何禎碩，高 盼，張麗月 綜述,劉萬紅△ 審校

1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.河北省衡水市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北衡水 053200

2019年出現(xiàn)的新型冠狀病毒感染給全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了巨大挑戰(zhàn)，2020年2月國際病毒分類委員會將該新型冠狀病毒命名為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2),由SARS-CoV-2感染而引起的疾病命名為COVID-19。雖然COVID-19的病死率不及2003年的SARS以及2012年的中東呼吸綜合征(MERS)[1-3]，但是SARS-CoV-2傳播速度快、傳播能力強(qiáng)等特點(diǎn)使其防控難度顯著增加。感染SARS-CoV-2的癥狀主要為干咳、發(fā)熱、乏力以及肌肉酸痛等[4-5]，該癥狀與普通流行性感冒癥狀很難區(qū)分，對臨床醫(yī)師通過癥狀篩查來說是一種巨大的挑戰(zhàn)。目前SARS-CoV-2在分子診斷中的金標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)[6-8]。雖然RT-PCR技術(shù)在檢測SARS-CoV-2方面具有高度特異性與靈敏度，但它需要特殊的核酸檢測實(shí)驗(yàn)室以及經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)檢驗(yàn)人員對結(jié)果進(jìn)行分析，而且檢測周期較長，這在發(fā)展落后的地區(qū)很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用。因此有必要研究一種簡單、方便、廉價、特異性強(qiáng)且不需要專門儀器設(shè)備的檢測方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)以及基于LAMP的各種聯(lián)合檢測技術(shù)在SARS-CoV-2檢測中的迅速發(fā)展，使其有望取代傳統(tǒng)的PCR技術(shù)成為一種更加靈敏且特異的SARS-CoV-2檢測方法。本文詳細(xì)綜述了SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、人類感染機(jī)制、LAMP檢測原理以及LAMP技術(shù)在SARS-CoV-2檢測中的研究進(jìn)展。

1 SARS-CoV-2病原學(xué)特點(diǎn)

1.1冠狀病毒特點(diǎn)與分類 冠狀病毒通常為典型的球形或多形性，得名于刺突蛋白突出的低聚物，這些低聚物在病毒粒子周圍形成冠狀邊緣，形似日冕[9]。在病毒基因結(jié)構(gòu)方面，冠狀病毒都有相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即單股正鏈RNA病毒，全基因組長度26～32 kb，是套病毒目中最大的一組病毒科。冠狀病毒包含一段約30 kb不分節(jié)段的正義RNA基因組，該基因組包含一個5′帽結(jié)構(gòu)與一個3′多聚A尾結(jié)構(gòu)[10]。 5′帽結(jié)構(gòu)當(dāng)中包含兩個不同區(qū)域，即前導(dǎo)序列與非翻譯區(qū)(UTR)，在5′的UTR區(qū)域中包含多個RNA復(fù)制和翻譯所需的頸環(huán)結(jié)構(gòu)；3′端的UTR區(qū)域還包括病毒RNA復(fù)制與合成所需的RNA結(jié)構(gòu)。冠狀病毒含有4種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別為刺突(S)、膜(M)、包膜(E)、核衣殼(N)蛋白[11]。

冠狀病毒科進(jìn)一步可細(xì)分為4個屬即α、β、γ、δ[10]。到目前為止能夠引起人類感染的冠狀病毒主要包括7種，分別為α屬的HCoV-229E、HCoV-NL63，β屬的HCoV-OC43、HCoV-HKU1以及2003年的SARS-CoV、2012年的MERS冠狀病毒(MERS-CoV)與2019年的SARS-CoV-2[12-14]。

1.2SARS-CoV-2特點(diǎn)

1.2.1SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)特點(diǎn) SARS-CoV-2是一種單股正鏈RNA有包膜的冠狀病毒?；蚪M大小為29 891個核苷酸，編碼9 860個氨基酸，G+C含量約為38%。SARS-CoV-2基因包含2個非翻譯區(qū)與1個編碼多聚蛋白的長開放閱讀框，基因組排列順序?yàn)?′-復(fù)制酶(ORF1a/b)-結(jié)構(gòu)蛋白[S蛋白-E蛋白-M蛋白-N蛋白]-3′，整個結(jié)構(gòu)缺乏血凝素酯酶基因。在SARS-CoV-2中，ORF1a/b編碼16種非結(jié)構(gòu)蛋白，約占整個基因組的67%，這些非結(jié)構(gòu)蛋白包括兩種病毒性半胱氨酸蛋白酶[木瓜蛋白酶樣蛋白酶(nsp3)和胰凝乳蛋白酶(nsp5)]，RNA依賴的RNA聚合酶(nsp12)、解旋酶(nsp13)，以及其他可能參與病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白[15]。

SARS-CoV-2與SARS-CoV的主要區(qū)別在于ORF3b、S蛋白和ORF8，其中在S蛋白S1和ORF8中尤為明顯，這兩個位點(diǎn)之前被認(rèn)為是重組的熱點(diǎn)。ZHOU等[16]的分析發(fā)現(xiàn)，部分SARS-CoV-2基因與SARS-CoV的核苷酸序列同源性低于80%。然而，ORF1a/b區(qū)域中用于分類的7個保守復(fù)制酶域氨基酸序列在SARS-CoV-2與SARS-CoV中同源性卻高達(dá)94.4%。他們還發(fā)現(xiàn)，一種蝙蝠冠狀病毒(BatCoV RaTG13)的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)短區(qū)與SARS-CoV-2具有極高的序列同源性，全基因組序列一致性高達(dá)96.2%。在所有的序列當(dāng)中，RaTG13表現(xiàn)出與SARS-CoV-2最近的親緣關(guān)系，這與其他與SARS相關(guān)的冠狀病毒(SARSr-CoVs)形成了截然不同的譜系。其次，在SARS-CoV-2中，S基因所編碼的受體結(jié)合S蛋白與其他SARS-CoV的S蛋白存在很大差異，而與RaTG13 S蛋白的一致性高達(dá)93.1%，SARS-CoV-2與RaTG13的S蛋白長度遠(yuǎn)高于其他與SARS相關(guān)的冠狀病毒S蛋白。同樣，在LU等[17]的分析中證明SARS-CoV-2編碼的S蛋白較SARS-CoV和MERS-CoV的S蛋白更長。

1.2.2SARS-CoV-2的感染機(jī)制 冠狀病毒的感染機(jī)制主要與S蛋白相關(guān)。S蛋白是一個相對分子質(zhì)量約180×103的跨膜同源三聚體糖蛋白，為Ⅰ類融合蛋白。對于大多數(shù)冠狀病毒來說，宿主蛋白將S蛋白切割處理成兩個亞基即S1和S2，它們在預(yù)融合構(gòu)象中以非共價結(jié)合形式存在[18-22]。SARS-CoV-2的S1亞基主要功能區(qū)包括N端結(jié)構(gòu)域(NTD)、受體結(jié)合域(RBD)以及受體結(jié)合基序(RBM),S2亞基包括兩個七肽重復(fù)序列(HR)即HR1與HR2，跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)、胞質(zhì)域(CP)以及融合肽(FP)[23]。S1亞基主要負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，而S2亞基在介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞融合并進(jìn)入宿主細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，HR1與HR2可以相互作用形成六螺旋束(6-HB)，從而使病毒與細(xì)胞膜接近，以便相互融合。

與SARS-CoV、MERS-CoV一樣，SARS-CoV-2 S蛋白S1亞基中的RBD區(qū)域能夠特異性識別宿主受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)，并使其作為自身功能性受體而進(jìn)入宿主細(xì)胞[16,24-25]。人類ACE2由一個N端肽酶結(jié)構(gòu)域(PD)與一個C端收集素樣結(jié)構(gòu)域(CLD)組成，CLD末端有一個跨膜螺旋和一個約40個殘基的包內(nèi)段[26]。有研究表明，SARS-CoV-2 S蛋白的胞外域主要與人類ACE2的PD區(qū)域結(jié)合，其親和力約15 nmol/L，較SARS-CoV S蛋白的親和力高約10～20倍[27]。另外，SHANG等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，與SARS-CoV RBM區(qū)域相比，SARS-CoV-2 RBM區(qū)域形成更大的結(jié)合界面，與人類ACE2的接觸面積更多，其原因可能為SARS-CoV-2和SARS-CoV RBM的一種結(jié)構(gòu)(即人類ACE2結(jié)合脊的環(huán)狀構(gòu)象)存在顯著差異。人類和果子貍SARS-CoV毒株以及蝙蝠冠狀病毒Rs3367在這個環(huán)狀結(jié)構(gòu)中都含有一個3個殘基基序(脯氨酸-脯氨酸-丙氨酸)，而SARS-CoV-2和蝙蝠冠狀病毒RaTG13都含有甘氨酸-纈氨酸/谷氨酰胺-谷氨酸/蘇氨酸-甘氨酸4個殘基基序，兩個相對龐大的殘基和兩個柔韌的甘氨酸使這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)差異顯著。在SARS-CoV-2 RBM區(qū)域中，因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)上的差異，Asn487和Ala475之間形成了一個額外的主鏈氫鍵，導(dǎo)致脊?fàn)顦?gòu)象更緊湊，包含Ala475的環(huán)更靠近人類ACE2。因此，SARS-CoV-2 RBM中的脊與人類ACE2 N端螺旋的接觸更多。SARS-CoV-2 S區(qū)域?qū)θ薃CE2的高親和力可能是導(dǎo)致SARS-CoV-2在人與人之間更易傳播的原因[29]。

2 LAMP檢測原理

LAMP首次由日本學(xué)者NOTOMI等[30]提出，是一種在等溫條件下對核酸進(jìn)行擴(kuò)增的方法。該方法主要包括一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶與4種專門設(shè)計(jì)的引物，4種引物能夠識別目標(biāo)DNA上的6個不同序列。6個不同序列主要包括5′端的B1、B2、B3區(qū)以及3′端的F1c、F2c、F3c。引物分為內(nèi)引物與外引物，內(nèi)引物當(dāng)中包括一條上游正向內(nèi)部引物(FIP)與一條下游反向內(nèi)部引物(BIP),每條引物都包含兩個不同的序列分別對應(yīng)目標(biāo)DNA的有義與反義序列(FIP主要包括F1c、一段TTTT間隔區(qū)以及一條與目標(biāo)基因3′端F2c互補(bǔ)的F2序列；BIP包括一條與B1互補(bǔ)的B1c序列、一段TTTT間隔區(qū)以及B2序列)，一條內(nèi)引物用于第一階段的啟動，另一條用于第二階段的自我啟動。兩條外引物包括下游外部引物B3(與B3c 區(qū)域互補(bǔ))與上游外部引物F3(與F3c互補(bǔ))。外引物引發(fā)鏈置換DNA的合成，釋放出單鏈DNA，它作為DNA合成的模板，由第二對內(nèi)外引物啟動DNA的合成(即內(nèi)外引物與目標(biāo)DNA的另一端進(jìn)行雜交，產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu))。在隨后的LAMP循環(huán)中，一個內(nèi)引物與產(chǎn)物上的環(huán)進(jìn)行雜交并啟動鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生原始莖環(huán)DNA與一個比原始莖長兩倍的新莖環(huán)DNA。最終產(chǎn)物是具有多個靶標(biāo)反向重復(fù)序列的莖環(huán)DNA結(jié)構(gòu)與具有多個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的花椰菜樣結(jié)構(gòu)。

3 LAMP在SARS-CoV-2檢測中的應(yīng)用

迄今為止，已有大量關(guān)于LAMP以及基于LAMP為基礎(chǔ)的聯(lián)合檢測技術(shù)應(yīng)用于SARS-CoV-2檢測的報(bào)道。在這些檢測技術(shù)中，檢測/擴(kuò)增一管化、結(jié)果可視化、引物組設(shè)計(jì)以及減少假陽性概率等是研究人員所面臨的主要問題。

3.1檢測/擴(kuò)增一管化方案 SARS-CoV-2檢測中，簡化核酸檢測與擴(kuò)增步驟是縮短檢測時間的關(guān)鍵，EL-THOLOTH等[31]以LAMP為基礎(chǔ)，構(gòu)建了用于檢測COVID-19的兩階段等溫?cái)U(kuò)增(COVID-19 Penn-RAMP)，實(shí)現(xiàn)了檢測與擴(kuò)增的一管化方案。他們的研究結(jié)果顯示，在檢測純化RNA目標(biāo)時COVID-19 Penn-RAMP的靈敏度比COVID-19 LAMP和COVID-19 RT-PCR高10倍，在檢測模擬患者標(biāo)本時，靈敏度比COVID-19 LAMP和COVID-19 RT-PCR高100倍。但是，由于當(dāng)時缺乏COVID-19感染病例導(dǎo)致他們無法用真實(shí)患者的標(biāo)本進(jìn)行測試。隨后，LAMB等[32]的研究證明，在經(jīng)過RNA提純的模擬SARS-CoV-2感染以及實(shí)際COVID-19患者的標(biāo)本中，RT-LAMP檢測均能在30～45 min特異性地檢測出SARS-CoV-2的存在，然而，當(dāng)對未經(jīng)RNA提純的COVID-19患者標(biāo)本進(jìn)行檢測時，RT-LAMP的特異度與靈敏度卻顯著下降。

3.2標(biāo)本處理與優(yōu)化 TAKI等[33]的研究中得出，在經(jīng)過RNA提純步驟的唾液與鼻咽拭子標(biāo)本當(dāng)中，利用RT-LAMP方法檢測的靈敏度與特異度兩者均分別為97%與100%。而當(dāng)檢測未經(jīng)RNA提純的鼻咽拭子與唾液標(biāo)本時，兩者的靈敏度降低到只有71%與47%。如何在未進(jìn)行RNA提純步驟的前提下提高檢測靈敏度與特異度是困擾研究人員的難題之一。

LALLI等[34]通過實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)對唾液標(biāo)本進(jìn)行65 ℃ 15 min以及95 ℃ 5 min加熱處理并冷卻至4 ℃后，RT-LAMP對標(biāo)本中SARS-CoV-2的檢測限能夠達(dá)到59個粒子拷貝數(shù)，其靈敏度與特異度得到了顯著提高。HOWSON等[35]在進(jìn)行RT-LAMP檢測之前，用MucolyseTM1∶1稀釋唾液標(biāo)本，然后用10% (w/v) Chelex 100 Resin再次稀釋，98 °C加熱2 min，經(jīng)過這兩步處理的唾液標(biāo)本利用RT-LAMP在短短5 min 43 s內(nèi)就被檢測到了SARS-CoV-2的存在。他們的實(shí)驗(yàn)證明，對唾液標(biāo)本的預(yù)處理在一定程度上能夠縮短檢測周期。但是由于唾液預(yù)處理以及下游分析過程仍然需要一些特殊的培訓(xùn)以及設(shè)備，使其在大規(guī)模核酸檢測中的應(yīng)用仍然受到一定限制。

3.3基于LAMP的聯(lián)合檢測技術(shù) 以LAMP為基礎(chǔ)的聯(lián)合核酸檢測技術(shù)正逐漸受到研究人員的關(guān)注。例如，一些研究人員基于RT-LAMP，建立了一種基于CRISPR-Cas12蛋白快速檢測SARS-CoV-2的方法[36]。這種方法能夠靈敏且特異性地檢測出患者呼吸道標(biāo)本中SARS-CoV-2的存在，其陽性預(yù)測值達(dá)95%，陰性預(yù)測值達(dá)100%。WANG等[37]開發(fā)了一套基于CRISPR/Cas12的“多相復(fù)式非連續(xù)生產(chǎn)法”用于檢測SARS-CoV-2的系統(tǒng),俗稱“一鍋法” (opv CRISPR) ，將RT-LAM與Cas12a裂解整合在一個反應(yīng)體系中。這與前面EL-THOLOTH等[31]的研究有相似之處，即RT-LAMP試劑在試管底部孵育，而在試管頂部加入CRISPR/Cas12a反應(yīng)試劑。研究表明opv CRISPR的靈敏度與RT-PCR相當(dāng)，比RT-LAMP約高10倍，Cas12a的切割提高了RT-LAMP的靈敏度，使其檢測靈敏度提高到接近單分子水平，opv CRISPR的診斷結(jié)果與美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)批準(zhǔn)的定量RT-PCR檢測結(jié)果100%一致。但是兩項(xiàng)研究在面對未提純的標(biāo)本時其檢測的靈敏度與特異度均出現(xiàn)不同程度的下降。

3.4引物組設(shè)計(jì)與結(jié)果可視化研究 LAMP反應(yīng)需要6種引物，到目前為止公開的LAMP引物設(shè)計(jì)工具很少，現(xiàn)有的工具沒有充分考慮到LAMP反應(yīng)的復(fù)雜性，其次可視化反應(yīng)容易受外界環(huán)境因素影響而使結(jié)果產(chǎn)生假陽性，因此特異性的引物組設(shè)計(jì)以及穩(wěn)定的顏色變化也是提高靈敏度與特異度不可或缺的步驟。HUANG等[38]分別針對SARS-CoV-2的ORF1a/b、S基因以及N基因區(qū)域設(shè)計(jì)了4組引物(O117、S17、N1和N15)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物N1與S17的檢測限最低均達(dá)到80 copy/mL。然而由于他們所應(yīng)用的可視化原理主要是通過pH的變化來實(shí)現(xiàn)，其結(jié)果受臨床環(huán)境因素影響較大，易產(chǎn)生假陽性。在后續(xù)的研究中，他們在引物FIP的5′端連接了6-羧基熒光素(FAM)使顯色結(jié)果變得更加穩(wěn)定，但仍然沒有解決標(biāo)本純化問題。

HUANG等[39]以病毒擴(kuò)增所需的總時間(TT)以及假陽性率(FP)將所設(shè)計(jì)出的引物進(jìn)行評分(總分4分，評分越低表明假陽性概率越低)并結(jié)合一種生物信息學(xué)算法篩選出了22種新型特異性引物(N7～N28)。其中，N7、N25和N27的總體表現(xiàn)最好，TT均小于20 min,FP評分均為1分。除此之外，他們還設(shè)計(jì)了6對針對M基因以及7對針對S基因的引物。在所有研究的引物中N7、N27、M以及M6表現(xiàn)最佳。在進(jìn)一步的研究當(dāng)中，他們將表現(xiàn)最佳的4種引物兩兩聯(lián)合，利用多重RT-LAMP法對SARS-CoV-2感染患者唾液標(biāo)本不提純直接檢測，其檢測限達(dá)到了1.5 copy/μL的病毒載量。臨床結(jié)果表明該方法與標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR方法總體靈敏度與特異度相當(dāng)。在這項(xiàng)研究中他們成功解決了RNA提純問題，一定程度上縮短了檢測周期(各種LAMP為基礎(chǔ)的SARS-CoV-2檢測方法匯總見表1)。NAGURA-IKEDA等[41]在自行采集的唾液中，對SARS-CoV-2的6項(xiàng)分子診斷試驗(yàn)和一項(xiàng)快速抗原試驗(yàn)的臨床表現(xiàn)進(jìn)行評估的實(shí)驗(yàn)中證明RT-LAMP在臨床中應(yīng)用具有足夠的靈敏度與特異度(已上市產(chǎn)品試劑盒列舉見表2)。

表1 以LAMP為基礎(chǔ)的SARS-CoV-2核酸檢測方法總結(jié)

表2 已獲批的基于LAMP的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒

續(xù)表2 已獲批的基于LAMP的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒

4 總結(jié)與展望

SARS-CoV-2感染的爆發(fā)給全球社會經(jīng)濟(jì)帶來了巨大的災(zāi)難，也導(dǎo)致生命科學(xué)等領(lǐng)域的爆發(fā)式發(fā)展，尤其在分子診斷領(lǐng)域。SARS-CoV-2變異毒株的不斷出現(xiàn)是全球分子診斷領(lǐng)域所共同面臨的一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)，RT-LAMP作為一種新型檢測技術(shù)在SARS-CoV-2檢測方面正表現(xiàn)出越來越突出的優(yōu)勢[42-44]。LAMP的不斷改進(jìn)與完善使其逐漸克服了之前的瓶頸，例如引物組設(shè)計(jì)、標(biāo)本處理以及可視化等問題。而在ZHU等[40]的研究當(dāng)中，利用多重RT-LAMP與納米顆粒側(cè)流生物傳感器相結(jié)合的方法，成功解決了檢測結(jié)果顯色等問題，顯著降低了外部環(huán)境因素的干擾。

與傳統(tǒng)RT-PCR相比，LAMP雖然不能定量，但卻表現(xiàn)出了更高的靈敏度與特異度。更重要的是，LAMP對SARS-CoV-2的檢測只需幾十甚至幾分鐘就能夠簡單通過肉眼對結(jié)果進(jìn)行識別。這在SARS-CoV-2大流行期間對SARS-CoV-2感染疑似病例進(jìn)行大規(guī)模篩查至關(guān)重要。以LAMP為基礎(chǔ)的聯(lián)合檢測技術(shù)有望取代傳統(tǒng)的RT-PCR技術(shù)，成為一種對SARS-CoV-2檢測更加快速、簡便且具有明顯成本-效益的方法。