陳榮忠，楊子依，向 蓉△

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院檢驗科，廣東中山 528415；2.邵陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，湖南邵陽 422000

鮑曼不動桿菌為革蘭陰性球桿菌，常存在于人體的皮膚、口腔、呼吸道、胃腸道和泌尿道中，在自然環(huán)境中分布廣泛，可存在于醫(yī)院各種環(huán)境中，近些年來已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一。鮑曼不動桿菌具有多種耐藥機(jī)制，隨著抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致鮑曼不動桿菌的檢出率及耐藥率居高不下，2020年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動桿菌對美羅培南的耐藥率為73.4%[1]。碳青霉烯酶的產(chǎn)生是耐碳青霉烯類抗菌藥物的鮑曼不動桿菌(CRABA)的主要耐藥機(jī)制，而主動外排泵系統(tǒng)的表達(dá)以及外膜孔道蛋白的丟失或突變也是其重要的耐藥機(jī)制之一。本文通過分析鮑曼不動桿菌主動外排泵相關(guān)基因以及外膜孔蛋白carO基因的表達(dá)，進(jìn)一步探討CRABA菌株對碳青霉烯類抗菌藥物的分子流行病學(xué)情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集廣東省中山市西北部區(qū)域2019年1月至2021年12月臨床分離的鮑曼不動桿菌共152株(剔除重復(fù)株，同一患者只留取首次分離株)，其中CRABA 86株，對碳青霉烯類抗菌藥物敏感的鮑曼不動桿菌(CSABA)有66株。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器 VITEK-2全自動微生物鑒定和藥敏分析儀(法國生物梅里埃公司)，凝膠成像儀(美國Bio-rad公司)，2720Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)，DYY-2C型水平電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2.2主要試劑 哥倫比亞血平板、MH瓊脂平板購自廣州市迪景微生物科技有限公司，替加環(huán)素藥敏緩沖液購自珠海迪爾生物有限公司，外排泵基因及外膜孔蛋白carO基因引物(表1)、DNA Marker、Premix溶液等PCR實驗相關(guān)試劑購自上海生工生物工程股份有限公司，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC25922)，銅綠假單胞菌(ATCC27853)均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

表1 靶基因PCR擴(kuò)增引物及產(chǎn)物長度

1.3方法

1.3.1收集CRABA菌株來源患者的臨床資料 收集CRABA菌株來源患者的一般資料，包括性別、年齡，菌株來源科室、標(biāo)本等。

1.3.2藥物敏感試驗 嚴(yán)格按照2020年CLSI-M100第30版[2]推薦的方法進(jìn)行藥敏試驗，采用VITEK-2全自動微生物鑒定和藥敏分析儀檢測細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)，紙片擴(kuò)散法(K-B法)檢測細(xì)菌的抑菌圈直徑。對于替加環(huán)素K-B法的藥敏折點，參照美國FDA的藥敏標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[3]。頭孢哌酮/舒巴坦的藥敏折點參照頭孢哌酮的藥敏標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[4]。

1.3.3基因檢測 挑取新鮮菌落，采用加熱煮沸法制備細(xì)菌DNA模板，PCR擴(kuò)增6種外排泵基因(ade B、ade R、ade S、ade J、abe M)和外膜孔蛋白carO基因(外排泵基因反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。carO基因反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 60 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠、120 V電泳約25 min，通過凝膠成像儀獲取圖像及進(jìn)行分析。

1.3.4基因測序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行純化及測序，結(jié)果在NCBI上經(jīng)BALST比對。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，應(yīng)用WHONET 5.6軟件對鮑曼不動桿菌的抗菌藥物敏感性進(jìn)行描述性分析，計數(shù)資料用百分率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CRABA菌株來源患者的臨床資料 86株CRABA臨床菌株來源患者的年齡為7 d至99歲，其中男性患者56例，女性患者30例，男女比例為1.87∶1。86株CRABA菌株主要分布于重癥監(jiān)護(hù)室48株(55.8%)，神經(jīng)外科11株(12.8%)，神經(jīng)內(nèi)科8株(9.3%)，胸心外科6株(7.0%)，呼吸內(nèi)科5株(5.8%)，內(nèi)分泌科2株(2.3%)，骨科、婦科、口腔科、感染科、手外科以及腫瘤科各1株。86株CRABA菌株來源標(biāo)本的類型以呼吸道標(biāo)本為主，占86.0%；其次為傷口分泌物，占7.0%；血液標(biāo)本占3.5%；尿液標(biāo)本占2.3%；膿液標(biāo)本占1.2%。

2.2藥物敏感試驗 對152株鮑曼不動桿菌進(jìn)行14種抗菌藥物的體外敏感試驗(表2)，其中CRABA對抗菌藥物的耐藥性明顯高于CSABA，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中有4株CRABA菌株對替加環(huán)素耐藥，耐藥率為5.6%；CRABA對頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為24.4%，對米諾環(huán)素的耐藥率為58.0%，對其余抗菌藥物的耐藥率均高于70%。

表2 152株鮑曼不動桿菌對14種抗菌藥物的耐藥率

2.3外排泵基因的檢測 152株鮑曼不動桿菌中，分別檢出ade B 122株、ade R 104株、ade S 114株、ade J 138株、abe M 146株，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序確認(rèn)，見圖1。86株CRABA菌株中ade B(95.3%，82/86)、ade R(80.2%，69/86)、ade S(94.2%，81/86)以及ade J(96.5%，83/86)的檢出率明顯高于66株CSABA菌株中ade B(60.6%，40/66)、ade R(53.0%，35/66)、ade S(50.0%，33/66)以及ade J(83.3%，55/66)的檢出率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；abe M基因在CRABA與CSABA菌株中的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

注：M為DNA Marker；1～2為ade B外排泵基因(541 bp)；3～4為ade R外排泵基因(447 bp)；5～6為ade S外排泵基因(544 bp)；7～8為ade J外排泵基因(463 bp)；9～10為abe M外排泵基因(703 bp)。

2.4外膜孔蛋白carO基因的檢測 152株鮑曼不動桿菌中，共檢出carO基因135株，檢出率為88.8%，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序確認(rèn)，見圖2。其中carO基因在CRABA菌株的檢出率(95.3%)明顯高于CSABA菌株(80.3%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

注：M為DNA Marker；11～16為carO基因(750 bp)。

表3 CRABA和CSABA菌株外膜孔蛋白carO基因及外排泵基因檢出率比較[n(%)]

3 討 論

鮑曼不動桿菌可引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎和血流感染，具有很高的發(fā)病率及病死率，尤其是CRABA的出現(xiàn)和傳播，給臨床的抗感染治療帶來重大挑戰(zhàn)。由于鮑曼不動桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原體，對其菌株進(jìn)行流行病學(xué)以及相關(guān)耐藥機(jī)制的研究十分必要。本研究對鮑曼不動桿菌的臨床數(shù)據(jù)以及耐藥性分析顯示，鮑曼不動桿菌的分離株主要存在于重癥監(jiān)護(hù)室、神經(jīng)外科以及神經(jīng)內(nèi)科，常見于長期臥床、有侵入性操作史和免疫功能低下的患者。CRABA菌株對抗菌藥物的耐藥性明顯高于CSABA。其中CRABA菌株對替加環(huán)素的耐藥率最低(5.6%)，頭孢哌酮/舒巴坦(24.4%)以及米諾環(huán)素(58.0%)次之，對其他抗菌藥物的耐藥率均高于70%，該結(jié)果與2020年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)較一致[1]。抗菌藥物的持續(xù)過度使用導(dǎo)致鮑曼不動桿菌的耐藥性增強(qiáng)，其原因可能是通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得了各種抗菌藥物抗性基因[5]或其他因素[6]導(dǎo)致，包括膜通透性降低、抗菌藥物靶位的改變、水解酶的產(chǎn)生、外排泵的過度表達(dá)以及生物膜的形成等。在所有耐藥機(jī)制的研究中，外排泵因其廣泛的底物特異性和在不同細(xì)菌中的廣泛分布而成為重要的耐藥決定因素之一。

鮑曼不動桿菌的基因組富含藥物主動外排泵基因，其外排泵對多種底物表現(xiàn)出特異性，例如抗菌藥物、去污劑、殺菌劑以及染料等，除此以外還可排出具有不同生理功能的關(guān)鍵分子，其中最常見的是耐藥結(jié)節(jié)分化家族，主要介導(dǎo)鮑曼不動桿菌的固有耐藥以及獲得性耐藥。本研究表明Ade ABC、Ade IJK、Abe M外排泵及調(diào)控基因(ade R、ade S)廣泛分布于臨床鮑曼不動桿菌分離株中，CRABA菌株各基因的檢出率在80%～98%，CSABA菌株各基因的檢出率在50%～92%，與BADWY等[7]研究結(jié)果相似。在CRABA菌株中ade B基因的檢出率高達(dá)95.3%，與CSABA菌株的檢出率(60.6%)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明ade B基因是Ade ABC外排泵產(chǎn)生耐藥的主要因素[8-9]。Ade ABC外排泵的表達(dá)受上游雙組分調(diào)控系統(tǒng)Ade RS控制，Ade RS通過堿基的突變可引起Ade ABC外排泵的過度表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)CRABA菌株中ade R及ade S基因的檢出率明顯高于CSABA菌株，進(jìn)一步推測在CRABA菌株中Ade RS控制系統(tǒng)更容易引起Ade ABC外排泵的高表達(dá)，從而導(dǎo)致菌株耐藥性的增高。Ade IJK外排泵主要與Ade ABC外排泵組成復(fù)合體結(jié)構(gòu)，對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒素作用，Ade J外排泵與Ade B外排泵具有協(xié)同效果，Ade J外排泵可利用四環(huán)素類抗菌藥物的疏水特性進(jìn)行識別，可能成為耐替加環(huán)素鮑曼不動桿菌的優(yōu)勢基因[10-11]。本研究中ade J基因檢出率在CRABA與CSABA菌株間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中4株對替加環(huán)素耐藥的CRABA菌株均檢出ade J和ade B基因。MATE家族中的Abe M外排泵以H+驅(qū)動力作為主要能量，程建軍等[10]研究表明abe M基因的高表達(dá)與鮑曼不動桿菌的多重耐藥密切相關(guān)，BRATU 等[12]研究指出 abe M基因?qū)︴U曼不動桿菌菌株多重耐藥性的參與較弱。本實驗發(fā)現(xiàn)abe M基因檢出率在CRABA菌株與CSABA菌株間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可能與對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥無關(guān)，而ade B、ade R、ade S以及ade J基因的檢出率在CRABA與CSABA菌株間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示本地區(qū)CRABA的耐藥性與AdeABC及Ade IJK外排泵密切相關(guān)。

在鮑曼不動桿菌的外膜蛋白中，carO是僅次于OmpA的第二豐富蛋白質(zhì)，可通過抑制NF-κB信號傳導(dǎo)影響鮑曼不動桿菌在宿主細(xì)胞中的黏附和毒力[13],同時carO蛋白參與了亞胺培南、鳥氨酸在鮑曼不動桿菌外膜中的選擇性滲透[14]，因此當(dāng)它發(fā)生丟失或突變時，與碳青霉烯類抗菌藥物的獲得性耐藥存在一定聯(lián)系[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，carO基因的檢出率在CRABA與CSABA菌株間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，carO基因在CRABA菌株中更容易檢出。該結(jié)果與ABBASI等[16]研究相符，但與潘紅超等[17]的研究不同，可能是由于多種carO 多態(tài)性變體共存于對亞胺培南具有不同特異性的鮑曼不動桿菌種群中所引起，因此還需要對carO蛋白的mRNA做定量分析，有助于了解carO蛋白在不同鮑曼不動桿菌中的表達(dá)。

綜上所述，鮑曼不動桿菌的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，不同耐藥機(jī)制之間交錯聯(lián)系，外膜孔蛋白以及外排泵系統(tǒng)是本地區(qū)CRABA的主要耐藥機(jī)制之一，其中abe M基因可能與CRABA菌株耐藥性無關(guān)。本研究的不足之處在于沒有對外排泵基因及外膜孔蛋白基因的表達(dá)做定量分析，將在以后的研究中補(bǔ)充，以期進(jìn)一步明確鮑曼不動桿菌的相關(guān)耐藥機(jī)制。