡化[19]。筆者所在課題組選擇C57BL/6小鼠Spink1基因?yàn)榘悬c(diǎn)，使用CRISPR/Cas技術(shù)孵育基因敲入小鼠(KI小鼠)，c.194+2T>C突變消除Spink1的表達(dá)，定義為Spink1+/-小鼠。Spink1+/-小鼠與野生型C57BL/6小鼠交配，產(chǎn)生Spink1+/-和Spink1+/+(野生型)小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Spink1-/-(純合突變)小鼠出生即死亡，Spink1+/-小鼠在沒有外界刺激下可自發(fā)形成CP。腹腔注射雨蛙素后Spink1+/-小鼠胰腺更早出現(xiàn)蛋白栓、腺泡細(xì)胞萎縮、腺泡導(dǎo)管細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化等病理改變，并且比Spink1+/+(野生型)小鼠更為嚴(yán)重[20]。該模型是進(jìn)一步研究CP發(fā)病機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)的理想模型，也是研究CP胰腺鈣化形成的新模型。

四、蛋白酶家族基因突變胰腺炎模型

糜蛋白酶原(chymotrypsinogen, CTR)通過降解胰蛋白酶原保護(hù)胰腺。研究表明，CTRB1-CTRB2基因座倒位影響胰蛋白酶原PRSS1降解，增加了歐洲人酒精性與非酒精性CP風(fēng)險(xiǎn)[21]，而在中國人群中則不致病[22]。Jancso等[23]為了證實(shí)糜蛋白酶對(duì)小鼠的保護(hù)作用，在C57BL/6N小鼠中使用CRISPR-Cas9的基因組編輯構(gòu)建Ctrb1基因敲除小鼠模型。結(jié)果表明，在雨蛙素誘導(dǎo)下Ctrb1基因敲除小鼠胰腺炎癥較重，糜蛋白酶活性無明顯變化，而對(duì)照組C57BL/6N小鼠糜蛋白酶活性增加。提示臨床治療胰腺炎時(shí)，需靶向抗胰蛋白酶，保留糜蛋白酶活性。該模型為新藥的研制提供了理論基礎(chǔ)。CTRC是另一種糜蛋白酶亞型，能夠降解胰蛋白酶原，抑制胰蛋白酶激活。Geisz等[24]發(fā)現(xiàn)近交系C57BL/6小鼠由于自然單核苷酸缺失而不表達(dá)功能性Ctrc，他們采用標(biāo)記輔助回交法選擇性地培育出正常Ctrc基因座的小鼠，并通過腹腔注射雨蛙素建立C57BL/6小鼠與Ctrc+小鼠CP模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于C57BL/6N小鼠，Ctrc+小鼠CP嚴(yán)重程度明顯較輕。該動(dòng)物模型證實(shí)Ctrc對(duì)嚙齒類動(dòng)物胰腺炎的發(fā)病與進(jìn)展有保護(hù)作用，進(jìn)一步闡明了C57BL/6小鼠是人類CTRC功能喪失型突變的天然模型。

五、羧肽酶A1(CPA1)基因相關(guān)突變介導(dǎo)的胰腺炎模型

CPA1是一種金屬蛋白酶，能水解肽鍵[25]，其基因突變導(dǎo)致CPA1蛋白錯(cuò)誤折疊，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致病。Hegyi等[26]通過同源重組把人類CPA1突變p.N256K敲入C57BL/6N小鼠Cpa1位點(diǎn)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型。結(jié)果證實(shí)CPA1N256K突變引起小鼠CPA1蛋白錯(cuò)誤折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，表現(xiàn)為6月齡時(shí)腺泡萎縮、炎癥細(xì)胞浸潤明顯，胰腺重量減輕35%～40%，這是一種自發(fā)形成的進(jìn)行性的CP。這種錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致的胰腺炎小鼠模型有潛在的臨床前用途；更可以測試在CP疾病進(jìn)展中，各種環(huán)境因素如酒精、煙草、高脂飲食、藥物等對(duì)疾病進(jìn)程的影響。Orekhova等[27]使用上述CPA1N256K小鼠品系，分別予含5%乙醇的酒精飲食和對(duì)照流食喂養(yǎng)，4周后處死。結(jié)果顯示，酒精喂養(yǎng)2～3周后部分CPA1N256K小鼠因癲癇發(fā)作死亡，流質(zhì)飲食喂養(yǎng)的CPA1N256K小鼠未出現(xiàn)癲癇發(fā)作及死亡。CPA1N256K小鼠(包括酒精飲食及對(duì)照流質(zhì)飲食)的血清淀粉酶水平均高于對(duì)照組C57BL/6N小鼠，胰腺重量低于C57BL/6N小鼠。酒精喂養(yǎng)的CPA1N256K小鼠胰腺腺泡細(xì)胞損傷面積是對(duì)照飲食小鼠的2倍，且巨噬細(xì)胞浸潤、胰腺纖維化明顯。而C57BL/6N小鼠無論是酒精飲食還是對(duì)照流質(zhì)飲食均未出現(xiàn)癲癇發(fā)作及胰腺纖維化。該研究證實(shí)了酒精與CPA1突變能協(xié)同促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，加速CPA1N256K小鼠CP的疾病進(jìn)展，但可導(dǎo)致小鼠突然死亡，提前終止實(shí)驗(yàn)，可能無法達(dá)到預(yù)期實(shí)驗(yàn)效果。

六、導(dǎo)管細(xì)胞中肝細(xì)胞核因子1 B(HNF1B)基因相關(guān)突變介導(dǎo)的胰腺炎模型

HNF1B基因突變可導(dǎo)致胰腺外分泌功能障礙，促進(jìn)CP形成[28]。Quilichini等[29]構(gòu)建了Hnf1b△duct小鼠，經(jīng)他莫昔芬腹腔注射構(gòu)建導(dǎo)管細(xì)胞Hnf1b缺失模型，并以Hnf1bfl/+或Hnf1bfl/fl小鼠為對(duì)照組。結(jié)果顯示，2個(gè)月后，Hnf1b△duct小鼠胰腺有CP表現(xiàn)(炎細(xì)胞浸潤、腺泡萎縮、胰腺星狀細(xì)胞激活、纖維化形成等)，胰腺重量下降約43%，并隨時(shí)間延長小鼠體重下降更明顯。該動(dòng)物模型既證實(shí)了胰腺導(dǎo)管細(xì)胞Hnf1b缺陷可導(dǎo)致胰腺外分泌功能障礙，又為深入研究CP發(fā)病機(jī)制提供可靠的模型。為進(jìn)一步研究5型糖尿病患者的胰腺情況，有研究者使用人HNF1B基因構(gòu)建Hnf1bsp2/+小鼠，發(fā)現(xiàn)Hnf1bsp2/+小鼠可出現(xiàn)外分泌功能障礙、CP等病理特征[30]。此小鼠為內(nèi)外分泌功能喪失的分子研究提供了活體模型。

七、彈性蛋白酶相關(guān)突變介導(dǎo)的胰腺炎模型

人糜蛋白酶樣彈性蛋白酶3B(Chymotrypsin-like elastase family member 3B，CELA3B)屬于彈性蛋白酶，被胰酶切割后轉(zhuǎn)化為活性蛋白酶。CELA3Bc.268C>T(p.R90C)突變移除分子剎車后增加CELA3B蛋白酶翻譯和分泌，增強(qiáng)其在胰蛋白酶作用下的蛋白分解活性。該突變與家族性胰腺炎有關(guān)。Moore等[31]采用CRISPR-Cas9技術(shù)敲入小鼠內(nèi)源性Cela3b基因座的同源突變(R89C和R89L)，后將其注射到C57BL/6受精卵中。結(jié)果表明，Cela3b純合子突變小鼠(R89C/R89C和R89L/R89L)在40周齡時(shí)未發(fā)生胰腺炎。在雨蛙素的作用下，純合子Cela3b突變小鼠相較于野生型小鼠產(chǎn)生了更嚴(yán)重的胰腺炎，且R89L小鼠比R89C小鼠嚴(yán)重(免疫細(xì)胞浸潤、腺泡去分化、小葉完整性喪失更明顯)。故目前的學(xué)說更支持2次打擊理論，即CELA3B基因突變增加胰腺對(duì)外界損傷的易感性。進(jìn)一步測序確定該突變可能的致病機(jī)制，即精氨酸90突變成半胱氨酸。此突變雖未改變CELA3B的催化特性，但提高其翻譯速率，增加活性酶的數(shù)量，提高因胰腺損傷引起胰腺炎的風(fēng)險(xiǎn)。該小鼠模型體現(xiàn)了CELA3B在胰腺炎中的重要致病作用，其潛在的催化特性和增強(qiáng)致病性的能力可能與重癥胰腺炎有關(guān)。

八、自身免疫性胰腺炎(AIP)小鼠模型

AIP與機(jī)體免疫機(jī)制異常相關(guān)，如免疫球蛋白亞型4(IgG4)水平升高[32-33]。Jaster等[34]將3種自發(fā)自身免疫性疾病MRL/MpJ(AIP)、NZM2410/J(狼瘡)和BXD2/TyJ(關(guān)節(jié)炎)的親代小鼠品系與不易發(fā)生任何自身免疫性疾病的CAST/EIJ小鼠進(jìn)行雜交，得到具有自身免疫傾向的高級(jí)交叉小鼠(advanced intercross mouse ，AIL)系。AIL小鼠可自發(fā)形成AIP。Seleznik等[35]為了驗(yàn)證淋巴毒素(lymphotoxin，LT)α、β在人AIP中的作用，構(gòu)建腺泡細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)LTα、β的Tg(Ela1-Lta,b)小鼠。Wanner-Seleznik等[36]發(fā)現(xiàn)Tg(Ela1-Lta,b)小鼠具備了人類AIP的多種特征，包括抗胰腺自身抗原Abs、抗核抗體、血清IgG升高以及IgG在腎臟沉積等表現(xiàn)，小鼠9～12月齡自發(fā)形成AIP。提示AIP小鼠體內(nèi)T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞大量聚集，靶向CD20、CD4治療后小鼠胰腺的病理損害明顯改善，胰腺小葉更完整。該小鼠模型是一種與病因?qū)W相關(guān)的自發(fā)性起病的臨床前動(dòng)物模型，為研究AIP發(fā)病機(jī)制和治療方法的提供了理想模型。

九、瞬時(shí)受體電位香草酸亞家族成員6(TRPV6)基因相關(guān)突變介導(dǎo)的CP模型

TRPV6是早發(fā)型CP患者的功能缺失性突變，是一種結(jié)構(gòu)性激活的Ca2+選擇性離子通道，屬于瞬時(shí)受體電位通道的香草素亞家族[37]。Masamune等[38]選取了8～10周齡的表達(dá)人TRPV6基因的TRPV6mut/mut小鼠， 其Ca2+滲透相關(guān)的區(qū)域中單個(gè)天冬氨酸殘基被丙氨酸取代。結(jié)果提示，與野生型小鼠相比，TRPV6mut/mut小鼠有典型CP病理特征(腺泡細(xì)胞丟失、淀粉酶脂肪酶分泌減少、纖維化增加、ADM)。該模型不僅表明了TRPV6是一種新的胰腺炎相關(guān)基因， 還展示了Ca2+通道在胰腺炎中有致病作用，對(duì)促進(jìn)新藥開發(fā)有重要作用。

綜上所述，轉(zhuǎn)基因小鼠模型符合臨床發(fā)病機(jī)制，貼合自然病程，對(duì)其構(gòu)建及研究有利于進(jìn)一步了解CP的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也為CP治療藥物的研發(fā)提供新思路。

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