梁麗金，邱彩月，鄧怡芳，徐 杰，鐘文峰，孫冬梅，黃 瑤，莫秋怡

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244)

玄參為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl的干燥根，是著名的“浙八味”之一，主要分布于浙江、湖北、湖南、安徽、四川、云南等地，其中浙江為玄參的道地產(chǎn)區(qū)[1]。玄參產(chǎn)地加工過程中涉及反復(fù)干燥、堆積發(fā)汗等復(fù)雜工序，與其療效及顏色有關(guān)的環(huán)烯醚萜苷類成分(桃葉珊瑚苷等)的含量受產(chǎn)地加工的影響較大，因而導(dǎo)致市場上流通的玄參藥材良莠不齊、質(zhì)量不均，影響臨床用藥的安全性和有效性[2-3]。目前，對于玄參藥材質(zhì)量的劃分，多以傳統(tǒng)外觀性狀(如粗細(xì)、大小、斷面顏色等)鑒別或化學(xué)成分含量(哈巴苷、哈巴俄苷等)等指標(biāo)作為評判標(biāo)準(zhǔn)[4-6]。基于中醫(yī)用藥整體性和玄參成分復(fù)雜性的特點(diǎn)，僅靠單一類型指標(biāo)評價(jià)并不能全面客觀評價(jià)中藥質(zhì)量，此外對性狀相似玄參藥材質(zhì)量也難以準(zhǔn)確評價(jià)。因此，有必要建立一種科學(xué)、合理的實(shí)現(xiàn)多種不同類型指標(biāo)的綜合質(zhì)量評價(jià)方法，以規(guī)范市場玄參藥材的質(zhì)量控制。灰色關(guān)聯(lián)度法、逼近理想解排序法(TOPSIS法)均可以將多維問題轉(zhuǎn)化為一維問題，降低不同類型指標(biāo)對決策的干擾，實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)綜合決策分析，評價(jià)結(jié)果更為客觀、合理，近年來在中藥材質(zhì)量評價(jià)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[7-10]。本研究擬采用MatLab圖像處理技術(shù)對玄參大小、顏色等外觀性狀進(jìn)行量化，以性狀量化值及特征圖譜作為評價(jià)指標(biāo)，并采用灰色關(guān)聯(lián)度法和熵權(quán)TOPSIS法對不同批次玄參藥材進(jìn)行綜合評價(jià)，判斷不同批次玄參藥材質(zhì)量情況，為玄參藥材質(zhì)量評價(jià)與控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Vanquish型超高效液相色譜儀(美國Thermo公司)；MiliQ Direct 8型超純水機(jī)(默克密理博公司)；ME204E型萬分之一天平(Mettler Toledo公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；111B型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)(浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)。

1.2 材料

哈巴苷(批號：111729-201707，純度96.8%)、毛蕊花糖苷(批號：111530-201914，純度95.2%)、哈巴俄苷(批號：111730-201508，純度96.0%)、桃葉珊瑚苷(批號：111761-200601，純度100%)、肉桂酸(批號：1110786-201604，純度98.8%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；色譜純磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，色譜純乙腈(默克公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。11批玄參藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl的干燥根。來源信息見表1。

表1 玄參樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 特征圖譜建立

2.1.1 供試品溶液的制備 取樣品粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL50%甲醇，稱重，超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)30 min，冷卻補(bǔ)重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 取桃葉珊瑚苷、毛蕊花糖苷、哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含桃葉珊瑚苷20 μg、毛蕊花糖苷20 μg、哈巴苷60 μg、哈巴俄苷60 μg、肉桂酸20 μg的溶液，作為混合對照品參照物溶液。

2.1.3 色譜條件 采用YMC Triart C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)色譜柱；以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～5 min，0%～10% A；5～7 min；10%～20% A；7～9 min，20%～33% A；9～12 min，33% A；12～16 min，33%～60% A；16～24 min；60%～95% A；柱溫30 ℃；檢測波長：0～13.5 min為210 nm，13.5 min后改為278 nm；流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

2.1.4 方法學(xué)考察 (1)精密度考察。取玄參樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，以哈巴俄苷色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算得到各特征峰的相對保留時(shí)間與相對峰面積的RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

(2)重復(fù)性考察。取玄參樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以哈巴俄苷色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算得到各特征峰的相對保留時(shí)間與相對峰面積的RSD值均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

(3)穩(wěn)定性考察。取玄參樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在樣品制備后的0、3、7、12、18、24 h進(jìn)樣檢測，以哈巴俄苷色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算得到各特征峰的相對保留時(shí)間與相對峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 特征圖譜建立及共有峰確定 取11批玄參樣品，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄各特征峰的峰面積，并進(jìn)行峰面積的歸一化處理，結(jié)果見表2。將各批次玄參特征圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件進(jìn)行處理，建立玄參對照特征圖譜，計(jì)算相似度結(jié)果見圖1和表3，發(fā)現(xiàn)不同批次樣品相似度均較高。11批玄參與對照指紋圖譜的相似度均大于0.90，表明建立特征圖譜檢測方法適應(yīng)性良好，符合研究要求。建立特征圖譜標(biāo)定11個(gè)共有峰，通過對照品比對，對桃葉珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、肉桂酸色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，結(jié)果見圖2。

表2 各批次的特征圖譜共有峰的峰面積歸一化處理結(jié)果

表3 相似度評價(jià)

2.2 外觀圖像采集與藥材大小、顏色特征提取

每批藥材隨機(jī)抽取各11根，置白色紙上，相機(jī)與藥材保持15 cm距離，采集圖像。采用MatLab軟件自帶函數(shù)gb2gray、im2bw、bwlabel、regionprops等將藥材圖像轉(zhuǎn)化成二值圖像，提取并計(jì)算直徑、長短軸比、矩形度等形狀參數(shù)，并稱定每根玄參的質(zhì)量。對預(yù)處理后玄參藥材圖像提取R(紅色)、G(綠色)、B(藍(lán)色)的均值，并將藥材圖像分別轉(zhuǎn)至HSV空間、Lab空間，提取H(色調(diào))、S(飽和度)、V(亮度)、L*(明亮度)、a*(紅色到綠色范圍中位置)、b*(黃色到藍(lán)色范圍中位置)的均值。采用SPSS 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Kruskal -Wallis法檢驗(yàn)，結(jié)果見表4、5。結(jié)果顯示S1～S6批次的玄參在外觀性狀特征和外部顏色色度值(H、V、L*、a*、b*、R、G、B)指標(biāo)上兩兩之間均沒有差異，而只有S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11批次樣品主要分別在直徑、矩形度、圓形度、質(zhì)量、色度值(H、S、V、L*、a*、b*、R、G、B)等單個(gè)或多個(gè)指標(biāo)上與某些批次之間存在差異。

圖1 11批玄參UPLC特征圖譜

注：5：桃葉珊瑚苷；6：哈巴苷；7：毛蕊花糖苷；10：哈巴俄苷；11：肉桂酸。

表4 各批次玄參的外觀性狀特征測定結(jié)果

表5 各批次玄參的外部顏色色度值測定結(jié)果

2.3 熵權(quán)TOPSIS法分析

2.3.1 建立標(biāo)準(zhǔn)化決策矩陣 根據(jù)公式(1)，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行高優(yōu)同向化處理，建立標(biāo)準(zhǔn)化決策矩陣，并進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理，其中m代表樣品，n代表指標(biāo)，xij代表測量值。

(1)

2.3.2 各指標(biāo)成分權(quán)重確定 根據(jù)公式(2)和(3)計(jì)算各指標(biāo)的熵值和權(quán)重。得到熵值Ej=(0.903 1、0.887 3、0.925 4、0.869 0、0.914 7、0.907 3、0.926 4、0.928 3、0.939 2、0.931 3、0.921 4、0.903 5、0.863 5、0.858 0、0.826 2、0.902 7、0.848 5、0.840 0、0.829 1、0.925 1、0.920 9、0.911 8、0.920 7、0.923 1、0.942 9、0.885 5)；權(quán)重wj=(0.036 6、0.042 6、0.028 2、0.049 5、0.032 3、0.035 0、0.027 8、0.027 1、0.023 0、0.026 0、0.029 7、0.036 5、0.051 6、0.053 7、0.065 7、0.0368、0.057 3、0.060 5、0.064 6、0.028 3、0.029 9、0.033 4、0.030 0、0.029 1、0.021 6、0.043 3)。

(2)

(3)

Z=(Rij×wj)m×n

(4)

(5)

(6)

2.3.4 貼近度計(jì)算及評價(jià) 根據(jù)公式(7)，分別計(jì)算各評價(jià)對象與最優(yōu)向量Z+和最劣向量Z-的距離D，根據(jù)公式(8)，計(jì)算各評價(jià)對象與最優(yōu)方案的接近程度Ci，并進(jìn)行排序，Ci越大表明越接近最佳方案。11批玄參質(zhì)量評價(jià)排序結(jié)果見表6。熵權(quán)TOPSIS排序：S3>S4>S1>S11>S9>S6>S2>S5>S8>S7>S10。11批玄參綜合質(zhì)量排名前3的為S1、S3、S4，說明S1、S3、S4的綜合質(zhì)量較優(yōu)；排名倒數(shù)3的為S7、S8、S10，說明S7、S8、S10的綜合質(zhì)量較劣。同時(shí)，S1、S7的產(chǎn)地均為浙江，但S7的綜合質(zhì)量排名為第10，說明相同產(chǎn)地的玄參綜合質(zhì)量也存在較大的差異。

(7)

(8)

表6 熵權(quán)TOPSIS質(zhì)量評價(jià)排序

2.4 灰色關(guān)聯(lián)度法分析

以各指標(biāo)最大值建立理想?yún)⒄詹牧希徊捎妹苛性紨?shù)據(jù)/列項(xiàng)均值進(jìn)行無量綱化處理；計(jì)算均值化后各指標(biāo)分別與對應(yīng)的理想?yún)⒄詹牧细髦笜?biāo)的絕對差；并根據(jù)公式(9)計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù)。關(guān)聯(lián)系數(shù)反映了待評指標(biāo)與該指標(biāo)理想值的吻合程度。關(guān)聯(lián)系數(shù)越大說明越接近該指標(biāo)的理想值。其中i為待評樣本數(shù)(i= 0，1，2，…，m；m=11)，k為評價(jià)指標(biāo)數(shù)(k= 0，1，2，…，n；n=26)。

(9)

根據(jù)公式(10)計(jì)算關(guān)聯(lián)度，并進(jìn)行歸一化處理得各指標(biāo)權(quán)重。得r(k)=(0.849 4、0.987 7、0.853 1、0.946 1、0.946 2、0.880 0、0.870 3、0.854 4、0.906 8、0.901 2、0.864 7、0.822 7、0.809 6、0.748 1、0.600 3、0.635 2、0.506 3、0.598 4、0.546 8、0.586 6、0.574 2、0.839 7、0.748 9、0.711 2、0.818 4、0.636 1)；ω(k)=(0.042 4、0.049 3、0.042 6、0.047 2、0.047 2、0.043 9、0.043 4、0.042 6、0.045 2、0.045 0、0.043 1、0.041 0、0.040 4、0.037 3、0.029 9、0.031 7、0.025 3、0.029 9、0.027 3、0.029 3、0.028 6、0.041 9、0.037 4、0.035 5、0.040 8、0.031 7)。

(10)

根據(jù)公式(11)計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)度，并進(jìn)行排序。結(jié)果見表7?；疑P(guān)聯(lián)度法綜合排序：S4>S1>S3>S9>S6>S11>S5>S2>S8>S7>S10；11批玄參綜合質(zhì)量排名前3的為S1、S3、S4，說明S1、S3、S4的綜合質(zhì)量較優(yōu)；排名倒數(shù)3的為S7、S8、S10，說明S7、S8、S10的綜合質(zhì)量較劣。這與熵權(quán)TOPSIS法分析結(jié)果一致。

(11)

表7 灰色關(guān)聯(lián)度法質(zhì)量評價(jià)排序

3 討論

本研究采用灰色關(guān)聯(lián)度法和熵權(quán)TOPSIS法構(gòu)建玄參兩種質(zhì)量綜合評價(jià)模型，11批玄參藥材質(zhì)量評價(jià)最優(yōu)的均為S1、S3、S4，最劣的均為S7、S8、S10。采用灰色關(guān)聯(lián)度法與熵權(quán)TOPSIS法對11批玄參藥材進(jìn)行綜合質(zhì)量評價(jià)的排序結(jié)果基本一致，說明構(gòu)建的灰色關(guān)聯(lián)度和熵權(quán)TOPSIS模型可以相互印證，可用于玄參藥材的綜合質(zhì)量評價(jià)。古籍文獻(xiàn)均以浙江的玄參質(zhì)量為最佳，本研究S1和S7均產(chǎn)自道地產(chǎn)區(qū)浙江，但綜合質(zhì)量差別較大。由此可見，僅以傳統(tǒng)的眼觀、口嘗、鼻聞等鑒別手段或唯化學(xué)成分論評價(jià)，難以很好地區(qū)分玄參質(zhì)量的優(yōu)劣。

本研究建立玄參UPLC特征圖譜，與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比，制樣方法簡便、分析速度較快、分離效果較佳。共標(biāo)定11個(gè)特征峰，并對桃葉珊瑚苷、哈巴苷、哈巴俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)。其中桃葉珊瑚苷是玄參主要藥效成分，具有抗病毒、抗炎的藥理作用[11]；同時(shí)桃葉珊瑚苷為環(huán)烯醚萜苷類成分，在玄參加工炮制過程中，其結(jié)構(gòu)的改變與玄參藥材顏色加深直接相關(guān)[12]。此外，哈巴苷、哈巴俄苷是《中國藥典》2020年版一部玄參含量測定項(xiàng)下的質(zhì)量控制指標(biāo)[13]。由此可知，本研究建立的UPLC特征圖譜所表征的化學(xué)成分，作為玄參內(nèi)在質(zhì)量指標(biāo)具有顯著代表性。

目前，中藥質(zhì)量評價(jià)模式主要有傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)評價(jià)、單一指標(biāo)或多指標(biāo)成分評價(jià)、指紋圖譜或者特征圖譜評價(jià)等。本文在繼承傳統(tǒng)鑒定基礎(chǔ)上對外觀性狀大小和顏色進(jìn)行定量表征，解決了傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)存在主觀性強(qiáng)的問題，并結(jié)合能反映中藥材整體化學(xué)成分的特征圖譜作為評價(jià)指標(biāo)，通過灰色關(guān)聯(lián)度法和熵權(quán)TOPSIS法進(jìn)行質(zhì)量綜合評價(jià)，可以解決中藥質(zhì)量評價(jià)時(shí)多指標(biāo)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一的問題和排除主觀賦權(quán)對結(jié)果的影響，從而更加全面地從外在性狀到內(nèi)在質(zhì)量層面上客觀反映玄參質(zhì)量，這與中藥多指標(biāo)質(zhì)量綜合評價(jià)思路相吻合。本方法分析科學(xué)、合理、可靠，可為玄參的質(zhì)量評價(jià)及全面質(zhì)量控制提供參考。