薛 麗，黃 奔

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，江蘇南京 210009

人類(lèi)四連接同源 (FJX1) 基因與果蠅高爾基體固有跨膜激酶(Fj) 基因高度同源，位于11號(hào)染色體(11p13)，可以編碼含有437個(gè)氨基酸的表面分泌蛋白[1]。FJX1基因可以在神經(jīng)系統(tǒng)、多個(gè)器官的上皮細(xì)胞和肢體發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，對(duì)生物體的發(fā)育起著重要的作用[2-3]。有研究指出，F(xiàn)JX1 基因可以作為致癌基因，通過(guò)多種信號(hào)途徑影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。FJX1 基因被報(bào)道在鼻咽癌[3]、黑色素瘤[4]、頭頸癌[5]等多種腫瘤中發(fā)揮了重要的作用。雖然有研究指出，F(xiàn)JX1 mRNA和蛋白在晚期結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[6]，但研究者并未探討FJX1基因表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系。因此，本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)的方法，綜合多種數(shù)據(jù)庫(kù)加以驗(yàn)證，探討FJX1 基因在結(jié)腸癌中的臨床意義、預(yù)后價(jià)值以及FJX1 基因在結(jié)腸癌中的分子作用機(jī)制，旨在為結(jié)腸癌的診治提供新型分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載與處理 登陸TCGA官方數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)，下載結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)(level 3,HTSeq-FPKM) 和患者的臨床資料。患者的臨床數(shù)據(jù)包括年齡、性別、腫瘤TNM分期、生存狀態(tài)以及隨訪時(shí)間。共下載結(jié)腸癌組織標(biāo)本473例、正常組織標(biāo)本41例。在后續(xù)分析中，刪除臨床數(shù)據(jù)不完整或者缺失的標(biāo)本86例，納入387例結(jié)腸癌組織標(biāo)本，其中男性患者203例，女性患者184例；年齡>65歲患者235例，≤65歲患者 152例；Stage分期Ⅰ～Ⅱ期患者224例，Ⅲ～Ⅳ期患者163例；存活患者291例，死亡患者96例；最長(zhǎng)隨訪時(shí)間為4 502 d。使用R 4.1.2軟件提取基因表達(dá)數(shù)據(jù)并進(jìn)行歸一化處理。在后續(xù)分析中，根據(jù)FJX1基因在結(jié)腸癌患者中表達(dá)水平的中位值，將患者分為高表達(dá)(>中位值)、低表達(dá)(≤中位值)。

1.2FJX1基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)以及與臨床特征關(guān)系的分析 根據(jù)TCGA結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集的臨床資料，分析FJX1基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，探討FJX1基因表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床特征(年齡、性別、腫瘤分期)的關(guān)系。同時(shí)，使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/index.html) 驗(yàn)證分析FJX1基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況。在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中，共下載結(jié)腸癌組織標(biāo)本286例、正常組織標(biāo)本41例。在分析TP53基因突變的時(shí)候，刪除4例信息缺失的標(biāo)本。在后續(xù)分析中，刪除臨床數(shù)據(jù)不完整或者缺失的標(biāo)本7例，納入279例結(jié)腸癌組織標(biāo)本，其中男性患者156例，女性患者123例；年齡>65歲患者177例，≤65歲患者102例；Stage分期Ⅰ～Ⅱ期患者155例，Ⅲ～Ⅳ期患者124例；存活患者183例，死亡患者96例；最長(zhǎng)隨訪時(shí)間為4 000 d。

1.3FJX1基因表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后關(guān)系的分析 根據(jù)結(jié)腸癌患者的生存資料，結(jié)合FJX1基因的表達(dá)情況，分析高、低表達(dá)患者總體生存率的差異。在本研究中，利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)、GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia2.cancer-pku.cn/)和OncoLnc在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.oncolnc.org) 驗(yàn)證分析FJX1基因表達(dá)與患者總體生存率的關(guān)系。其中，在GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)中，共下載結(jié)腸癌組織標(biāo)本275例、正常組織標(biāo)本41例。275例結(jié)腸癌組織標(biāo)本中男性患者192例，女性患者83例；年齡>65歲患者165例，≤65歲患者110例；Stage分期Ⅰ～Ⅱ期患者149例，Ⅲ～Ⅳ期患者126例；存活患者165例，死亡患者110例；最長(zhǎng)隨訪時(shí)間為5 400 d。在OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)中，共下載結(jié)腸癌組織標(biāo)本440例，正常組織標(biāo)本41例。440例結(jié)腸癌組織標(biāo)本中男性患者239例，女性患者201例；年齡>65歲患者215例，≤65歲患者225例；Stage分期Ⅰ～Ⅱ期患者239例，Ⅲ～Ⅳ期患者201例；存活患者342例，死亡患者98例；最長(zhǎng)隨訪時(shí)間為4 502 d。

1.4基因富集分析 使用R4.2.2軟件對(duì)FJX1基因進(jìn)行功能富集分析，探討FJX1基因在結(jié)腸癌中的分子作用機(jī)制。采用加權(quán)富集法分析，分析的通路來(lái)自Molecular Signature Database (Msig-DB)數(shù)據(jù)庫(kù)中的 c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集。參數(shù)設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)1 000次。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)小于0.05和P<0.05的基因集作為顯著富集的基因集。此外，為了充分研究FJX1基因的生物學(xué)功能，使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù) (https://cn.string-db.org/) 探索與FJX1基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行基因本體 (GO)富集分析，探討其參與的生物學(xué)過(guò)程 (BP)、細(xì)胞學(xué)組分(CC)和分子功能(MF)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件及R 4.2.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較FJX1基因在癌組織和正常組織中的表達(dá)差異，采用χ2檢驗(yàn)分析在患者不同臨床病理參數(shù)下FJX1基因的表達(dá)差異，采用Kaplan-Meier法和Cox回歸分析探討FJX1基因表達(dá)對(duì)預(yù)后的判斷價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1FJX1基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá) 在TCGA結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集中，相比于正常組織(FJX1基因表達(dá)水平中位值為0.261)，F(xiàn)JX1基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)(中位值為1.761)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)圖1A。與相應(yīng)的癌旁組織(中位值為0.261)相比，癌組織中的FJX1基因表達(dá)水平(中位值為1.960)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)圖1B。此外，在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中，結(jié)果也顯示FJX1基因在結(jié)腸癌組織表達(dá)(中位值為2.150)顯著高于正常組織(中位值為0.350)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)圖1C；與未發(fā)生TP53基因突變的組織標(biāo)本(中位值為1.939)相比，發(fā)生TP53基因突變的組織標(biāo)本FJX1基因表達(dá)水平(中位值為2.255)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)，見(jiàn)圖1D。

注：A為在TCGA結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集中FJX1基因表達(dá)情況；B為在TCGA結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集中癌組織和相應(yīng)癌旁組織中FJX1基因表達(dá)情況;C為在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中FJX1基因表達(dá)情況；D為在TCGA結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集中具有TP53基因突變標(biāo)本與TP53基因未突變標(biāo)本之間FJX1基因表達(dá)情況。

2.2FJX1基因表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床特征的關(guān)系 根據(jù)FJX1基因表達(dá)水平中位值1.761，將結(jié)腸癌患者分為高、低表達(dá)。結(jié)果顯示，F(xiàn)JX1基因表達(dá)水平在患者不同Stage分期、M分期中比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.038)，見(jiàn)表1。

表1 FJX1基因表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床特征的關(guān)系

在TCGA結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集中，F(xiàn)JX1基因在不同分期的患者中表達(dá)情況如圖2所示。其中，Stage分期Ⅳ期患者FJX1基因的表達(dá)量顯著高于Stage分期Ⅰ期的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)；M1期患者的FJX1基因的表達(dá)量顯著高于M0期的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P= 0.044)。

注：A表示FJX1基因在患者不同Stage分期中的表達(dá)情況；B表示FJX1基因在T分期中的表達(dá)情況；C表示FJX1基因在M分期中的表達(dá)情況;D表示FJX1基因在N分期中的表達(dá)情況。

2.3FJX1基因表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，高表達(dá)FJX1基因組的患者總體生存率顯著低于低表達(dá)的患者(P=0.007)，見(jiàn)圖3A。此外，在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)、GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)和OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)中，均顯示了高表達(dá)FJX1基因組的患者預(yù)后不良 (P<0.05)，見(jiàn)圖3B～D。

注：A為在TCGA結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集中FJX1基因表達(dá)與結(jié)腸癌患者總體生存率的關(guān)系；B為UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中FJX1基因表達(dá)與結(jié)腸癌患者總體生存率的關(guān)系；C為GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)中FJX1基因表達(dá)與結(jié)腸癌患者總體生存率的關(guān)系；D為在OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)中FJX1基因表達(dá)與結(jié)腸癌患者總體生存率的關(guān)系。

2.4Cox回歸分析 單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡、TNM分期和FJX1基因表達(dá)均在結(jié)腸癌不同預(yù)后患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。而多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡(HR=1.043,95%CI:1.022～1.065,P<0.001)、T分期(HR=1.981,95%CI:1.177～3.336,P=0.010)、FJX1基因表達(dá)(HR=1.133,95%CI:1.025～1.253,P=0.015)可以作為患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

表2 Cox回歸分析

2.5基因富集分析 基因富集分析結(jié)果顯示，F(xiàn)JX1基因主要參與了致癌相關(guān)信號(hào)途徑、細(xì)胞黏附分子、趨化因子信號(hào)通路、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用、Hedgehog(Hh)信號(hào)通路等分子作用通路。使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)探索與FJX1基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，共有10個(gè)基因與FJX1基因互相作用 (圖4A)。GO富集分析結(jié)果顯示，這些基因與FJX1基因共同參與了細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子受體作用、癌癥信號(hào)途徑等生物學(xué)過(guò)程；參與了細(xì)胞頂端、細(xì)胞連接、細(xì)胞外泌體等細(xì)胞學(xué)組分；參與了鈣離子、蛋白激酶激活、受體配體作用等分子功能 (圖4B)。因此，F(xiàn)JX1基因可以通過(guò)細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子受體作用、ECM受體作用以及癌癥相關(guān)信號(hào)途徑發(fā)揮其生物學(xué)功能。

注：A圖為STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中與FJX1基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)圖；FAT1～4即脂肪非典型鈣黏蛋白1～4;DCHS1～2即鈣依賴性細(xì)胞黏附蛋白;COMMD9即銅代謝結(jié)構(gòu)域蛋白-9;SYNGR3即神經(jīng)細(xì)胞囊泡循環(huán)蛋白3;TRIM44即含三聯(lián)基元蛋白44;FAM20A即序列相似家族20成員A;B圖為GO富集分析結(jié)果圖。

3 討 論

人類(lèi) FJX1基因與在果蠅和小鼠中的直系同源物具有 29% 和 88% 的同源性[6]。在果蠅體內(nèi)，F(xiàn)j是生長(zhǎng)發(fā)育和平面細(xì)胞極性調(diào)節(jié)所必需的[7]，而在小鼠體內(nèi)，F(xiàn)JX1基因存在于發(fā)育中的大腦中，純合型FJX1基因小鼠在大腦海馬中會(huì)表現(xiàn)出異常形態(tài)的樹(shù)突結(jié)構(gòu)，在體外培養(yǎng)時(shí)，這些小鼠的海馬神經(jīng)元會(huì)表現(xiàn)出更高水平的樹(shù)突延伸和分支[8]。因此，這些研究強(qiáng)調(diào)了FJX1基因在不同生物體發(fā)育中的重要性。盡管FJX1基因在人類(lèi)中的確切生物學(xué)功能尚不完全清楚，但來(lái)自發(fā)育研究的數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)JX1基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，在多種人類(lèi)疾病中發(fā)揮了重要的作用[9]，F(xiàn)JX1基因在癌癥發(fā)展中的作用可能與其在促進(jìn)生長(zhǎng)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中的作用有關(guān)[3]。目前許多研究已經(jīng)證實(shí)FJX1基因在人類(lèi)癌癥中過(guò)表達(dá)，如乳腺癌[10]、肺癌[11]等，這表明了FJX1基因可能是癌癥的分子驅(qū)動(dòng)因素。

在鼻咽癌組織中，F(xiàn)JX1基因和蛋白水平均表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了癌細(xì)胞增殖和侵襲[3]。與正常卵巢內(nèi)皮細(xì)胞相比，F(xiàn)JX1 mRNA在卵巢腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[12-13]。CHANG等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，與無(wú)子宮內(nèi)膜異位癥的女性相比，F(xiàn)JX1基因表達(dá)水平在異位子宮內(nèi)膜分泌期顯著升高。在結(jié)直腸癌中，CUI等[15]研究者構(gòu)建了miRNA-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)以揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，并指出了FJX1等基因可以作為結(jié)直腸癌的關(guān)鍵基因。然而，關(guān)于FJX1基因在結(jié)腸癌中的臨床意義和預(yù)后作用，目前鮮有研究報(bào)道。

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)JX1基因在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，并且與患者的Stage分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，這表明FJX1基因表達(dá)參與了結(jié)腸癌患者的惡性進(jìn)展。高表達(dá)FJX1基因患者總體生存率較低，這表明FJX1基因影響患者的生存，可以作為結(jié)腸癌潛在的預(yù)后分子標(biāo)志物。有研究指出，在結(jié)直腸癌組織中，F(xiàn)JX1基因的表達(dá)與血管生成基因如低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C的變化顯著相關(guān)，F(xiàn)JX1基因可以通過(guò)HIF-1α依賴性方式促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)管的形成[6]。因此，研究者認(rèn)為FJX1基因是一種新型的腫瘤進(jìn)展調(diào)節(jié)因子，F(xiàn)JX1基因增強(qiáng)血管生成的能力可能解釋了FJX1基因高表達(dá)的患者總體生存率較低。

基因富集分析結(jié)果顯示，F(xiàn)JX1基因表達(dá)參與了多種信號(hào)途徑，如調(diào)控細(xì)胞分化與增殖、ECM受體途徑[16]，與腫瘤轉(zhuǎn)移和惡性進(jìn)展相關(guān)的通路[17]，與腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞因子途徑[18-19]等。分子機(jī)制研究指出，F(xiàn)JX1基因的過(guò)表達(dá)可以通過(guò)上述多種途徑參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。Hippo通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，F(xiàn)JX1基因是該通路中YAP和TAZ癌基因的直接靶標(biāo)[20]，F(xiàn)JX1蛋白過(guò)表達(dá)還可以進(jìn)一步反饋調(diào)節(jié)YAP的激活，參與癌細(xì)胞的增殖途徑[21]。FJX1基因過(guò)表達(dá)后細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)和E1(cyclin E1)的表達(dá)水平也相應(yīng)增加，這表明FJX1基因可以協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白來(lái)增強(qiáng)癌細(xì)胞增殖[3]。FJX1基因還可以通過(guò)參與調(diào)節(jié)平面細(xì)胞極性(PCP)來(lái)增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲，雖然PCP是傷口修復(fù)和發(fā)育的關(guān)鍵過(guò)程，它參與促進(jìn)了原腸形成、神經(jīng)管閉合等過(guò)程，該生物學(xué)過(guò)程的失調(diào)可能將導(dǎo)致癌細(xì)胞產(chǎn)生侵襲和轉(zhuǎn)移的行為[3,22]。此外，F(xiàn)JX1基因表達(dá)還可以通過(guò)促進(jìn)血管生成素等促血管生成基因的表達(dá)，誘導(dǎo)血管生成肽的產(chǎn)生來(lái)增強(qiáng)癌癥進(jìn)展[23]。

由于FJX1基因的關(guān)鍵致癌作用，靶向FJX1基因被認(rèn)為是一種潛在的結(jié)直腸癌治療策略。LIU等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制非編碼RNA PVT1的表達(dá)可以通過(guò)靶向調(diào)控miR-106b-5p/FJX1信號(hào)軸，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為結(jié)直腸癌患者治療策略的發(fā)展提供了新思路。此外，miR-532-3p[25]、miR-1249[26]均可以靶向調(diào)控FJX1基因表達(dá)，抑制結(jié)腸腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。因此可以推斷，F(xiàn)JX1基因有希望成為結(jié)直腸癌潛在的分子標(biāo)志物。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究是通過(guò)生物信息學(xué)的方法，綜合多種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證分析FJX1基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)及對(duì)患者總體生存率的影響，初步揭示了FJX1基因在結(jié)腸癌中的分子意義。在分析患者的臨床數(shù)據(jù)時(shí)，雖然排除了臨床信息不完整、生存數(shù)據(jù)缺失的患者資料，但由于每位患者的情況不同，接受的臨床治療也存在差異，本研究是利用患者的隨訪數(shù)據(jù)初步顯示了FJX1基因?qū)Y(jié)直腸癌預(yù)后的判斷作用，結(jié)果可能存在偏倚。因此，在后續(xù)研究中仍需大標(biāo)本的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。其次，通過(guò)基因富集分析指出了FJX1基因在致癌過(guò)程中的潛在分子作用機(jī)制，仍需要進(jìn)行生物體內(nèi)的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究顯示FJX1基因在結(jié)腸癌組織中異常表達(dá)上調(diào)，與患者的惡性進(jìn)展特征和不良預(yù)后相關(guān)。FJX1基因通過(guò)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子受體作用、ECM受體作用以及癌癥相關(guān)信號(hào)途徑促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展。FJX1基因可作為結(jié)腸癌患者的分子預(yù)后標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)，這為進(jìn)一步探討FJX1基因在結(jié)腸癌中的生物學(xué)功能提供了線索和依據(jù)。