張媛媛，潘李燕，魯 莉，智深深，鄔文燕

重慶大學附屬中心醫(yī)院/重慶市急救醫(yī)療中心檢驗科,重慶 400014

西弗射盾子囊霉屬子囊菌類酵母菌，其可通過有性繁殖在子囊中產(chǎn)生子囊孢子，雖與孢子絲菌屬和念珠菌屬同源，但二者形態(tài)與生長屬性有明顯區(qū)別[1]。西弗射盾子囊霉是一種少見的機會致病真菌，目前對其致病性的研究較少[2-3]。相關文獻報道，西弗射盾子囊霉可能為人體表面或腸道中的正常菌群，當機體免疫力低下時，可引起甲溝、外耳道等部位的感染，嚴重時可導致患者腹膜、腦膜等部位的深部感染和系統(tǒng)性感染[4-5]。本文報道了1例由西弗射盾子囊霉引起雙耳疼痛、聽力下降的病例，從該菌的形態(tài)學、培養(yǎng)鑒定技術、藥物敏感性等方面闡述現(xiàn)代檢驗技術對臨床少見病原菌菌種的鑒定和實施精準治療的重要性。

1 病例資料

患者，男，64歲，因“掏耳后雙耳疼痛、聽力下降、流液5 d”就診于本院耳鼻喉科門診?；颊唠p側(cè)外耳道充血，可見白色分泌物附著，內(nèi)部結(jié)構窺視不清。耳鏡檢查可見右耳道大量膿性分泌物，耳道皮膚充血，鼓膜充血水腫，下方小穿孔可見波動，表面分泌物附著；左耳道壁見白色霉菌附著，鼓膜充血。左耳分泌物真菌涂片熒光染色查見菌絲(圖1)，故以真菌性外耳道炎收治入院。

注：箭頭所示為真菌菌絲、孢子。

患者既往有高血壓史，口服硝苯地平1片/天降壓治療，自訴血壓控制尚可。入院后測血壓116/78 mm Hg，根據(jù)患者既往病史診斷為高血壓?；颊叻裾J有糖尿病史，入院時查隨機血糖為11.57 mmol/L,完善口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)及糖化血紅蛋白等檢查進一步明確診斷。OGTT提示餐后2 h血糖顯著升高，達糖尿病診斷標準，胰島素及C肽釋放試驗結(jié)果提示患者存在胰島素抵抗及胰島素釋放延遲，考慮為2型糖尿病。相關實驗室檢查結(jié)果：降鈣素原(PCT)0.08 ng/mL，白細胞介素-6(IL-6)<0.01 pg/mL，糖化血紅蛋白6.8%，甘油三酯(TG)3.74 mmol/L,尿酸436 μmol/L,乳酸2.72 mmol/L，尿糖++++，尿蛋白+。血常規(guī)、凝血功能、肝功能指標檢測未見異常。

2 病原菌培養(yǎng)與鑒定

2.1菌落形態(tài)及鏡下形態(tài) 將左耳分泌物接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、嗜血桿菌巧克力瓊脂選擇培養(yǎng)基，于35 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后血平板可見未溶血葡萄球菌生長，巧克力平板未見菌落生長，將原始血平板、巧克力平板放入CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后巧克力平板上可見2個直徑約2 mm、表面干燥的白色菌落生長，經(jīng)革蘭染色，鏡下可見真、假菌絲和孢子，菌體周圍可見一層透明淺莢膜帶(圖2)。

圖2 西弗射盾子囊霉孢子、菌絲(革蘭染色，×1 000)

將巧克力平板上白色小菌落轉(zhuǎn)種至沙保羅平板，原始血平板、巧克力平板繼續(xù)于35 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。96 h后血平板上可見葡萄球菌與小菌落混合生長(圖3A)，巧克力平板上見毛絨狀菌落生長(圖3B)；24 h后沙保羅平板上見白色圓形菌落生長(圖3C)。將沙保羅平板繼續(xù)于35 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，至11 d時菌落逐漸變得干燥，表面可見腦回狀皺褶，菌落與培養(yǎng)基鑲嵌，不易挑取和研磨，見圖4。將沙保羅平板培養(yǎng)的菌落進行革蘭染色涂片、鏡檢，鏡下可見革蘭陽性酵母樣真菌及細長菌絲，孢子呈圓形或卵圓形，周圍可見淺透明帶，見圖5。

注：A為血平板培養(yǎng)結(jié)果；B為巧克力平板培養(yǎng)結(jié)果；C為沙保羅平板培養(yǎng)結(jié)果。

圖4 沙保羅平板培養(yǎng)11 d結(jié)果

圖5 沙保羅平板培養(yǎng)11 d后菌落鏡下形態(tài)(革蘭染色，×1 000)

2.2菌種鑒定

2.2.1基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(MALDI-TOF MS)鑒定 取沙保羅平板上培養(yǎng)的純菌落，將其點在質(zhì)譜靶板上，加1 μL 70%甲酸溶液進行蛋白裂解，干燥后加1 μL CHCA基質(zhì)液充分混勻，靜置、干燥后在質(zhì)譜儀上進行鑒定。質(zhì)譜鑒定結(jié)果為西弗射盾子囊霉(置信度75分)。

2.2.2Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及配套YST鑒定卡鑒定 取沙保羅平板上培養(yǎng)的菌落，用0.45%NaCl溶液中配制成2.0麥氏濁度的菌懸液，采用Vitek YST卡進行鑒定，鑒定結(jié)果為西弗射盾子囊霉，可信度為93.0%。

2.2.316S DNA測序 采用EasyPure?Genomic DNA Kit試劑盒提取分離菌株的DNA。使用真菌通用引物ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL，包括2×PCR Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。陽性產(chǎn)物送重慶默賽樂生物技術有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed網(wǎng)站BALST比對,同源性為99.74%。

2.3藥敏試驗 采用Sensititre YeastOne進行真菌藥敏試驗，取沙保羅平板上的菌落制備成為0.5麥氏濁度的菌懸液，取20 μL菌懸液加入真菌藥敏液中混勻，試劑板每孔加入混勻后的真菌藥敏液100 μL，密封后于35 ℃孵育48 h后測得體外最低抑菌濃度(MIC)分別為阿尼芬凈0.03 mg/L、米卡芬凈0.03 mg/L、卡泊芬凈0.03 mg/L、5-氟胞嘧啶 2 mg/L、泊沙康唑 0.25 mg/L、伏立康唑 0.12 mg/L、伊曲康唑0.5 mg/L、氟康唑32 mg/L、兩性霉素B 2 mg/L。參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI) M60S2、CLSI M59和歐洲藥敏試驗委員會(EUCAST) Version 9.0中念珠菌藥敏試驗結(jié)果判定規(guī)則，該菌對氟康唑耐藥。

3 治 療

給予患者外耳道耵聹沖洗，萘替芬酮康唑乳膏外用，口服抗菌藥物伊曲康唑膠囊0.2 g/d，微波治療2次/天，每次10 min。同時給予二甲雙胍緩釋片0.5 g 2次/天及達格列凈片10 mg 1次/天聯(lián)合降血糖治療。治療12 d后，患者雙耳無明顯流液，聽力較前提高，雙耳疼痛明顯好轉(zhuǎn)，外耳道通暢，充血好轉(zhuǎn)，水腫吸收，雙耳未見異常分泌物。

4 討 論

西弗射盾子囊霉屬于酵母菌亞門、酵母菌綱、酵母菌目、酵母菌科，需與念珠菌、隱球菌鑒別。本例患者左耳分泌物直接涂片查見菌絲，根據(jù)涂片中菌絲、孢子的形態(tài)特點，可大致對真菌種屬進行區(qū)分，可為臨床經(jīng)驗性用藥提供重要參考。標本直接涂片法經(jīng)濟易行，在快速識別真菌感染中具有重要價值。白假絲酵母菌在科瑪嘉顯示平板上呈翠綠色，生長速度明顯快于西弗射盾子囊霉，菌落呈光滑奶油樣，延長培養(yǎng)時間不能形成腦回狀菌落。西弗射盾子囊霉在科瑪嘉顯色平板上形成中心藍色、邊緣白色的腦回狀菌落。鏡下白假絲酵母菌呈橢圓形，菌絲為假菌絲，墨汁染色無透明帶，而西弗射盾子囊霉革蘭染色可見厚壁孢子、芽生孢子，可見真菌絲和假菌絲，墨汁染色可見一層透明淺莢膜帶，與新型隱球菌的厚莢膜有明顯差別。

本病例采用病原菌培養(yǎng)、涂片染色及傳統(tǒng)的生化反應完成了菌株鑒定，同時采用質(zhì)譜技術(MALDI-TOF MS)鑒定菌株，兩種方法鑒定結(jié)果一致，且后者的報告時間較前者縮短24 h。最后采用16S DNA測序分析，證實此菌株為西弗射盾子囊霉，進一步驗證了各種鑒定技術結(jié)果的一致性。近年來，各種少見致病菌或新的菌種被檢出和發(fā)現(xiàn)，不但需要微生物檢驗人員不斷深入了解和研究菌株的生物學特性與致病性，同時也需要充分應用新的檢測手段，協(xié)助臨床對疾病實現(xiàn)快速診治。

西弗射盾子囊霉檢出率較低，目前尚未建立該菌的MIC標準，實驗室大多參照念珠菌的判定標準[2]。西弗射盾子囊霉菌落干燥，且鑲嵌在平板里，菌落不易挑取和混勻，因此實施藥敏鑒定時需將菌落研磨后調(diào)整菌懸液濃度。西弗射盾子囊霉對抗真菌藥物的耐藥性較高，主要表現(xiàn)為對氟康唑耐藥，本例患者檢出的菌株對氟康唑耐藥，與相關文獻報道一致[6-7]。研究表明，真菌耐藥機制主要與膜通透性降低、細胞壁合成障礙等相關[8-9]，西弗射盾子囊酶的耐藥機制是否與已知的耐藥機制一致尚需進一步研究。近年來侵襲性真菌的耐藥率逐年上升，對少見菌株進行快速、準確地鑒定及藥敏試驗，對臨床精準抗真菌治療具有重要意義。

西弗射盾子囊霉是一種條件致病真菌，在免疫力正常的個體中極少致病或僅出現(xiàn)淺表感染。隨著激素及其他免疫抑制劑類藥物的廣泛使用，西弗射盾子囊霉等少見真菌引起的感染逐年增多，尤其是合并惡性腫瘤、糖尿病、粒細胞減少癥等基礎疾病的患者，可能出現(xiàn)深部感染，甚至系統(tǒng)性感染，導致嚴重后果[10-11]。目前報道顯示，西弗射盾子囊霉淺表感染以耳部、皮膚、足部等較為常見，深部感染及系統(tǒng)性感染以腹膜、腦膜等最為常見[12-14]。該菌可導致新生兒血流感染，慢性阻塞性肺疾病患者肺部感染，免疫功能低下患者血流和中心靜脈感染等。在一項針對慢性腹瀉患者的研究中發(fā)現(xiàn)，該菌可加重身體衰弱、免疫功能低下、幼兒及老年人等免疫功能低下人群腹瀉的嚴重程度，導致嚴重脫水、營養(yǎng)不良，甚至休克。西弗射盾子囊霉可引起腫瘤患者和粒細胞減少患者發(fā)生播散性念珠菌病這一嚴重并發(fā)癥，可引發(fā)患者發(fā)生膿毒血癥、多器官功能衰竭，甚至死亡。本例患者入院隨機血糖檢測結(jié)果為11.57 mmol/L,結(jié)合OGTT等相關檢測結(jié)果，符合2型糖尿病的診斷，屬于西弗射盾子囊霉感染的高危人群。西弗射盾子囊霉相關的慢性化膿性中耳炎常表現(xiàn)為耳道流膿，膿液呈黃色略帶臭味，常伴耳鳴，甚至引起聽力下降，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。本病例中患者年齡>60歲，隨著年齡的增長，皮膚黏膜屏障功能下降，免疫及其調(diào)節(jié)功能減低，易出現(xiàn)感染等其他并發(fā)癥[15]。因此，須盡快明確病原菌，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果開展精準治療，降低嚴重系統(tǒng)性感染的發(fā)生風險。

綜上所述，對發(fā)生淺表感染的老年糖尿病患者進行病原學檢測時應考慮少見真菌感染的可能。本研究通過鏡下形態(tài)、菌落形態(tài)、生化反應初步識別病原菌，結(jié)合先進的檢測技術快速鑒定病原菌并進行藥敏試驗，為臨床早期開展精準治療提供重要依據(jù)。同時，抗菌藥物的敏感性降低不可避免，積極開展藥敏試驗，對發(fā)現(xiàn)和了解耐藥性的傳播以及降低耐藥率也具有重要意義[16]。因此實驗室應綜合利用多種檢測方法，提高對少見病原菌的鑒定能力。