譚延國，王紀(jì)越，張然星，田 野，劉 晴，王曉寧，古 媛，聶秋燕,李卓敏，于 洋

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100038；2.首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，北京 100038；3.中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京 100040

乙型肝炎病毒(HBV)血清標(biāo)志物檢測是入院或術(shù)前檢查的常規(guī)內(nèi)容，對于及時(shí)發(fā)現(xiàn)、及早治療、阻斷HBV感染以及防止其傳播意義重大。我國曾廣泛使用酶聯(lián)免疫吸附測定、放射免疫法、板式化學(xué)發(fā)光法等檢測上述項(xiàng)目，而微粒子或電化學(xué)發(fā)光等方法的效能則更具優(yōu)勢[1]。現(xiàn)進(jìn)口化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)仍為主流檢測方法，如雅培、西門子、羅氏、貝克曼、希森美康等品牌[2]。近年來，隨著國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)的日臻成熟[3]，其在成本控制、人機(jī)交互等方面都有著較進(jìn)口化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)更為明顯的優(yōu)勢，雖然不乏對檢測系統(tǒng)間性能比對的臨床研究，但對本研究中評估的兩個(gè)國產(chǎn)檢測系統(tǒng)性能進(jìn)行比對的文獻(xiàn)仍少見，其定性與定量檢測性能尚未被深入了解與認(rèn)知。本研究以行業(yè)認(rèn)可度較高的進(jìn)口檢測系統(tǒng)作參照，對國產(chǎn)檢測系統(tǒng)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)定性、定量結(jié)果的一致性進(jìn)行評估，進(jìn)而為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 實(shí)驗(yàn)使用的血清均來自復(fù)興醫(yī)院使用ARCHITECT?SYSTEM i2000SR系統(tǒng)常規(guī)檢測患者HBsAg和(或)HBeAg結(jié)果為陽性(復(fù)測后仍為陽性)或陰性的靜脈血標(biāo)本[每例標(biāo)本同時(shí)還檢測了乙型肝炎病毒表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)等HBV血清標(biāo)志物]。標(biāo)本采集時(shí)間為2019年6月至2022年4月，均無黃疸、溶血和脂血。其中HBsAg標(biāo)本共492例(陽性292例，陰性200例)，男257例、女235例，年齡18～85歲；HBeAg標(biāo)本464例(陽性250例，陰性214例)，男243例、女221例，年齡19～83歲。均使用含惰性分離膠及促凝劑的真空采血管采集，4 000 r/min離心10 min，常規(guī)檢測完畢后，分離剩余血清，儲存于-80 ℃冰箱待用。本研究已在復(fù)興醫(yī)院倫理委員會備案。

1.2儀器與試劑 檢測系統(tǒng)分別為美國雅培公司的ARCHITECT?SYSTEM i2000SR(以下簡稱S1)、邁克生物股份有限公司的Maccura i3000(以下簡稱S2)、邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司的Mindray CL6000i全自動微粒子化學(xué)發(fā)光分析儀(以下簡稱S3)及配套試劑、定標(biāo)品、質(zhì)控品、輔助試劑及耗材。幾個(gè)系統(tǒng)的檢測原理均為基于雙抗體夾心法的微粒子化學(xué)發(fā)光法。

1.3方法 所有設(shè)備均按要求進(jìn)行維護(hù)、保養(yǎng)和校準(zhǔn)；實(shí)驗(yàn)操作均按說明書進(jìn)行，室內(nèi)質(zhì)控在控時(shí)方進(jìn)行標(biāo)本的檢測。

標(biāo)本從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫后均使用2個(gè)國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)S2和S3復(fù)測(每個(gè)標(biāo)本同時(shí)用3種方法檢測)，進(jìn)一步分析幾個(gè)系統(tǒng)間定量和定性結(jié)果的符合性。對于3個(gè)系統(tǒng)有任意2個(gè)結(jié)果不符的標(biāo)本及高于HBsAg檢測上限(≥250 IU/mL)的標(biāo)本，將再次使用S1檢測1次(≥250 IU/mL的標(biāo)本稀釋后檢測)。

定量數(shù)據(jù)偏倚的計(jì)算：(S2或S3-S1)/S1×100%。各檢測系統(tǒng)HBsAg測定均為全定量方法；對HBeAg而言，S2為全定量檢測(可溯源至國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))，S1和S3均為定性檢測。各系統(tǒng)具體特征如表1所示。

表1 各系統(tǒng)測定HBsAg和HBeAg的方法學(xué)特點(diǎn)

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用IBM SPSS23.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。非正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以M(P25,P75)表示，數(shù)據(jù)之間比較采用配對秩和檢驗(yàn);采用Spearman相關(guān)分析S1與S2、S3檢測結(jié)果間的相關(guān)性；定性數(shù)據(jù)比較采用配對χ2檢驗(yàn)；一致性分析采用Kappa一致性檢驗(yàn)。對于S1檢測HBsAg<1.00 IU/mL結(jié)果的標(biāo)本，采用受試者工作特征(ROC)曲線分別分析S1與S2、S3檢測結(jié)果的最佳臨界值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HBsAg的檢測結(jié)果分析

2.1.1HBsAg定性結(jié)果的總體符合性分析 S2、S3對HBsAg的定性結(jié)果與S1的定性總符合率均為97.76%、陽性符合率均為96.58%、陰性符合率均為99.50%，定性結(jié)果一致檢驗(yàn)均為Kappa值=0.954(P<0.001)； S2、S3分別與S1相比，對HBsAg的定性結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.012)。見表2、3。

表2 S1、S2檢測HBsAg定性結(jié)果的符合性分析(n)

表3 S1、S3檢測HBsAg定性結(jié)果的符合性分析(n)

2.1.2不同HBsAg定量區(qū)間各系統(tǒng)HBsAg定性結(jié)果的符合性分析 根據(jù)S1檢測HBsAg的定量結(jié)果，劃分了若干HBsAg定量水平區(qū)間，以進(jìn)一步分析S2和S3檢測HBsAg的定性結(jié)果與S1結(jié)果的符合情況。如表4所示，當(dāng)S1檢測的HBsAg≥1.00 IU/mL時(shí)，S2和S3檢測HBsAg的結(jié)果與S1檢測結(jié)果的定性符合率均為100.00%；而當(dāng)S1檢測的HBsAg處于0.50～<1.00、0.05～<0.50 IU/mL時(shí)，S2和S3檢測HBsAg的結(jié)果與S1檢測結(jié)果的定性符合率則均分別為91.67%和70.97%。

表4 不同HBsAg定量區(qū)間各系統(tǒng)HBsAg定性結(jié)果的符合性分析

S1檢測HBsAg<1.00 IU/mL的所有標(biāo)本，結(jié)合S2和S3結(jié)果繪制ROC曲線。結(jié)果顯示，當(dāng)S1檢測的HBsAg <0.21 IU/mL時(shí)，S2檢測HBsAg結(jié)果為陰性的比例為63.63%[曲線下面積(AUC)=0.829,P=0.002]；當(dāng)S1檢測的HBsAg<0.18 IU/mL時(shí)，S3檢測HBsAg結(jié)果為陰性的比例為70.00%(AUC=0.820,P=0.002)。

2.1.3不同檢測系統(tǒng)間HBsAg定量水平的符合性分析 如表5所示，在S1檢測HBsAg的不同定量水平區(qū)間內(nèi)，分析了S1檢測的HBsAg定量結(jié)果與S2和S3檢測結(jié)果的相關(guān)性，計(jì)算了S1檢測結(jié)果與S2和S3檢測結(jié)果的相對偏差。結(jié)果表明，除HBsAg定量水平在0.50～<1.00 IU/mL，S3檢測的HBsAg定量結(jié)果與S1之間無相關(guān)性(P>0.05)，以及HBsAg水平在100.00～<250.00 IU/mL，S2檢測的HBsAg定量結(jié)果與S1之間無相關(guān)性(P>0.05)外，在其他的HBsAg定量區(qū)間，S2、S3檢測的HBsAg結(jié)果與S1的結(jié)果均相關(guān)(P<0.05)。配對秩和檢驗(yàn)顯示，在所有的HBsAg定量區(qū)間，S2檢測的HBsAg定量水平均明顯低于S1(P<0.05)；而對于S3而言，除在0.50～<1.00 IU/mL和100.00～<250.00 IU/mL HBsAg定量區(qū)間，S3檢測的HBsAg定量水平與S1差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.071、0.873)外，在其余的HBsAg定量區(qū)間，S3檢測的HBsAg定量水平均明顯低于S1(P<0.05)。S2檢測HBsAg的定量水平與S1檢測結(jié)果的相對偏倚為-59.03%～-45.82%，S3檢測HBsAg的定量水平與S1檢測結(jié)果的相對偏倚為-71.05%～-33.75%。

表5 根據(jù)S1的HBsAg定量結(jié)果劃分區(qū)間后，各系統(tǒng)定量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述、相關(guān)性和差異性比較

S1檢測HBsAg的不同定量區(qū)間(IU/mL)n與S1的平均偏倚(%)S2S3與S1的配對秩和檢驗(yàn)[Z(P)]S2S30.05～<0.5031-59.03-52.60-3.842(<0.001)-4.529(<0.001)0.50～<1.0012-55.92-50.00-3.059(0.002) -1.804(0.071)1.00～<10.0061-58.15-47.53-5.473(<0.001)-5.240(<0.001)10.00～<100.0085-49.31-46.02-5.054(<0.001)-2.522(0.012)100.00～<250.0051-45.82-33.75-4.274(<0.001)-0.159(0.873)≥250.0052-47.59-71.05-3.634(<0.001)-6.275(<0.001)

2.1.4對任意2個(gè)系統(tǒng)HBsAg定性結(jié)果不符合標(biāo)本的進(jìn)一步分析 如表6所示，任意2個(gè)檢測系統(tǒng)間HBsAg定性結(jié)果不符合的共15例。這些標(biāo)本除55號和128號標(biāo)本外，其余13例標(biāo)本均為使用S1(只作為參照系統(tǒng)，而非金標(biāo)準(zhǔn)方法)檢測HBsAg為陽性的標(biāo)本，這13例標(biāo)本其他HBV標(biāo)志物的常規(guī)檢測結(jié)果顯示均為“小三陽”(HBsAg+、HBcAb+、HBeAb+)；而僅S2或S3檢測HBsAg陽性的2例標(biāo)本(55號和128號)，則僅為HBsAg呈單獨(dú)陽性。

表6 任意2個(gè)檢測系統(tǒng)間HBsAg定性結(jié)果(+/-)不符合標(biāo)本列表

2.2各系統(tǒng)檢測HBeAg的定性結(jié)果分析 S3檢測HBeAg的定性結(jié)果與S1檢測結(jié)果的總體符合率、陽性符合率、陰性符合率分別為96.77%、99.20%、93.93%，一致性檢驗(yàn)Kappa值=0.936(P<0.001)；S2檢測HBeAg的定性結(jié)果與S1檢測結(jié)果的總體符合率、陽性符合率、陰性符合率分別為97.84%、98.40%、97.20%，一致性檢驗(yàn)Kappa值=0.957(P<0.001)。S3檢測HBeAg的定性結(jié)果與S1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)；S2檢測HBeAg的定性結(jié)果與S1差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.754)。見表7、8。

表7 S1、S2檢測HBeAg定性結(jié)果的符合性分析(n)

如表9所示，任意2個(gè)檢測系統(tǒng)間HBeAg定性結(jié)果不符合的共19例，這些標(biāo)本在留取標(biāo)本凍存前、使用S1檢測5項(xiàng)HBV血清標(biāo)志物時(shí)，除了86號外(S1、S2檢測5項(xiàng)HBV血清標(biāo)志物結(jié)果均為陰性，僅S3檢測的HBeAg為單獨(dú)陽性)，其余標(biāo)本檢測結(jié)果均為“大三陽”(HBsAg+、HBeAg+、HBcAb+)，只是有些臨界值附近標(biāo)本在凍存一段時(shí)間后，再次測定時(shí)，部分標(biāo)本S1、S2檢測HBeAg的陽性率明顯下降，但S3可能受標(biāo)本保存時(shí)間的影響較小，多數(shù)標(biāo)本仍為陽性，具體原因仍待探討。

表8 S1、S3檢測HBeAg定性結(jié)果的符合性分析(n)

表9 任意2個(gè)檢測系統(tǒng)間HBeAg定性(+/-)結(jié)果不符合者列表

3 討 論

HBsAg是HBV感染后第一個(gè)出現(xiàn)的標(biāo)志物，一旦確定HBsAg陽性，即可明確為HBV感染[4-6]。HBeAg陽性是HBV復(fù)制以及傳染性強(qiáng)的標(biāo)志物，高水平HBeAg與HBV DNA關(guān)系更為密切[7-8]。故對二者的準(zhǔn)確檢測十分必要。

目前，雖然關(guān)于方法學(xué)比對的研究較多，但對本研究探討的檢測系統(tǒng)而言，尚未見使用S2評估HBsAg和(或)HBeAg的相關(guān)文獻(xiàn)，也僅見1篇文獻(xiàn)評估了使用S3檢測HBsAg的研究[9]，但鮮見從定性、定量、定性結(jié)果符合情況以及對不符合標(biāo)本進(jìn)行深入分析的相關(guān)文獻(xiàn)。

本研究顯示，2個(gè)國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測HBsAg和HBeAg，與進(jìn)口化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)均具有非常高的陽性、陰性符合率，顯示國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)測定HBV血清標(biāo)志物已有了長足進(jìn)步[9]，其性能已可滿足大規(guī)模應(yīng)用于常規(guī)檢測的需要。

就定性結(jié)果而言，對于S1檢測結(jié)果HBsAg≥1.00 IU/mL的標(biāo)本，S2和S3均可100%檢出；對于15例任意2個(gè)系統(tǒng)檢測不符的標(biāo)本，其HBsAg定量值均<1.00 IU/mL,由于其中有13例HBV血清標(biāo)志物檢測皆為“小三陽”，故其HBsAg真陽性的可能性大。而國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)各檢測出3例陽性。ROC曲線顯示，當(dāng)S1檢測HBsAg的定量結(jié)果<0.21 IU/mL時(shí)，S2檢測HBsAg陰性的概率為63.63%，而當(dāng)S1檢測HBsAg的定量結(jié)果<0.18 IU/mL時(shí)，S3檢測HBsAg陰性的概率為70.00%。故國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測系統(tǒng)在低水平HBsAg的檢出能力上可能尚待提高。而在臨床實(shí)際工作中，HBsAg<1.00 IU/mL的HBV感染者占比很少。本研究也發(fā)現(xiàn)了2例S1檢測HBsAg結(jié)果為陰性，而S2或S3檢測HBsAg陽性且均為低值的標(biāo)本(分別為0.05 IU/mL和0.12 IU/mL)，且3個(gè)系統(tǒng)檢測HBsAb、HBeAg、HBcAb、HBeAb結(jié)果均為陰性，故有理由認(rèn)為此2例標(biāo)本S2和S3 HBsAg假陽性的可能大。本研究未做HBsAg的確認(rèn)試驗(yàn)和HBV-DNA的檢測(即金標(biāo)準(zhǔn)方法)，因?yàn)榇_認(rèn)試驗(yàn)的靈敏度普遍偏低，且即使HBV-DNA陰性也不能排除HBsAg陽性的可能。由于本研究這方面設(shè)計(jì)的不足，也提示對于進(jìn)口試劑陽性、兩種國產(chǎn)試劑陰性的標(biāo)本，也存在真陰性的可能。

除了檢測下限，檢測出HBsAg變異株的能力也是檢測系統(tǒng)的重要性能指標(biāo)之一，如HBsAg、HBsAb雙陽性的標(biāo)本[10-13]，此類標(biāo)本在本研究中也有2例(0.68%)。這方面的性能，尚需長期的臨床實(shí)踐驗(yàn)證。

對于HBV引起的乙型肝炎患者，HBsAg定量雖然與病毒載量的關(guān)系不如HBeAg密切，但同樣可反映病毒水平[14-15]，故準(zhǔn)確定量檢測HBsAg也非常重要。本研究顯示，兩個(gè)國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)S2、S3檢測HBsAg的定量水平與進(jìn)口化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)S1存在中等程度的相關(guān)性，但相關(guān)程度隨其定量水平的區(qū)間變動，且相對于進(jìn)口系統(tǒng)的負(fù)偏倚較大，在各個(gè)HBsAg定量水平區(qū)間，S2、S3檢測結(jié)果與S1的偏倚基本都在-50%左右。這提示，如要根據(jù)HBsAg定量水平預(yù)測HBV拷貝數(shù)，最好使用同一檢測系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測，如果數(shù)據(jù)來自不同檢測系統(tǒng)，則判斷結(jié)果時(shí)應(yīng)非常慎重。對于HBsAg為何定量試驗(yàn)存在如此大偏差的原因，仍不明確。本研究雖然使用了凍存標(biāo)本，但由于保存條件為-80 ℃，標(biāo)本質(zhì)量還是有保障的；且對于這些任意2個(gè)系統(tǒng)檢測HBsAg定性結(jié)果不符的標(biāo)本也使用S1進(jìn)行了復(fù)測，顯示至少對這些弱陽性標(biāo)本而言，新鮮標(biāo)本與復(fù)測標(biāo)本前后定量水平差異是非常小的，凍存后復(fù)測仍為陽性；對于HBsAg≥250.00 IU/mL標(biāo)本，也用S1稀釋后進(jìn)行了復(fù)測，且S2、S3定量水平與S1間的偏倚仍與HBsAg其他定量區(qū)間的偏倚基本吻合。

對于HBeAg，S2的檢出率與S1更為接近，可能同樣受標(biāo)本保存時(shí)間的影響。這提示對于HBeAg而言，即便是-80 ℃冰箱凍存，其臨界值附近的結(jié)果也可能會受到影響。但實(shí)際工作中，HBV血清標(biāo)志物檢測為常規(guī)檢測項(xiàng)目，基本當(dāng)日即完成檢測，可忽略這種儲存因素的影響。