李 微 王 賀 侯云鶴 王宇琦 陳一鳴 高 原

(1.沈陽建筑大學市政與環(huán)境工程學院,遼寧 沈陽 110168;2.沈陽后勤集團房地產(chǎn)開發(fā)有限公司,遼寧 沈陽 110117)

盡管對于反硝化除磷工藝參數(shù)及DPAO的研究已有相關報道,但反硝化除磷系統(tǒng)的啟動時效及穩(wěn)定運行狀態(tài)、優(yōu)勢菌群及高效菌種代謝過程對推動反硝化除磷技術的應用具有決定性影響,仍然是研究熱點[3]。本研究以活性污泥為基質(zhì),通過A2-序列間歇式活性污泥法(SBR)反硝化除磷脫氮系統(tǒng)(簡稱A2-SBR)富集并篩選高效的DPAO,采用高通量測序技術探究DPAO馴化過程中微生物種群特性及優(yōu)勢菌群結構變化,分析菌株生理生化及反硝化除磷性能,利用16S rDNA分子生物學技術對高效菌種進行鑒定,考察反應過程中胞內(nèi)聚合物濃度變化,分析高效菌株代謝特征,以期為反硝化除磷技術實際應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

A2-SBR裝置由雙層有機玻璃制成,內(nèi)徑14 cm、高85 cm,有效工作容積為12 L,外層與水浴鍋相連,使系統(tǒng)處于最適溫度。裝置底部裝有微孔曝氣盤,連接空氣泵對活性污泥進行曝氣,頂部安裝電動攪拌器使污泥處于懸浮狀態(tài)充分進行反應,通過蠕動泵向裝置投加KNO3溶液控制缺氧反應條件。整個系統(tǒng)通過在線的pH監(jiān)測儀控制pH,超出設定pH范圍時pH監(jiān)測儀自動通過蠕動泵向裝置內(nèi)滴加酸堿緩沖溶液直至pH達到設定范圍。

反硝化除磷靜態(tài)試驗裝置為有效容積3 L的廣口瓶,通入N2控制厭氧環(huán)境,通過蠕動泵投加30 mg/L KNO3溶液作為電子受體控制缺氧反應條件進行反硝化除磷靜態(tài)試驗。

1.2 試驗材料

污泥取自遼寧省撫順市某污水處理廠的二沉池,試驗用水采用人工配制的模擬生活污水,水質(zhì)情況如下：以CH3COONa作為碳源,控制COD為160～220 mg/L;以KH2PO4作為磷源,控制總磷(TP)為9～12 mg/L;以NH4Cl作為氮源,控制氨氮為5～10 mg/L;添加MgSO4·7H2O、CaCl2及微量元素;用NaHCO3調(diào)節(jié)pH為7.2～7.8。

微量元素：FeCl31.5 g/L、H3BO30.15 g/L、CoCl3·7H2O 0.15 g/L、CuSO4·5H2O 0.03 g/L、MnCl2·4H2O 0.06 g/L、Na2MoO4·4H2O 0.06 g/L、ZnSO4·7H2O 0.12 g/L、KI 0.18 g/L、乙二胺四乙酸10 g/L。

反硝化培養(yǎng)基：Na3C6H5O7·2H2O 5 g/L、KNO31 g/L、KH2PO4·2H2O 1 g/L、K2HPO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、瓊脂15 g/L、pH為7.2～7.4。

聚磷培養(yǎng)基：CH3COONa·3H2O 3.68 g/L、Na2HPO4·2H2O 28.73 mg/L、NH4Cl 57.27 mg/L、MgSO4·7H2O 131.82 mg/L、K2SO426.71 mg/L、CaCl2·2H2O 17.2 mg/L、瓊脂15 g/L、微量元素2 mL/L、pH=7.0。

采用A2-SBR穩(wěn)定運行階段的反硝化聚磷污泥為種泥。

1.3 試驗方法

1.3.1 A2-SBR的運行方案

A2-SBR中,種泥與模擬生活污水混合(混合液懸浮固體質(zhì)量濃度(MLSS)為3 200 mg/L),運行期間24 ℃、pH為7.2～7.8、污泥齡(SRT)為15 d。運行方案分為3個階段：(1)第1階段(第1～15天),瞬時進水→厭氧段2 h→好氧段2 h→沉淀30 min→排水30 min,每天運行3個周期,此階段目的在于對系統(tǒng)中的傳統(tǒng)好氧聚磷菌進行富集;(2)第2階段(第16～35天)采用厭氧/缺氧交替的方式運行,在缺氧段投加35 mg/L KNO3溶液作為電子受體進行DPAO的富集,運行模式為瞬時進水→厭氧段2 h→缺氧段2 h→沉淀30 min→排水30 min,每天運行3個周期;(3)第3階段(第36～50天)與第2階段運行模式相同,進一步確保DPAO的優(yōu)勢菌地位,實現(xiàn)系統(tǒng)高效的運行穩(wěn)定性。

每天取進水、厭氧出水、好氧/缺氧出水的3個平行樣,監(jiān)測COD、TP、硝酸鹽氮。

1.3.2 污泥染色試驗

于穩(wěn)定運行的A2-SBR厭氧、缺氧段取污泥樣品,分別進行PHB、poly-P顆粒染色,步驟參照文獻[4],考察厭氧結束后PHB積累和缺氧結束后poly-P積累的情況。

1.3.3 菌株的分離、篩選與鑒定

利用反硝化、聚磷培養(yǎng)基,采用稀釋涂布法和平板劃線分離法對DPAO進行初步分離和純化[5]。再對分離出來的純菌株進行釋磷吸磷試驗,通過硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗篩選得到具有高效反硝化除磷脫氮功能的菌株。

對上述菌株進行革蘭氏染色后在光學顯微鏡下觀察其形態(tài)及顏色。進一步對其進行生理生化特性試驗,包括接觸酶、氧化酶、葡萄糖氧化發(fā)酵、糖醇發(fā)酵、甲基紅、V-P、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、明膠液化、吲哚試驗。

使用TaKaRa試劑盒將菌株的基因組脫氧核糖核酸(DNA)純化并提取,然后以總DNA為模板利用引物27F和1492R進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。PCR采用50 μL反應體系,反應條件：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃補充延伸5 min;4 ℃終止保存。擴增產(chǎn)物用1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗后進行16S rDNA測序。所得測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST序列的同源性比較,然后構建系統(tǒng)發(fā)育樹[6]。

1.3.4 反硝化除磷脫氮代謝特征試驗

在無菌條件下將菌株活化并富集,將富集好的菌液離心(4 000 r/min,10 min)后,去除上清液,用無菌蒸餾水洗滌后再離心,重復清洗操作3次。將菌液投入反硝化除磷靜態(tài)試驗裝置(反應液為模擬生活污水),控制反應液的600 nm處吸光度為0.3。運行方案與第2階段相同,在厭氧段向裝置中通入N2控制厭氧條件使釋磷反應充分進行,在缺氧段投入一定量的KNO3溶液作為電子受體進行反硝化除磷脫氮反應,定時取樣測定上清液中COD、硝酸鹽氮、TP、PHB、poly-P及糖原的濃度變化。

1.4 檢測方法

PHB采用氣相色譜法測量,將20 mL菌液冷凍干燥后倒入試管中,分別加入1 mg苯甲酸、1.5 mL鹽酸正丙醇溶液(25%(質(zhì)量分數(shù))鹽酸)、1.5 mL氯仿,于100 ℃沸水浴中進行酯化反應2 h,待樣品冷卻后加入無菌蒸餾水至5 mL后離心,取有機相下層溶液進行氣相色譜分析[7]。COD采用快速密閉催化消解法測定;TP采用鉬銻抗分光光度法測定;硝酸鹽氮采用紫外分光光度法測定;糖原采用硫酸-蒽酮法測定;poly-P采用過硫酸鉀-鉬銻抗分光光度法測定;MLSS采用濾紙稱重法測定[8]。pH采用PHS-25型pH計檢測。

高通量測序：取不同階段的活性污泥反復清洗離心3次后置于-80 ℃中保存。采用十六烷基三甲基溴化銨法提取樣本基因組,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。取出適量的樣本DNA放入離心管中,利用無菌蒸餾水將樣本DNA稀釋至1 ng/μL,以稀釋后的基因組DNA為模板,采用引物341F與806R對16S rDNA V3～V4區(qū)序列進行擴增,用New England Biolabs公司的Phusion8 High-Fideity PCR MaterMix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR,確保擴增效率和準確性。PCR擴增后的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,得到PCR擴增凝膠電泳圖。使用TuSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒構建文庫,經(jīng)過Qubit和定量PCR,待構建好的文庫合格后使用NovaSeq 6000進行上機測序[9]。

2 結果與討論

2.1 DPAO定向富集及系統(tǒng)運行

系統(tǒng)中污泥馴化及穩(wěn)定運行階段COD去除效果見圖1(a)。1～15 d系統(tǒng)進行厭氧/好氧反應,污泥馴化1～3 d,進水COD平均為217.94 mg/L,厭氧、缺氧出水COD平均為97.09、62.70 mg/L;系統(tǒng)馴化第8～11天,厭氧出水COD平均為66.41 mg/L,進水中碳源量遠超出聚磷菌新陳代謝所需的碳源量,厭氧結束剩余外碳源進入好氧段會被其他異養(yǎng)菌消耗,COD去除效果不會受到影響,COD去除率曲線仍然呈上升趨勢;第12天后,降低進水外碳源量,進水COD平均為180.06 mg/L,厭氧反應結束剩余外碳源含量降低,有利于聚磷菌缺氧反硝化吸磷反應,COD去除效果逐漸穩(wěn)定,反應結束好氧出水COD平均為22.27 mg/L,COD平均去除率為87.75%。第16～35天的厭氧/缺氧反應,COD去除率無明顯波動,COD平均去除率為87.47%。隨后系統(tǒng)繼續(xù)在厭氧/缺氧條件下穩(wěn)定運行至第50天,COD平均去除率為89.16%。由此可見,系統(tǒng)不同運行模式對COD去除無明顯影響,活性污泥的生物降解性能良好。

圖1 COD、TP和硝酸鹽氮去除效果Fig.1 Removal of COD,TP and nitrate nitrogen

在厭氧/好氧條件下對系統(tǒng)中污泥進行活化使其具有高效的好氧除磷能力,為后續(xù)DPAO富集做好準備。污泥馴化及系統(tǒng)穩(wěn)定運行過程中TP的變化見圖1(b)。污泥馴化初期,磷的去除效果并不明顯,富集第2天由于自動控制系統(tǒng)(PLC)故障,厭氧段電動攪拌器沒有啟動,泥水混合不夠均勻,導致聚磷菌厭氧釋磷反應不充分,釋磷量最低僅為4.77 mg/L,自PLC調(diào)整后污泥釋磷效果有一定增強,TP去除率先逐漸上升后又趨于平緩,這與進水中碳源量遠超出聚磷菌新陳代謝所需的碳源量,厭氧結束剩余外碳源進入缺氧段也會被其他異養(yǎng)菌所利用,進而影響到聚磷菌優(yōu)勢菌群地位的研究結果相一致;富集進行到第12～15天,厭氧釋磷量和缺氧吸磷量均有明顯提高,TP去除率呈階梯狀上升且除磷效果穩(wěn)定,系統(tǒng)內(nèi)最大釋磷量達到29.74 mg/L,吸磷率由44.92%提高至97.09%,好氧出水TP平均為0.33 mg/L,達到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》(GB 18918-2002)一級A標準(≤0.5 mg/L),此時系統(tǒng)具有穩(wěn)定除磷效果,聚磷菌已成為系統(tǒng)內(nèi)優(yōu)勢菌種。在1～15 d污泥馴化過程中,污泥絮體量增加且顏色呈黃褐色,此時認定傳統(tǒng)聚磷菌富集成功,可進行DPAO富集階段。第16天開始厭氧/缺氧模式,由于高濃度硝酸鹽溶液的沖擊,TP去除率驟然降低至62.05%。第16～22天系統(tǒng)TP去除率略微上升,平均去除率為64.38%。

缺氧出水硝酸鹽氮變化趨勢與TP不一致,16～19 d硝酸鹽氮去除率相對較低,20～22 d明顯提升(見圖1(c)),分析認為：厭氧/缺氧反應開始時系統(tǒng)中DPAO數(shù)量較少,仍然有常規(guī)反硝化菌利用硝酸鹽氮進行反硝化反應。隨著系統(tǒng)連續(xù)運行,污泥慢慢適應高濃度硝酸鹽氮,23～50 d脫氮除磷效果先持續(xù)提高后長期保持穩(wěn)定狀態(tài),第23天缺氧出水TP和硝酸鹽氮去除率分別穩(wěn)定在95%、91%左右,由此可推測系統(tǒng)脫氮除磷除活性污泥吸附和同化型氮、磷物質(zhì)吸收轉化為細胞物質(zhì)貢獻少量去除率,主要發(fā)生聚磷菌的反硝化吸磷反應,可確認第23天DPAO富集成功且處理效果穩(wěn)定,A2-SBR啟動成功。

PHB和poly-P顆粒染色結果見圖2。厭氧活性污泥中明顯可見PHB顆粒,PHB在聚磷菌細胞質(zhì)內(nèi)屬于類脂性質(zhì)的碳源類貯藏物,PHB好氧分解產(chǎn)生質(zhì)子移動力,進而吸收磷酸鹽合成poly-P和三磷酸腺苷(ATP)。缺氧段發(fā)生了poly-P積累,證明發(fā)生了缺氧吸磷反應,進一步確定A2-SBR內(nèi)有大量反硝化聚磷菌。

圖2 PHB和poly-P顆粒染色Fig.2 Stained PHB and poly-P particles

2.2 微生物菌群結構分析

為研究污泥馴化及穩(wěn)定運行過程中系統(tǒng)微生物群落的變化,分別在第1、12、42天從系統(tǒng)中取污泥樣品進行高通量測序,樣品編號分別為S1、S2、S3,利用序列分類全局比對從綱水平對富集過程中污泥樣品進行分類學分析,闡述污泥馴化過程中微生物菌群結構。污泥樣品中α-變形菌綱(Proteobacteria)、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、σ-變形菌綱和δ-變形菌綱相對豐度占比較大,其中S3中β-變形菌綱占比最大(相對豐度為15.34%),γ-變形菌綱相對豐度由S1中的9.45%升到S3中的15.09%,兩者是反硝化除磷污泥系統(tǒng)中主要菌綱;α-變形菌綱、σ-變形菌綱、δ-變形菌綱相對豐度分別由S1中8.67%、11.92%、8.86%降低到S3中的3.22%、7.31%、3.87%。JOHWAN等[10]利用變性梯度凝膠電泳技術分析電子受體對DPAO菌群結構影響時發(fā)現(xiàn),以硝酸鹽氮作為電子受體時DPAO屬于優(yōu)勢菌種,且這些菌種屬于β-變形菌綱和γ-變形菌綱。ZHANG等[11]在A2O系統(tǒng)強化反硝化除磷及菌群結構分析中得到相同的結論,由此進一步證實,本系統(tǒng)中DPAO逐漸被富集成為優(yōu)勢菌種,而S3中變形菌綱相對豐度為44.47%并不占絕對優(yōu)勢,系統(tǒng)缺氧出水TP和硝酸鹽氮去除率均穩(wěn)定在90%左右,由此推測系統(tǒng)中會存在其他反硝化除磷菌綱。3個污泥樣品其他共同主導綱包括嗜熱菌綱(Ignavibacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、浮霉菌綱(Planctomycetia)、疣微菌綱(Verrucomicrobiae)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)(見圖3)。污水處理膜生物反應器厭氧菌群馴化中發(fā)現(xiàn),嗜熱菌綱逐漸成為系統(tǒng)的主要菌綱,其占比由初始不到1%逐漸上升為54%[12]。美國舊金山一污水處理廠利用微藻生長離岸薄膜系統(tǒng)培育藻類,污水中含有高濃度有機物且其微生物菌綱以纖維黏網(wǎng)菌綱、黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱為主。SBR菌群結構研究發(fā)現(xiàn),溶解氧較低的厭氧層中具有反硝化功能的厭氧繩菌綱和擬桿菌綱的比例逐漸提高[13]。

圖3 綱水平相對豐度Fig.3 Relative abundance at class level

2.3 菌株篩選與鑒定

2.3.1 菌株篩選與形態(tài)特征

于穩(wěn)定運行的A2-SBR污泥中分離得到20株菌株,通過脫氮除磷率試驗、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗優(yōu)選出一株兼具反硝化和除磷功能的高效菌株PD1。PD1的TP和硝酸鹽氮的去除率分別達到91.24%和92.83%,且硝酸鹽還原產(chǎn)氣結果為陽性,可見PD1具有明顯的反硝化除磷脫氮能力。培養(yǎng)48 h后觀察單個菌落，PD1為橘紅色、不透明,表面濕潤光滑微凸,質(zhì)地較軟,光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PD1為革蘭氏陽性菌,短桿狀,常呈“V”字形生長,無芽孢,無鞭毛,無運動性。生理生化特性研究結果顯示：葡萄糖氧化發(fā)酵結果為發(fā)酵型,硝酸鹽還原及亞硝酸鹽還原均為陽性,即PD1能在缺氧條件下以硝酸鹽或亞硝酸鹽為電子受體,將其還原為N2,從而表現(xiàn)出反硝化功能;檸檬酸鈉利用為陽性,表明PD1可利用檸檬酸鹽等有機化合物作為碳源;甲基紅、糖醇發(fā)酵、接觸酶、吲哚試驗均為陽性;V-P測定、氧化酶試驗、明膠液化均為陰性。

2.3.2 菌株鑒定及發(fā)育樹構建

以PD1總DNA基因組為模板PCR擴增獲得一段1 349 bp的16S rDNA基因序列,將PD1的16S rDNA基因序列提交到GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov),得到GenBank登錄號KC905040。利用BIOEDIT和MEGA軟件,以鄰接法繪制16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。PD1與多株副球菌屬(Paracoccussp.)同源性均達到95%(見圖4),結合形態(tài)特征及生理生化特性,可將PD1最終鑒定為副球菌屬。DPAO多為氣單胞菌屬(Aeromonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)及假單胞菌屬(Pseudomonas)[14],而副球菌屬多用于處理石油廢水[15],本研究首次發(fā)現(xiàn)具有反硝化聚磷功能的副球菌屬。

圖4 菌株發(fā)育樹Fig.4 Species phylogenetic tree

2.4 PD1在厭氧/缺氧條件下的代謝特征

2.4.1 PD1厭氧代謝特征

PD1厭氧/缺氧反應中基質(zhì)變化曲線見圖5。厭氧混合液中COD降低108.24 mg/L,TP上升了18.01 mg/L,poly-P降低了82.13 mg/L,厭氧釋磷效果明顯。PHB上升了81.85 mg/L,由PHB的氧化反應可計算出PHB與COD的換算比為1.674,即以COD計PHB變化量(ΔPHB)為137.01 mg/L;糖原下降了45.19 mg/L,由糖原的氧化反應式可知糖原與COD的換算比為1.067,即以COD計糖原變化量(Δ糖原)為48.22 mg/L,此時Δ糖原/ΔPHB=0.352,表明35.2%的PHB是由糖原生成,因此將有88.79 mg/L PHB是由外碳源轉化(即ΔCOD有效),說明有82%外碳源轉化為PHB貯存于細胞體內(nèi),而其余18%的外碳源用以維持細胞在厭氧段的基本代謝。這與文獻[16]的DPAO在厭氧條件下通過糖原酵解和胞內(nèi)poly-P水解獲取ATP并合成PHB儲存于體內(nèi)的代謝模式相同。厭氧120 min,TP變化量(ΔP)/ΔCOD有效=0.202,即每1 mg COD轉化為PHB時釋放0.202 mg磷,表現(xiàn)出較好的釋磷特性,這與王亞宜等[17]在研究碳源濃度對反硝化聚磷影響時的結果相似。在研究厭氧釋磷時,COD的有效轉化量既影響磷的釋放又影響PHB的合成,而PHB的合成繼而影響后續(xù)缺氧反硝化除磷效果,因此需重點跟蹤ΔP/ΔCOD有效來判斷反硝化除磷效果。

圖5 PD1厭氧/缺氧反應中基質(zhì)變化曲線Fig.5 Matrix change curve in anaerobic/anoxic reaction of PD1

2.4.2 PD1缺氧代謝特征

缺氧150 min(即270 min),TP下降了25.59 mg/L,poly-P升高了89.39 mg/L,磷的去除率為92.64%。PHB降低了85.68 mg/L(即ΔPHB=143.43 mg/L),硝酸鹽氮降低了27.84 mg/L,COD僅下降了19.86 mg/L,說明缺氧段硝酸鹽氮的去除并非消耗外碳源而是消耗細菌胞內(nèi)PHB完成的。因此,DPAO在缺氧反硝化吸磷過程中對硝酸鹽氮的去除效果應由硝酸鹽氮變化量(ΔN)/ΔPHB表征,而不是ΔN/COD變化量(ΔCOD)。并且缺氧反應中糖原相比厭氧結束后增加了51.32 mg/L(即Δ糖原=54.76 mg/L),此時Δ糖原/ΔPHB=0.382,有88.67 mg/L糖原是由PHB轉化(即ΔPHB有效)。缺氧吸磷反應過程中能提供電子供體的有效碳源為內(nèi)碳源PHB,反應過程中PHB分解產(chǎn)生的ATP用于合成糖原及poly-P[18],所以研究反硝化聚磷效果時可用ΔP/ΔPHB有效考察缺氧吸磷效果。缺氧吸磷結果表明：缺氧段ΔP/ΔPHB有效(0.289,即每分解1 mg PHB時吸收0.289 mg磷)>厭氧段ΔP/ΔCOD有效(0.202),表明PD1可吸收過量磷以達到除磷的目的。

3 結 論

(1) 23 d A2-SBR啟動成功,缺氧出水TP和硝酸鹽氮去除率分別穩(wěn)定在95%、91%左右和β-變形菌綱和γ-變形菌綱占主導地位。

(2) PD1與多株副球菌屬同源性均達到95%,結合形態(tài)特征及生理生化特性,可將PD1最終鑒定為副球菌屬。

(3) 在厭氧段PD1將每1 mg COD轉化為PHB時釋放0.202 mg磷,poly-P水解獲取ATP并合成PHB;在缺氧段每分解1 mg PHB時將吸收0.289 mg磷,分解PHB產(chǎn)生的ATP用于合成糖原及poly-P。