麥文慧，尹飛飛，卓珠琳，鄭 青，陳柳虹

(1. 海口市婦幼保健院檢驗(yàn)科，海南 海口 570203； 2. 海南醫(yī)學(xué)院-香港大學(xué)熱帶傳染病聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199； 3. ?？谑械谌嗣襻t(yī)院檢驗(yàn)科，海南 海口 571100)

流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)主要定植在咽喉及口腔黏膜，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，可引起急性咽炎、喉炎、氣管炎、肺炎、中耳炎、鼻竇炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、腦膜炎等急性化膿感染及嚴(yán)重的繼發(fā)感染[1]。流感嗜血桿菌是引起兒童呼吸道感染的主要病原菌，其感染人群、流行季節(jié)、耐藥性等均呈現(xiàn)地域性差異[2-3]。流感嗜血桿菌是?？诘貐^(qū)引起兒童呼吸道細(xì)菌感染的首位病原體[4]，嚴(yán)重危害該地區(qū)兒童健康。為進(jìn)一步了解?？诘貐^(qū)兒童肺炎來源的流感嗜血桿菌臨床特征、耐藥性，以及其群體結(jié)構(gòu)、克隆在社區(qū)傳播情況，對2021年海口市婦幼保健院住院肺炎患兒分離的流感嗜血桿菌進(jìn)行研究，旨在為該地區(qū)預(yù)防和治療兒童流感嗜血桿菌性肺炎提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2021年因肺炎在?？谑袐D幼保健院住院治療的患兒為研究對象，分析患兒痰、肺泡灌洗液標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)出流感嗜血桿菌情況，剔除同一患兒同次住院重復(fù)菌株。兒童社區(qū)獲得性肺炎(CAP)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2019年版《兒童社區(qū)獲得性肺炎診療規(guī)范》[5]。患兒入院后24 h內(nèi)通過一次性無菌吸痰管負(fù)壓吸取痰標(biāo)本送檢，痰合格標(biāo)準(zhǔn)為：白細(xì)胞>25個(gè)/低倍視野，鱗狀上皮細(xì)胞<10個(gè)/低倍視野。對于肺部感染導(dǎo)致的肺實(shí)變、肺不張患兒，通常進(jìn)行支氣管肺泡灌洗治療，并取灌洗液送檢。隨機(jī)留取流感嗜血桿菌感染高發(fā)的春季中1—2月份分離的流感嗜血桿菌菌株，進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(MLST)同源性檢測分析。

1.2 儀器與試劑 哥倫比亞血平板、嗜血桿菌巧克力平板、MH平板購自廣州迪景微生物科技有限公司，HTM平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司，細(xì)菌鑒定采用法國梅里埃VITEK 2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀及其配套的NH鑒定卡，頭孢硝噻吩紙片、因子紙片購自溫州康泰生物科標(biāo)技有限公司，藥敏紙片購自英國OXOID公司和溫州康泰生物科技有限公司，標(biāo)準(zhǔn)菌株流感嗜血桿菌ATCC 49247、嚙蝕艾肯菌ATCC BAA-1152、金黃色葡萄菌ATCC 29213、金黃色葡萄菌ATCC 25923、副流感嗜血桿菌等均購自溫州康泰生物科技有限公司，PCR擴(kuò)增儀、PCR反應(yīng)試劑、電泳儀、凝膠程序成像系統(tǒng)、引物合成、測序等均由武漢天一華煜基因科技有限公司提供。

1.3 培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗(yàn) 標(biāo)本接種于哥倫比亞血平板和嗜血桿菌巧克力平板，置5%CO2培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)過夜，挑取巧克力平板上濕潤、透明的露滴狀疑似菌落采用Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子生長需求試驗(yàn)進(jìn)行初篩，初篩陽性菌株用梅里埃VITEK 2 Compact細(xì)菌鑒定儀及其配套的NH卡鑒定確認(rèn)。挑取流感嗜血桿菌調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙壕鶆蛲坎加贖TM平板上，采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判讀按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2021標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。采用嚙蝕艾肯菌ATCC BAA-1152對NH鑒定卡進(jìn)行質(zhì)量控制，采用流感嗜血桿菌ATCC 49247、副流感嗜血桿菌對Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子紙片進(jìn)行質(zhì)量控制，采用流感嗜血桿菌ATCC 49247對HTM平板及K-B法藥敏紙片進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.4 β-內(nèi)酰胺酶檢測 采用頭孢硝噻吩紙片蘸取待測菌，10 min后觀察顏色變化，出現(xiàn)紅色為陽性，即產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶；1 h后無顏色變化為陰性，即不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶。采用金黃色葡萄菌ATCC 29213進(jìn)行陽性質(zhì)控，金黃色葡萄菌ATCC 25923進(jìn)行陰性質(zhì)控。

1.5 MLST (1)細(xì)菌DNA提?。翰捎弥蠓蟹?。吸取100 μL DNA提取液于離心管中，直接挑取流感嗜血桿菌菌落于DNA提取液中制成懸液，將離心管置于金屬加熱器中100℃ 10 min，再置于高速離心機(jī)12 000×g離心5 min，取上清液(即為DNA模板)4℃保存?zhèn)溆谩?2)PCR擴(kuò)增：反應(yīng)總體積30 μL，包括MasterMix 15 μL，無菌水12 μL，上游引物(濃度10 mmoL)、下游引物(濃度10 mmoL)各1 μL，DNA模版1 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃末端延伸5 min。取2 μL PCR產(chǎn)物加2 μL 6×Loading Buffer進(jìn)行電泳前處理，再取適量樣品至1%瓊脂糖凝膠孔中，120 V電泳20 min，采用凝膠成像分析儀進(jìn)行拍照檢測。見表1。(3)測序分型：將PCR產(chǎn)物連同相應(yīng)的測序引物送Sanger測序公司進(jìn)行雙向測序(每個(gè)樣品配5 μL上、下游測序引物，引物濃度10 μmoL)，測序平臺為ABI公司的3730xl DNA Analyzer測序儀。測序結(jié)果提交MLST數(shù)據(jù)庫(http://enterobase.warwick.ac.uk/species/index/mcatarrhalis)，獲得各等位基因序列號并確定菌株序列型(sequence type，ST)。

表1 流感嗜血桿菌擴(kuò)增/測序引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 Amplification/sequencing primer sequences and product sizes of H. influenzae

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用WHONET 5.6軟件對藥敏結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 5 342例患兒共檢出流感嗜血桿菌352株，檢出率為6.59%。其中男患兒檢出率為7.10%，女患兒檢出率為5.82%，見表2。男女患兒流感嗜血桿菌檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.066)。送檢標(biāo)本中，痰標(biāo)本5 325份，肺泡灌洗液標(biāo)本17份，分別檢出流感嗜血桿菌349、3株，檢出率分別為6.55%、17.65%。

2.2 不同年齡段檢出情況 流感嗜血桿菌檢出率以4歲～最高(12.88%)，2歲～次之(11.62%)，≥6歲為2.56%，<30 d最低(0.30%)，各年齡段比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 不同季節(jié)檢出情況 流感嗜血桿菌全年均可流行，春季(1～3月)、夏季(4～6月)、秋季(7～9月)、冬季(10～12月)流感嗜血桿菌檢出率分別為14.04%、4.48%、4.62%、4.40%，以春季檢出率最高,見表2。不同季節(jié)檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

表2 肺炎患兒流感嗜血桿菌臨床分布Table 2 Clinical distribution of H. influenzae in children with pneumonia

表3 331株流感嗜血桿菌對抗菌藥物的藥敏結(jié)果Table 3 Antimicrobial susceptibility testing results of 331 H. influenzae strains

圖1 流感嗜血桿菌序列峰圖Figure 1 Sequence peak of H. influenzae sequences

圖2 51株流感嗜血桿菌MLST聚類樹Figure 2 MLST cluster tree of 51 H. influenzae strains

3 討論

本研究從肺炎患兒收集5 342份標(biāo)本，排除咽拭子，以痰標(biāo)本為主，且痰為負(fù)壓吸取，減少了口咽部菌群的污染，數(shù)據(jù)更能客觀反映下呼吸道感染的情況。共檢出352株流感嗜血桿菌，總檢出率為6.59%，肺泡灌洗液檢出率為17.65%，遠(yuǎn)高于痰的6.55%，說明肺泡灌洗液對下呼吸道感染具有較高的敏感度和特異度。本研究流感嗜血桿菌總檢出率比浙江嘉興地區(qū)(3.34%)高[3]，但比浙江玉環(huán)市(11.86%)[6]、山東濟(jì)南地區(qū)(12.58%)[7]、河南濟(jì)源市(10.94%)均低[8]，可見不同地區(qū)的流感嗜血桿菌流行存在地域性差異。林翀等[9]報(bào)道2012年?？诘貐^(qū)檢出率為18.6%，說明同一地區(qū)不同年度流感嗜血桿菌的感染流行也不同。流感嗜血桿菌的流行不僅呈季節(jié)性分布，各地區(qū)的流行季節(jié)也不盡相同。與文獻(xiàn)[6，10]報(bào)道的冬季檢出率最高不同，海口地區(qū)春季檢出率最高，冬季檢出率最低，與袁文清等[11]報(bào)道一致，多個(gè)研究報(bào)道春季有較高檢出率[7-8，11-12]，可能是春季冷暖交替，容易誘發(fā)流感嗜血桿菌相關(guān)呼吸道疾病，加上春季正值春節(jié)期間，人員流動(dòng)性大，增加了感染風(fēng)險(xiǎn)。臨床應(yīng)重視春季此類疾病的防控，積極開展社區(qū)宣傳工作，指導(dǎo)家屬做好兒童防護(hù)工作。

本研究發(fā)現(xiàn)，新生兒流感嗜血桿菌檢出率僅0.24%，檢出率低的原因可能是新生兒與外界接觸少，大多數(shù)新生兒肺炎都是吸入性肺炎，感染多由宮內(nèi)感染或經(jīng)產(chǎn)道感染，接觸的細(xì)菌多為定植菌，與2020年該院統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)[4]一致。本研究發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌感染患兒沒有男女性別差異，年齡集中在30 d～8歲，并且各年齡段之間存在差異，90%的感染發(fā)生在5歲以下兒童。30 d～患兒的病例數(shù)和流感嗜血桿菌構(gòu)成比最高，但是檢出率不高，檢出率最高的年齡段是4歲～，其次是2歲～，≥6歲病例數(shù)明顯降低，此現(xiàn)象可能與學(xué)齡前兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未健全，免疫功能低下有關(guān)，年齡、性別差異與全國多個(gè)地區(qū)報(bào)道[6-8，11，13]一致。1～5歲兒童流感嗜血桿菌感染率高，估計(jì)與此年齡段兒童開始從家庭走進(jìn)社區(qū)，與外界接觸增多，感染風(fēng)險(xiǎn)也增加，也間接證明了流感嗜血桿菌克隆在社區(qū)傳播。

MLST通常被用于細(xì)菌的基因分型，判定菌株親緣關(guān)系，了解細(xì)菌的群體結(jié)構(gòu)及分子流行病學(xué)特點(diǎn)。本研究中，51株流感嗜血桿菌被分為15個(gè)ST型，10個(gè)克隆群，其中ST107是?？诘貐^(qū)春季優(yōu)勢克隆群，其次是ST422、ST103和ST57,另外有5個(gè)獨(dú)立ST型。由此可見，不同個(gè)體分離的流感嗜血桿菌ST型具有較大的差異，說明本地區(qū)流感嗜血桿菌的流行具有較多的遺傳多樣性，且具有克隆傳播趨勢。不足的是，本次用于MSLT的菌株數(shù)少，沒有覆蓋全年各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，無法進(jìn)行季節(jié)性分子流行病學(xué)比較。另外，國內(nèi)尚未見流感嗜血桿菌的分子流行病學(xué)的文獻(xiàn)，暫時(shí)無法進(jìn)行地域性分子流行病學(xué)比較。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。