楊 欣，魯利群，賀 靜，黃 莉，汪 燕

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，四川成都 610500

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是導(dǎo)致新生兒死亡及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的重要因素。有研究表明，約有50%的腦癱患兒是由于HIE所引起[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，早期對(duì)HIE進(jìn)行治療能夠改善HIE患兒預(yù)后[2]，因此尋找HIE早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)具有調(diào)控功能的內(nèi)源性小RNA分子，參與機(jī)體多種生理、病理過(guò)程[3]。研究表明，miR-30b、miR-199a在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中存在異常表達(dá)，與神經(jīng)系統(tǒng)病變有密切關(guān)系[4-6]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、S100B蛋白、信號(hào)素3A(SEM3A)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)均是與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切關(guān)系的蛋白[7-9]。但目前關(guān)于血清miR-30b、miR-199a表達(dá)水平與HIE患兒神經(jīng)損傷和預(yù)后的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究擬探討血清miR-30b、miR-199a在HIE患兒中的表達(dá)及意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2020年6月本院收治的HIE患兒90例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合HIE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；(2)足月出生兒，胎齡37～42周；(3)母體妊娠期間無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)先天性顱腦畸形者；(2)伴有顱內(nèi)出血者；(3)合并腦組織感染者；(4)合并會(huì)影響研究結(jié)果的其他系統(tǒng)疾病者。根據(jù)患兒病情程度將其分為輕度組29例、中度組36例、重度組25例。另選擇同期在本院出生的足月健康新生兒30例作為對(duì)照組。各組基線(xiàn)資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。入組新生兒家屬均了解本研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1檢測(cè)標(biāo)本采集及保存 于分娩后24 h內(nèi)采集所有受試新生兒外周靜脈血4 mL，在室溫條件下靜置10 min后，以4 000 r/min離心10 min，離心半徑為12 cm，分離血清，并將分離的血清編號(hào)保存在-20 ℃冰箱中。

1.2.2血清miR-30b、miR-199a表達(dá)水平檢測(cè) 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)血清miR-30b、miR-199a表達(dá)水平。取新生兒外周靜脈血血清1 mL，應(yīng)用Trizol法提取血清總RNA，Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司(生產(chǎn)批號(hào)20190392)，應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)量樣品濃度，再應(yīng)用Taq Man RT kit(日本Takara公司生產(chǎn)，批號(hào)：190284)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，提取總RNA。應(yīng)用TaqMan microRNA assay(廣州銳博生物公司生產(chǎn)，批號(hào)190528)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以U6為內(nèi)參，引物序列由廣州銳博有限公司合成，見(jiàn)表2。反應(yīng)體系：cDNA底物1.33 μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μL，TaqMan microRNA assay 1.00 μL，ddH2O 7.67 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共計(jì)45個(gè)循環(huán)，每個(gè)指標(biāo)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔重復(fù)3次，完成后通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-30b、miR-199a表達(dá)水平。

表2 miR-30b、miR-199a及內(nèi)參U6的引物序列

1.2.3血清NSE、S100B蛋白、SEM3A、PAI-1水平檢測(cè) 取剩余血清中1 mL應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清NSE水平，測(cè)定儀器為羅氏ELecsys2017電化學(xué)發(fā)光儀，試劑盒購(gòu)自羅氏公司，批號(hào)：180359J；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清S100B蛋白、SEM3A、PAI-1水平，試劑盒購(gòu)自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：180719、180213、181104。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4神經(jīng)功能評(píng)估 于出生后30 d應(yīng)用新生兒20項(xiàng)行為神經(jīng)(NBNA)評(píng)分[11]評(píng)估所有受試新生兒的神經(jīng)功能，該評(píng)分系統(tǒng)包括一般評(píng)估3項(xiàng)、行為能力6項(xiàng)、肌張力8項(xiàng)、原始反射3項(xiàng)，共20項(xiàng)，總分40分，評(píng)分越高表明神經(jīng)功能越好。

1.2.5隨訪(fǎng)及預(yù)后評(píng)估 所有HIE患兒以門(mén)診復(fù)查的形式隨訪(fǎng)1年，觀(guān)察記錄患兒神經(jīng)發(fā)育情況。根據(jù)患兒預(yù)后情況將其分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組。患兒無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)異常、無(wú)智力缺陷為預(yù)后良好；存在腦癱、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病、智力缺陷或死亡則為預(yù)后不良。

2 結(jié) 果

2.1各組血清miR-30b、miR-199a表達(dá)水平及神經(jīng)功能、神經(jīng)損傷指標(biāo)水平比較 HIE患兒的血清miR-30b、miR-199a表達(dá)水平及NBNA評(píng)分低于對(duì)照組(P<0.05)；趨勢(shì)檢驗(yàn)顯示病情越重，HIE患兒的血清miR-30b、miR-199a表達(dá)水平及NBNA評(píng)分越低(P<0.05)。HIE患兒的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平高于對(duì)照組(P<0.05)；趨勢(shì)檢驗(yàn)顯示病情越重，HIE患兒的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平越高(P<0.05)。見(jiàn)表3、4。HIE患兒血清miR-30b、miR-199a及內(nèi)參U6 qRT-PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖1～3。

圖1 miR-30b qRT-PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

表3 各組血清miR-30b、miR-199a表達(dá)水平比較

表4 各組血清神經(jīng)功能及神經(jīng)損傷指標(biāo)水平比較

續(xù)表4 各組血清神經(jīng)功能及神經(jīng)損傷指標(biāo)水平比較

2.2HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達(dá)與神經(jīng)功能及神經(jīng)損傷指標(biāo)水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，HIE患兒血清miR-30b表達(dá)與NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平呈負(fù)相關(guān)(r<0，P<0.05)，與NBNA評(píng)分呈正相關(guān)(r>0，P<0.05)；血清miR-199a表達(dá)與NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平呈負(fù)相關(guān)(r<0，P<0.05)，與NBNA評(píng)分呈正相關(guān)(r>0，P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達(dá)與神經(jīng)功能及神經(jīng)損傷指標(biāo)水平的相關(guān)性

2.3不同預(yù)后HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達(dá)及神經(jīng)功能、神經(jīng)損傷指標(biāo)水平比較 共87例患兒完成隨訪(fǎng)，失訪(fǎng)3例，根據(jù)患兒預(yù)后情況將其分為預(yù)后良好組60例，預(yù)后不良組27例。預(yù)后不良組的血清miR-30b、miR-199a表達(dá)水平及NBNA評(píng)分明顯低于預(yù)后良好組，NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平則明顯高于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表6。

圖2 miR-199a qRT-PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

圖3 U6 qRT-PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

2.4影響HIE患兒預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 建立多因素非條件Logistic回歸模型，以本研究HIE患兒為樣本，HIE患兒的預(yù)后情況為因變量(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)，以表6中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)為自變量，并以所有HIE患兒各指標(biāo)均值為臨界值(根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)取整)，將各指標(biāo)轉(zhuǎn)化成二分類(lèi)變量，賦值見(jiàn)表7?；貧w采用逐表后退法，α進(jìn)=0.05，α退=0.10?；貧w結(jié)果顯示：NSE≥35 g/L、S100B≥100 ng/L、SEM3A≥45 ng/mL、PAI-1≥100 pg/mL是HIE患兒預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，miR-30b≥0.85、miR-199a≥1.25、NBNA評(píng)分≥32分則是HIE患兒預(yù)后不良的保護(hù)因素(P<0.05)，見(jiàn)表7。

表6 不同預(yù)后HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達(dá)及神經(jīng)功能、神經(jīng)損傷指標(biāo)水平比較

表7 影響HIE患兒預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

HIE是導(dǎo)致新生兒神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙和殘疾的嚴(yán)重疾病，其致殘率和致死率均較高，患兒常遺留共濟(jì)失調(diào)、腦癱、癲癇和智力障礙等后遺癥，不僅給患兒的健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅，也給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。HIE的早期診斷并及時(shí)對(duì)患兒的神經(jīng)損傷程度進(jìn)行判斷，有助于降低患兒病死率，改善預(yù)后。目前臨床上對(duì)于HIE的診斷主要包括顱腦超聲檢查、頭顱CT檢查、腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位檢查及血清學(xué)檢測(cè)等[12]。其中血清學(xué)檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單、診斷迅速、可重復(fù)觀(guān)察的優(yōu)點(diǎn)，并且血清學(xué)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化可以反映疾病發(fā)展情況，受到臨床醫(yī)生的青睞。

miRNA是一類(lèi)單鏈非編碼RNA，可以在組織和血液中穩(wěn)定存在。研究表明，miRNA可以與靶基因的3′非編碼序列結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)[13]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，在新生兒HIE發(fā)生、發(fā)展中存在miRNA的異常表達(dá)，影響HIE的發(fā)展和患兒的預(yù)后[14]。PAGACZ等[15]報(bào)道，當(dāng)腦組織缺氧后有23種miRNA表達(dá)上調(diào)、32種miRNA表達(dá)下調(diào)。miR-30b和miR-199a均是與大腦神經(jīng)功能密切相關(guān)的miRNA。SONG等[16]研究指出，miR-30b可以通過(guò)調(diào)控多種蛋白和信號(hào)通路影響大腦突觸功能，進(jìn)而影響阿爾茨海默病患者的認(rèn)知功能，并在大腦神經(jīng)退行性病變的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。miR-199a與大腦神經(jīng)功能及組織缺氧有密切關(guān)系。TIAN等[17]報(bào)道，miR-199a具有促進(jìn)血管內(nèi)皮新生的功能。LE等[18]研究指出，miR-199a下降可以引起血管內(nèi)皮功能失調(diào)，并導(dǎo)致血流供應(yīng)障礙。SUN等[19]報(bào)道，當(dāng)組織發(fā)生缺氧時(shí)，miR-199a表達(dá)水平顯著降低，引起組織中缺氧誘導(dǎo)因子水平升高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIE患兒血清miR-30b、miR-199a低表達(dá)，并與HIE的病情密切相關(guān)，病情越重，患兒血清miR-30b、miR-199a表達(dá)水平越低，推測(cè)當(dāng)發(fā)生HIE時(shí)，腦組織缺氧缺血，導(dǎo)致miR-30b、miR-199a水平降低。miR-30b可以通過(guò)調(diào)控信號(hào)通路影響與神經(jīng)功能相關(guān)的蛋白，加重神經(jīng)元損傷，而miR-199a則可能通過(guò)引起血管內(nèi)皮功能失調(diào)，引起腦組織血流供應(yīng)障礙，加重患兒腦組織損傷。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，HIE患兒的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平高于對(duì)照組；趨勢(shì)檢驗(yàn)顯示病情越重，HIE患兒的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平越高。NSE主要存在于神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)及神經(jīng)內(nèi)分泌組織中，與神經(jīng)系統(tǒng)的增殖、分化和代謝有密切關(guān)系[20]。S100B是一類(lèi)特異性鈣結(jié)合蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)垂體前葉細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中[21]。當(dāng)發(fā)生HIE時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生缺氧損傷，血清內(nèi)NSE、S100B水平升高[22]。SEM3A是一種以半胱氨酸富集區(qū)域?yàn)樘卣鞯姆置谛偷鞍?，具有調(diào)控神經(jīng)軸突生長(zhǎng)、發(fā)育的功能[23]。PAI-1是一種促進(jìn)血栓形成的因子，與心腦血管疾病的發(fā)生有密切關(guān)系[24]。筆者推測(cè)，當(dāng)發(fā)生HIE時(shí)，腦血管發(fā)生缺血缺氧，PAI-1水平升高，并進(jìn)一步引起腦血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)微血栓形成[25]。而HIE患兒SEM3A水平升高可能是一種代償性升高，表明此時(shí)神經(jīng)元受到損傷。通過(guò)NBNA評(píng)分可以了解新生兒行為能力，并能早期發(fā)現(xiàn)顱腦損傷。NBNA評(píng)分由20項(xiàng)內(nèi)容組成，評(píng)分越低表明神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重[26]。本研究HIE患兒NBNA評(píng)分低于對(duì)照組，趨勢(shì)檢驗(yàn)顯示病情越重，HIE患兒NBNA評(píng)分越低，表明患兒神經(jīng)功能受損也逐漸加重。

KHANDELWAL等[27]研究報(bào)道SEM3A是miR-30b的調(diào)控靶基因。而LUCA等[28]報(bào)道PAI-1是miR-199a的調(diào)控靶基因。本研究中，HIE患兒血清miR-30b表達(dá)與SEM3A水平呈負(fù)相關(guān)，也提示miR-30b水平降低后可能導(dǎo)致其對(duì)SEM3A的抑制作用降低，導(dǎo)致SEM3A水平升高。miR-199a表達(dá)與血清PAI-1水平呈負(fù)相關(guān)，則提示miR-199a水平降低后可能導(dǎo)致其對(duì)PAI-1抑制作用降低，PAI-1水平升高，促進(jìn)血栓形成從而促進(jìn)HIE的發(fā)展。另外，HIE患兒血清miR-30b表達(dá)與NSE、S100B、PAI-1水平呈負(fù)相關(guān)，與NBNA評(píng)分呈正相關(guān)；血清miR-199a表達(dá)與NSE、S100B、SEM3A水平呈負(fù)相關(guān)，與NBNA評(píng)分呈正相關(guān)。這也提示miR-30b、miR-199a、NSE、S100B、SEM3A、PAI-1可能共同參與了HIE的發(fā)生和發(fā)展，其具體機(jī)制仍有待于今后深入研究。

本研究多因素分析得出：NSE≥35 g/L、S100B≥100 ng/L、SEM3A≥45 ng/mL、PAI-1≥100 pg/mL是HIE患兒預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，miR-30b≥0.85、miR-199a≥1.25、NBNA評(píng)分≥32分則是HIE患兒預(yù)后不良的保護(hù)因素(P<0.05)，提示通過(guò)對(duì)HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達(dá)水平進(jìn)行觀(guān)測(cè)，可以為HIE患兒的預(yù)后評(píng)估提供一定依據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達(dá)水平異常降低，且患兒神經(jīng)損傷程度越嚴(yán)重其表達(dá)水平越低。miR-30b、miR-199a、NSE、S100B、SEM3A、PAI-1可能共同參與了HIE的發(fā)生和發(fā)展。血清miR-30b、miR-199a的表達(dá)水平對(duì)HIE的診斷和預(yù)后判斷具有一定參考價(jià)值。