李保君，王 園，張亞軍

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

支氣管哮喘是一種慢性呼吸道非傳染性疾病，在各個(gè)年齡段的人群中多發(fā)，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，給社會(huì)帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，探索哮喘的預(yù)防方法并及時(shí)控制或緩解哮喘病情是當(dāng)務(wù)之急。眾所周知，哮喘是由多種炎癥性細(xì)胞、炎癥性介質(zhì)和炎癥性細(xì)胞因子互相協(xié)同作用的結(jié)果，氣道炎癥是哮喘最基本的發(fā)病特征之一[1-2]。目前治療支氣管哮喘的方法很多，一般采用抑制半胱氨酰白三烯(CysLTs)受體來阻斷CysLTs的炎癥通路，治療效果較好[3]。

1 哮喘中醫(yī)發(fā)病機(jī)制

中醫(yī)認(rèn)為“久病必瘀血”，哮喘的發(fā)病機(jī)制是由于哮喘的反復(fù)發(fā)作，引起肺氣虛，造成氣虛無力推血，最后形成氣虛血瘀，故哮喘的防治要痰瘀同治，活血化瘀藥物是不二之選。其中，穿山龍具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)咳祛痰等作用，臨床上常用來治療哮喘。穿山龍是薯蕷科薯蕷屬植物穿龍薯蕷的根莖，主要含有薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元、25-△-螺旋甾-3，5-二烯、纖細(xì)薯蕷皂苷、穗菝葜甾苷、25-D-螺甾-3，5-二烯及對羥基芐基酒石酸等有效物質(zhì)[4]。一般認(rèn)為，穿山龍可通過降低炎癥通路上的主要炎癥因子從而發(fā)揮治療哮喘的作用，不過這種作用目前仍缺少客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本研究將通過大鼠實(shí)驗(yàn)探討穿山龍治療哮喘的作用機(jī)制。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD雌性大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，生產(chǎn)批號：SAXK(蒙)2019-0015，購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)：給予標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)小鼠飼料，每天保證光照時(shí)間達(dá)12 h，關(guān)燈時(shí)間12 h，室溫一般控制在25 ℃ 左右，室內(nèi)相對濕度一般控制在50%～70%。確保所有大鼠能自行進(jìn)食、飲水，在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境中喂養(yǎng)1周后開始造模[5]。

2.2 實(shí)驗(yàn)用藥品

穿山龍制劑：飲片煎煮、濃縮、凍干制成穿山龍凍干粉。孟魯司特鈉片由杭州默沙東制藥有限公司提供。

2.3 主要試劑及儀器

主要試劑：氫氧化鋁，卵蛋白，戊巴比妥鈉，多聚甲醛溶液，蘇木素-伊紅(HE)染液，PBS磷酸鹽緩沖液，三氯甲烷，引物等。主要儀器：勻漿儀，熒光定量PCR儀，自動(dòng)組織脫水機(jī)，光學(xué)顯微鏡等。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 分組方法 經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)把大鼠分成5組，每組10只，分別是正常組、哮喘哮喘模型組、孟魯司特鈉組、穿山龍組、穿山龍合孟魯司特鈉組，進(jìn)行分籠喂養(yǎng)。

2.4.2 哮喘模型制作 根據(jù)PALMANS[6]所用方法復(fù)制哮喘模型，該方法分為兩個(gè)階段：第一階段是基礎(chǔ)致敏，采用腹腔注射卵清蛋白；第二階段是激發(fā)致敏，采用霧化吸入。除正常組，其余4組都進(jìn)行以下操作：實(shí)驗(yàn)第1天，取配置好的卵蛋白氫氧化鋁溶液1 mL腹腔注射(10 mg的卵蛋白與200 mg的氫氧化鋁混合)，進(jìn)行基礎(chǔ)致敏；實(shí)驗(yàn)第8天，重復(fù)第一天的操作以加強(qiáng)致敏；實(shí)驗(yàn)第15天開始，進(jìn)行激發(fā)致敏，采用2%卵蛋白生理鹽水溶液進(jìn)行每日一次的霧化，每次霧化30 min，連續(xù)進(jìn)行20 d。正常組在實(shí)驗(yàn)第1天、第8天，給予腹腔注射生理鹽水，第15天開始給予生理鹽水霧化，給藥：每天霧化前2 h，各治療組予以對應(yīng)藥物進(jìn)行灌胃治療，正常組和哮喘模型組則將蒸餾水代替藥物，連續(xù)灌胃20 d。除正常組外，所有大鼠在行為學(xué)觀察中出現(xiàn)了氣促、抓鼻子、點(diǎn)頭、喜歡蜷縮、腹部可見痙攣甚至出現(xiàn)走路不穩(wěn)等癥狀，說明大鼠哮喘模型制作成功。

2.4.3 標(biāo)本采集 (1)血清：灌胃及霧化20 d結(jié)束后，配置2%戊巴比妥鈉麻醉劑麻醉各組大鼠，取5 mL的腹主動(dòng)脈血于采血管中，靜置30 min離心后保存血清，用于檢測各組IL-5、CysLTs的情況。(2)肺葉：采完血后迅速摘取兩肺，用生理鹽水清洗干凈，一側(cè)肺組織固定于提前配置好的4%多聚甲醛溶液中，顯微鏡下觀察病理情況；將另一側(cè)的肺組織保存在-80 ℃ 的冰箱中，測定肺葉中CysLTR1mRNA、Eot-3 mRNA的表達(dá)水平。

2.4.4 肺組織切片制作 (1)脫水：依次放置以下濃度梯度的乙醇進(jìn)行脫水：70%→80%→90%→95%→100%→100%各1 h[7]。(2)透明：脫完水的肺組織置于二甲苯中約10 min，可以看出肺組織顏色變?yōu)橥该鳌?(3)包埋：用溶化的石蠟將肺組織包埋于包埋盒中。 (4)切片：用切片機(jī)將組織切成厚度為4 μm的切片。(5)貼片：將切好的片加熱熨燙后，粘到載玻片上并烘干水分，溫度控制在45 ℃左右。(6)染色：脫蠟(二甲苯I 、II 各10 min)→水化(100%→100%→95%→90%→80%→70%乙醇各1 min，清水洗3 min)→蘇木精染色5 min→流水沖2 min→1%鹽酸乙醇分化液20 s→流水沖 5 min(變藍(lán))→蒸餾水洗 1 min→伊紅染色3 min→流水沖30 s→脫水(80%、90%、95%、100% 乙醇各2 min)→透明(二甲苯I 、II 、Ⅲ各2 min)。(7)封片：使用中性樹膠進(jìn)行固定封片，最好標(biāo)記，自然晾干。

2.4.5 血清中IL-5、CysLTs的檢測 按照試劑盒上的說明進(jìn)行操作，所有流程包括：(1)稀釋→(2)加樣→(3)加酶→(4)溫育→(5)配液→(6)洗滌→(7)顯色→(7)終止反應(yīng)→(9)測定。

2.4.6 肺組織中CysLTR1和Eot-3的mRNA表達(dá)水平檢測 (1)提取肺組織總RNA：勻漿管中加入Trizol Reagent預(yù)冷→放入100 mg肺組織→研磨→離心→加入250 mL三氯甲烷→靜置3 min→離心→取上清新的EP管→加入異丙醇→混勻→-20 ℃環(huán)境靜置15 min →離心→倒掉上清→75%乙醇1.5 mL洗滌沉淀→離心→超凈臺上吹3 min→加入無RNA酶的水稀釋RNA→干燥RNA至乙醇完全揮發(fā)→加入DNase水溶解沉淀→OD值測定。(2)反轉(zhuǎn)錄：PCR管中加入10mLRNA→加入1 mL Oligo dT Primer →加入無核糖核酸酶的去離子水→PCR儀上65 ℃保溫5 min→冰上冷卻5 min→置于RNase PCR管中→加入4 mL 的5X Reaction Buffer、1 mL的Ribolock RNase Inhibitor、1 mL的ReverAid M-Mulv RT、2 mL的10mM dNTP Mix混合后放入65 ℃水浴中 →冰上冷卻5 min。(3)實(shí)時(shí)定量PCR。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

正常組大鼠從實(shí)驗(yàn)第1天到實(shí)驗(yàn)最后1天一般情況良好，活動(dòng)自由，精神狀態(tài)良好，毛發(fā)發(fā)亮，飲食正常，口咽、鼻腔無分泌物，無氣促、打噴嚏。哮喘模型組和其余各治療組大鼠均在第7天開始出現(xiàn)精神狀態(tài)較正常組差，到實(shí)驗(yàn)第14天，精神狀態(tài)差更為明顯。霧化激發(fā)后可見呼吸急促、抓鼻子、動(dòng)作不靈活、腹部出現(xiàn)痙攣、喜歡蜷縮、皮毛不光滑等，明顯較正常組差，隨著癥狀的加重，飲食的攝入量也隨之減少。哮喘模型組在造模前和取材時(shí)體重減輕，正常組增加，體重變化有顯著差異。3個(gè)治療組進(jìn)行20天的給藥治療后，癥狀較哮喘模型組來說有明顯改善[8]。各組大鼠體質(zhì)量變化：正常組和3個(gè)治療組大鼠前后體質(zhì)量變化都比哮喘模型組的變化明顯(P<0.05)，其中穿山龍合孟魯司特鈉組的體質(zhì)量變化最為明顯。表1。

表1 各組體質(zhì)量前后變化情況

3.2 肺組織HE染色病理情況

正常組：偶見少量的嗜酸性粒細(xì)胞圍繞在氣道和血管周圍，支氣管腔光滑，氣道黏膜不可見，上皮結(jié)構(gòu)完整，肺泡無異常。見圖1。

圖1 正常組

哮喘模型組：不僅在血管周圍的組織中可見大量炎性細(xì)胞，在環(huán)繞肺泡壁周圍也可見明顯的炎性細(xì)胞；而且氣道周圍的血管有明顯的擴(kuò)張充血情況，支氣管和細(xì)支氣管的管腔較為狹窄，有明顯的上皮細(xì)胞增生，可見增厚的平滑肌，肺間質(zhì)充血水腫明顯，見圖2。

圖2 哮喘哮喘模型組 100×

其余3組：經(jīng)治療，肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞明顯少于哮喘模型組，可見輕微的支氣管黏膜水腫，支氣管壁內(nèi)外的炎性細(xì)胞情況明顯比哮喘模型組好轉(zhuǎn)，其中穿山龍合孟魯斯特鈉組大鼠肺組織病理表現(xiàn)更接近正常組。見圖3、圖4、圖5。

圖3 穿山龍組

圖4 孟魯司特鈉組

圖5 穿山龍合孟魯司特鈉組

3.3 各組血清中IL-5、CysLTs水平

哮喘模型組血清中的IL-5、CysLTs水平相較正常組而言，明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3個(gè)治療組的血清中IL-5、CysLTs水平較哮喘模型明顯降低 (P<0.05)；穿山龍合孟魯司特鈉組的相應(yīng)指標(biāo)水平比孟魯司特鈉組明顯降低(P<0.05)，穿山龍組和孟魯司特鈉組中的IL-5水平無明顯差異(P>0.05)；而穿山龍組和孟魯司特鈉組中的CysLTs水平比較，穿山龍組明顯低于孟魯司特鈉組(P<0.05)，說明穿山龍降低IL-5水平的效果與孟魯司特鈉相當(dāng)，但降低CysLTs水平的效果雖然不及孟魯司特鈉，但與孟魯司特鈉合用可以增強(qiáng)孟魯司特鈉的效果。見表2。

表2 各組血清中IL-5、CysLTs水平測定

3.4 肺組織中CysLTR1mRNA、Eot-3 mRNA表達(dá)水平

3.4.1 Eot-3mRNA表達(dá)水平 哮喘模型組的Eot-3mRNA表達(dá)水平與正常組相比，有明顯升高(P<0.05)；3個(gè)治療組中的Eot-3mRNA表達(dá)水平相對于哮喘模型組來說，明顯降低，(P<0.05)；穿山龍合孟魯司特鈉組的Eot-3mRNA表達(dá)水平明顯低于孟魯司特鈉組(P<0.05)，說明穿山龍可降低哮喘大鼠Eot-3mRNA的表達(dá)水平，并且與孟魯司特鈉合用，效果更好。見表3。

表3 各組Eot-3mRNA表達(dá)水平檢測

3.4.2 CysLTR1mRNA表達(dá)水平 正常組中CysLTR1mRNA表達(dá)水平與哮喘模型組相比明顯降低(P<0.05)；3個(gè)治療組的CysLTR1mRNA表達(dá)水平低于哮喘模型組(P<0.05)；孟魯司特鈉組的水平明顯低于穿山龍組(P<0.05)；與孟魯司特鈉組比較，穿山龍合孟魯司特鈉組的水平較低 (P<0.05)，說明穿山龍可降低哮喘大鼠CysLTR1mRNA的表達(dá)水平，并且可增加孟魯司特鈉的效果。見表4。

表4 各組CysLTR1mRNA表達(dá)水平檢測

4 討論

氣道的慢性炎癥是哮喘發(fā)病的根本，也就是說，無論是什么程度或類型的哮喘，氣道的基本病理離不開炎癥，炎癥是引起哮喘氣道高反應(yīng)、造成氣道的通氣障礙并引發(fā)臨床癥狀的關(guān)鍵因素[9]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，穿山龍不僅能促使嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)凋亡，而且可調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡，從而消除氣道炎癥[10-12]。本實(shí)驗(yàn)通過對中藥穿山龍與西藥孟魯司特鈉作對比，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)穿山龍可改善哮喘大鼠肺組織病理學(xué)狀態(tài)，減輕氣道中炎性細(xì)胞的浸潤程度，通過對血清中IL-5、CysLTs的檢測，發(fā)現(xiàn)穿山龍可在不同程度上降低IL-5、CysLTs水平，雖然穿山龍降低CysLTs水平的能力與孟魯司特鈉有明顯差距，但是穿山龍與孟魯司特鈉合用，效果顯著；并且二者合用還能降低哮喘大鼠肺組織中的CysLTR1mRNA、Eot-3mRNA表達(dá)水平，顯示穿山龍能增強(qiáng)白孟魯司特鈉的抗炎抗喘作用。