劉春輝，朱晨，陜文生，王志強，王海，周于娜，金莉婭

1甘肅省婦幼保健院男科，蘭州 730050；2甘肅省婦幼保健院健康管理中心

肥胖是造成精子質量異常的重要影響因素，無論女方是否進行體質量控制，肥胖男性參與的體外受精（IVF）最終活產(chǎn)率明顯低于非肥胖男性參與的IVF［1］。肥胖男性更容易出現(xiàn)精子DNA碎片化率（DFI）過高的問題，且更容易導致女性發(fā)生復發(fā)性流產(chǎn)，這可能與肥胖人群相關的代謝性內毒素血癥有關［2-3］。降低精子DFI的傳統(tǒng)治療方法是服用抗氧化劑，如左卡尼汀、維生素E等，通過將脂肪酸轉運到線粒體中進行β-氧化，以產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）對精子供能，同時催化脂氫過氧化物（Loo-H）產(chǎn)生無害化的羥化物，以降低過氧化脂質的氧化效果，實現(xiàn)保護精子細胞核及精子DNA完整性的目的［4］。此外，使用益生菌可降低肥胖人群的腸道通透性，減少腸道細菌易位，是對抗代謝性內毒素血癥與氧化應激的有效方法［5-6］。但在改善肥胖男性精子DFI方面，益生菌聯(lián)合抗氧化劑較單獨使用抗氧化劑治療是否更具優(yōu)勢尚未可知，為此我們進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料納入標準：①DFI≥15%；②BMI≥30 kg/m2；③年齡20～40歲。排除標準：①合并原發(fā)性性腺功能減退相關疾病，如Klinefelter綜合征、隱睪癥或睪丸損傷；②近期服用免疫抑制劑，如非甾體類抗炎藥、皮質類固醇或魚油等；③近期服用可能改變腸道功能的藥物，如益生菌、抗生素等；④近期服用激素類藥物或抗激素藥物，如芳香化酶抑制劑、克羅米芬、枸櫞酸他莫昔芬、人絨毛膜促性腺激素或睪酮等；⑤近3個月內曾接受過電離輻射檢查，如X線、CT等；⑥合并亞臨床生殖道感染［7］。選取2021年1月—12月在我院男科就診時發(fā)現(xiàn)的符合上述標準的精子DFI異常肥胖男性179例，按照隨機數(shù)字表法分為觀察組89例與對照組90例。觀察組年齡（27.21±4.31）歲，體質量（92.51±5.01）kg，BMI（32.56±1.92）kg/m2，精子DFI 23.63%±6.84%；對照組年齡（26.53±4.30）歲，體質量（94.31±6.31）kg，BMI（31.56±2.62）kg/m2，精 子DFI 22.14%±7.51%。兩組上述資料均具有可比性（P均>0.05）。本研究通過我院醫(yī)學倫理委員會審核［（2021）GSFY倫審04號］，患者均簽署知情同意書。

1.2 治療方法對照組僅口服抗氧化劑左卡尼汀口服液（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字H19990372，規(guī)格1 g），每次1 g，3次/天。觀察組在對照組治療的基礎上口服益生菌地衣芽孢桿菌活菌膠囊（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字S10950019，規(guī)格0.25 g），每次0.5 g，3次/天。兩組均治療3個月。

1.3 指標觀察方法

1.3.1 療效兩組治療后根據(jù)2002版《世界衛(wèi)生組織男性不育標準化檢查與診療手冊》及2007版《中藥新藥臨床研究指導原則》評價療效：治療后DFI降至正常范圍為顯效；治療后DFI雖不正常，但有明顯降低，降低幅度≥10%為有效；治療后DFI無明顯變化，或降低幅度<10%，或升高為無效。以顯效和有效占總例數(shù)的百分比計算總有效率。

1.3.2 精子密度、形態(tài)及DFI兩組治療前后采集禁欲2～7 d的精液樣本2 mL，經(jīng)37℃恒溫箱孵育液化精液，使用采樣器吸取精液樣本10 μL，滴加于精子計數(shù)池表面，經(jīng)SSA-ⅡPLUS精子自動檢測分析系統(tǒng)計算精子密度。取50 μL精液在載玻片上進行涂片，自然干燥后使用WHO推薦的DIFF-QUICK快速染色試劑盒進行染色，采用全自動精子形態(tài)分析軟件計算精子正常形態(tài)率。采用Attune CytPix成像型流式細胞儀測定DFI。所有操作由同一名檢測人員進行，以確保數(shù)據(jù)的精準性。

1.3.3 血清人連蛋白（Zonulin）、脂多糖結合蛋白（LBP）采用ELISA法。取兩組治療前后的空腹靜脈血5 mL，3 500 r/min離心10 min，分離血清。采用ELISA試劑盒檢測血清腸道通透性標志物Zonulin、內毒素標志物LBP水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.4 精液8-羥基脫氧鳥苷（8OHdG）采用ELISA法。取兩組治療前后的精液，經(jīng)3 500 r/min離心10 min，采用ELISA試劑盒檢測精液氧化應激標志物8OHdG水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用S-W正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗，重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以n（%）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組療效比較觀察組顯效31例、有效35例、無效23例，總有效率74.16%（66/89），對照組分別為15、28、47例及47.78%（43/90）；觀察組總有效率明顯高于對照組（P<0.05）。

2.2 治療前后兩組精子密度、正常形態(tài)率及DFI比較治療前后兩組精子密度、正常形態(tài)率比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均>0.05）。與治療前比較，治療后兩組DFI均降低，且觀察組降低更明顯（P均<0.05）。見表1。

表1 治療前后兩組精子密度、正常形態(tài)率及DFI比較［xˉ±s/M（P25，P75）］

2.3 治療前后兩組血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平比較治療后觀察組血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平均低于同組治療前及對照組治療后（P均<0.05）。治療前后對照組上述指標無明顯變化（P均>0.05）。見表2。

表2 治療前后兩組血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平比較［ng/mL，M（P25，P75）］

3 討論

肥胖是21世紀人類面臨的重大社會問題，在過去40年中，全球肥胖患病率大幅上升，從1975年的不足1%到2016年的6%～8%［8］。肥胖可誘發(fā)多系統(tǒng)疾病，例如高血壓、冠心病、胰島素抵抗、代謝綜合征、不孕癥等［9-12］。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖會改變腸上皮通透性，導致腸道細菌易位［13］。過多攝入脂肪可造成腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等多種炎癥因子過度表達，從而使Zonulin大量釋放。Zonulin是一種由腸上皮和肝臟產(chǎn)生的蛋白，其C端tau樣結構域與細胞間緊密連接的細胞骨架重排相關，作用主要是通過調節(jié)細胞間緊密連接，從而控制液體、大分子和白細胞在腸腔與循環(huán)系統(tǒng)之間的流動，通常被認為是腸通透性標志物［14-15］。研究顯示，過度表達的Zonulin可使腸上皮細胞產(chǎn)生寬松的細胞間通道，腸道內細菌則通過此通道易位于腸腔之外［16］。這些腸道內的革蘭陰性菌細胞壁上含有大量的免疫刺激物內毒素黏多糖（LPS），當LBP發(fā)現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)出現(xiàn)了LPS，則迅速與LPS結合形成血清脂多糖結合蛋白—內毒素黏多糖復合物（LBP-LPS），從而激活全身炎癥反應［17］。LBP是肝臟合成的糖蛋白，在正常狀態(tài)下LBP濃度極低，當形成LBP-LPS復合物時，血清LBP迅速升高，可反映代謝性內毒素血癥的嚴重程度［18］。隨著全身炎癥反應的加劇以及內毒素水平的升高，氧化應激隨即發(fā)生。白細胞產(chǎn)生的活性氧（ROS）是一種強氧化劑，在攻擊侵入循環(huán)系統(tǒng)的細菌時，可同時無差別化攻擊睪丸間質細胞、精子細胞，可能進一步造成精子發(fā)生核自凝、細胞核三級結構受損、精子DNA碎片化改變、精子線粒體膜電位異常等［19］。8OHdG是鳥嘌呤堿基受到氧化攻擊而生成的一種氧化加合物，是國際上公認的評價氧化應激嚴重程度的新型生物指標，精液8OHdG水平升高反映了精液ROS的堆積，提示精子受到了氧自由基的攻擊［20］。

傳統(tǒng)的改善精子DNA完整性的治療方法是使用抗氧化劑，如左卡尼汀、天然型維生素E、維生素C等，以及多食用富含超氧化物歧化酶（SOD）的食品。左卡尼汀為水溶性抗氧化劑，是左旋肉堿的通用商品名，通常由食物中攝取或自身合成產(chǎn)生，通過轉運長鏈脂肪酸至線粒體內進行β氧化，為細胞提供能量；絕大多數(shù)的內源性左卡尼汀通常以游離形式供應附睪組織，附睪中左卡尼汀濃度約為血漿中的2 000倍，在促使精子成熟的同時，也為精子供能，并促進乙?；D運出線粒體，以避免乙酰毒素對精子的損害［4］。近年來，益生菌逐漸被應用于肥胖人群這一特殊群體，用以改善腸上皮屏障功能，減少腸道細菌易位，從而減輕炎癥和氧化應激反應［20］。研究顯示，益生菌可以提高精子質量和睪丸激素水平［19］。但益生菌聯(lián)合左卡尼汀對于DFI過高是否同樣具有治療效果，目前鮮見報道。

抗氧化劑治療能夠有效改善精子DNA完整性，但對于肥胖人群這一特殊群體，腸道上皮通透性升高而造成的腸道細菌易位是精子DNA完整性受損的重要致病因素，應當在抗氧化劑治療基礎上加用益生菌，從而減少腸道細菌易位，最大程度避免代謝性內毒素血癥的出現(xiàn)，以及循環(huán)系統(tǒng)來源的ROS對精子細胞核的損傷，這可能是更適合肥胖人群的干預措施。本研究結果顯示，與治療前比較，治療后兩組DFI均降低，且觀察組降低更明顯，觀察組總有效率明顯高于對照組，提示在益生菌的基礎上加用左卡尼汀可更有效地改善肥胖人群的精子DNA完整性；本研究治療后觀察組血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平均低于同組治療前及對照組治療后，提示益生菌對代謝性內毒素血癥、氧化應激具有抑制作用，這種優(yōu)勢可能得益于益生菌獨特的對腸道細菌易位的抑制作用。高溫、精索靜脈反流、附睪內血液回流障礙、生殖道感染等多種因素可使睪丸、附睪產(chǎn)生腺體內氧化應激反應，左卡尼汀在阻止腺體內源性氧化應激損害方面發(fā)揮了重要作用［4］。而對于循環(huán)系統(tǒng)代謝性內毒素血癥產(chǎn)生的氧化應激，左卡尼汀作用則相對較弱，而使用益生菌來預防腸道細菌易位，可減少循環(huán)系統(tǒng)內產(chǎn)生的氧化應激，則可能是更適合肥胖男性這一群體的抗氧化治療方案。本研究治療前后對照組血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平無明顯變化，但對DFI仍有較好的改善效果，可能與部分肥胖人群左卡尼汀自身產(chǎn)生不足有關，因此外源性補充左卡尼汀仍可取得較好的DFI改善效果。

綜上所述，肥胖可造成腸上皮通透性增加而誘發(fā)代謝性內毒素血癥，內毒素水平升高可造成全身炎癥反應、誘導氧化應激反應，由氧化應激引發(fā)循環(huán)系統(tǒng)來源的ROS釋放會造成精子細胞核損傷、DFI升高。在傳統(tǒng)抗氧化治療的基礎上聯(lián)合益生菌可以增強肥胖人群的腸道屏障功能，減少腸道細菌易位，降低或消除全身炎癥反應及氧化應激損傷，從而改善精子DNA完整性。本研究中檢測到的精液參數(shù)無法完全代表廣泛人群，此外還應考慮不同種族人群的遺傳背景和表觀遺傳學差異對實驗結果的影響，未來需進一步完善設計進行深入探討。