岐 錦,王 靜,姚秀坤

山西省兒童醫(yī)院(山西省婦幼保健院)：1.營養(yǎng)科；2.血液科，山西太原 030002；3.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030002

特發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)是一種以血小板(PLT)破壞、巨核細胞成熟障礙為特征的自身免疫性疾病[1]。ITP多見于兒童，目前，激素治療和脾臟切除是治療ITP的主要方案，但少數(shù)患兒仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)或?qū)λ幬锊幻舾械惹闆r，使顱內(nèi)出血等并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險增加。因此，發(fā)現(xiàn)合適的生化指標判斷患兒的病情及預(yù)后對早期臨床干預(yù)至關(guān)重要。整合素β3(ITGB3)是一種跨膜糖蛋白受體，由788個氨基酸組成，主要存在于PLT和巨核細胞表面，具有調(diào)控細胞黏附、凋亡及遷移和介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)的連接等功能[2]。研究表明，ITGB3能夠誘導(dǎo)血小板生成素活化，激活休眠中的造血干細胞(HSC)，維持HSC活性，促進PLT合成[2]。過氧化物酶(PRDX)6屬于非硒代谷胱甘肽過氧化物酶家族，其編碼基因位于染色體1q24，相對分子質(zhì)量約為25 000，主要存在于細胞質(zhì)中，參與氧化應(yīng)激、細胞凋亡及新陳代謝等過程[3]。研究表明，PRDX6失活能夠促進巨核細胞凋亡，導(dǎo)致分化為PLT的數(shù)量下降，加速慢性ITP進展[3]。目前ITGB3和PRDX6在ITP中的報道少見，且與疾病嚴重程度和預(yù)后關(guān)系尚不清楚。因此，本研究旨在探討ITP患兒血清中ITGB3和PRDX6水平及與疾病嚴重程度和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2021年8月山西省婦幼保健院收治的73例ITP患兒作為ITP組，同時選取70例相同年齡層來院體檢的健康兒童作為對照組。ITP組中男32例、女41例，年齡1～11歲、平均(6.27±1.96)歲；對照組中男31例、女39例，年齡2～10歲、平均(6.33±1.78)歲。兩組的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。ITP患兒納入標準：(1)符合ITP診斷標準[4]；(2)均為首次診斷ITP，且病程<4周；(3)既往未接受過激素或丙種球蛋白類藥物治療。排除標準：(1)伴有凝血功能障礙疾病，如：彌漫性血管內(nèi)凝血、血友病及先天性凝血因子缺乏癥等；(2)肝、腎功能障礙；(3)伴有先天或后天性免疫功能異常。本研究經(jīng)山西省婦幼保健院倫理委員會批準，所有研究對象家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血液指標的檢測方法 所有研究對象均于空腹狀態(tài)下采集10 mL靜脈血置于抗凝管中。其中5 mL血液標本通過離心機(生產(chǎn)廠家：美國Labnet公司；型號：SCI-12)離心，離心條件為6 000 r/min(4 ℃)、離心半徑10 cm、離心時間5 min，收集上清液，采用MC-6600全自動血常規(guī)分析儀(生產(chǎn)廠家：深圳市美思康電子有限公司)檢測PLT計數(shù)，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中ITGB3和PRDX6水平。嚴格遵照試劑盒說明書進行操作。剩余的5 mL血液標本采用全光譜流式細胞儀(生產(chǎn)廠家：Cytek公司；型號：Aurora 3L)檢測CD4+T細胞 /CD8+T細胞比值。將標本使用乙二胺四乙酸二鈉進行抗凝，每個試管均加入20 μL的單克隆抗體，混勻后室溫避光染色10～15 min，使用磷酸鹽緩沖液洗滌1遍，棄上清液后加入磷酸鹽緩沖液重懸細胞0.5 mL，之后加入肝素抗凝，用流式細胞儀檢測。

1.2.2ITP嚴重程度分級 (1)輕度：PLT計數(shù)為(20～100)×109/L，小瘀斑和出血點較少。(2)中度：PLT計數(shù)為(10～20)×109/L，大瘀斑(直徑>5 cm)和出血點較多，伴有牙齦、鼻、消化道反復(fù)出血，偶見血尿、血便及咳血表現(xiàn)。(3)重度：PLT計數(shù)<10×109/L，全身廣泛大瘀斑和出血點，伴有牙齦、口腔及咽部持續(xù)性出血，偶見內(nèi)臟出血或顱內(nèi)出血[5]。

1.2.3ITP的治療方法及預(yù)后評估 (1)對于PLT計數(shù)≥20×109/L且無內(nèi)臟出血者，采用地塞米松(生產(chǎn)企業(yè)：廣東華南藥業(yè)集團有限公司；批準文號：國藥準字H44024469)治療，靜脈注射，劑量為1 mg/(kg·d)，最大劑量≤15 mg。當(dāng)PLT計數(shù)恢復(fù)正常后，采用潑尼松(生產(chǎn)企業(yè)：華中藥業(yè)股份有限公司；批準文號：國藥準字H42021394)治療，口服，初始劑量為1.5～2.0 mg/(kg·d)，逐漸減量至停用。(2)對于PLT計數(shù)<20×109/L或伴有內(nèi)臟出血者，采用地塞米松聯(lián)合丙種球蛋白(生產(chǎn)企業(yè)：華蘭生物工程股份有限公司；批準文號：國藥準字S10970034)治療。地塞米松用法、用量與(1)中一致。丙種球蛋白的劑量為400 mg/(kg·d)，靜脈注射。當(dāng)血PLT計數(shù)恢復(fù)正常后，采用潑尼松口服，用法、用量與(1)中一致。(3)若(1)和(2)在經(jīng)過2周治療后，尚未達到理想療效，則采用甲潑尼龍(生產(chǎn)企業(yè)：天津天藥藥業(yè)股份有限公司；批準文號：國藥準字H20020223)實施沖擊治療，劑量為10 mg/(kg·d)，連續(xù)使用5 d，再次評估PLT計數(shù)，采用(1)或(2)中的治療方案。此外，在治療期間進行針對性的飲食管理，如：改善飲食結(jié)構(gòu)、低鈉低膽固醇飲食、多食用含鐵的綠葉蔬菜及增加攝入含有凝血止血成分的食物(銀耳、紅棗、紅衣花生及荷葉等)。治療周期為4周，若PLT計數(shù)未升高，且臨床癥狀未改善，則判斷為預(yù)后不良[5]。

2 結(jié) 果

2.1兩組研究對象血液指標的比較 ITP組PLT計數(shù)、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值及血清中ITGB3、PRDX6水平均較對照組明顯下降(P<0.05)，見表1。

表1 兩組研究對象血液指標的比較

2.2不同嚴重程度ITP患兒各項血液指標的比較 重度患兒PLT計數(shù)、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值及血清中ITGB3、PRDX6水平均低于中度及輕度患兒，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中度患兒PLT計數(shù)、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值及血清中ITGB3、PRDX6水平低于輕度患兒，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同嚴重程度ITP患兒各項血液指標的比較

2.3血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計數(shù)、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值的相關(guān)性 血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計數(shù)、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值均呈正相關(guān)(r>0，P<0.05)，見表3。

表3 血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計數(shù)、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值的相關(guān)性

2.4不同預(yù)后情況的ITP患兒血清中ITGB3、PRDX6水平差異 經(jīng)治療，預(yù)后良好患兒64例，預(yù)后不良患兒9例。預(yù)后不良患兒血清中ITGB3、PRDX6水平較預(yù)后良好患兒明顯下降(P<0.05)，見表4。

表4 不同預(yù)后情況的ITP患兒血清中ITGB3、PRDX6水平比較

2.5血清ITGB3、PRDX6水平對ITP患兒預(yù)后不良的診斷價值 以ITP患兒是否出現(xiàn)預(yù)后不良為前提繪制ROC曲線。ITGB3、PRDX6判斷ITP患兒預(yù)后不良的最佳截斷值分別為105.31 pg/mL、28.98 pg/mL，曲線下面積(AUC)分別為0.786、0.741(Z=3.824，P<0.05；Z=2.841，P<0.05)。兩指標聯(lián)合檢測判斷ITP患兒預(yù)后不良的AUC為0.852(Z=6.799，P<0.05)，其靈敏度和特異度分別為88.89%和78.12%。見表5和圖1。

表5 血清ITGB3、PRDX6水平對ITP患兒預(yù)后不良的診斷價值

圖1 血清ITGB3、PRDX6水平診斷ITP患兒預(yù)后不良的ROC曲線

3 討 論

兒童ITP的具體發(fā)病機制與機體免疫失耐受所致的血小板破壞及生成不足有關(guān)。皮膚黏膜出血、牙齦出血及鼻出血是ITP的主要臨床表現(xiàn)，嚴重者可能出現(xiàn)內(nèi)臟出血或顱內(nèi)出血，危及患者生命。目前，PLT計數(shù)是判斷ITP嚴重程度的常用指標，但也有其局限性，而針對ITP的預(yù)后評估尚無法做出有效判斷。因此，為了幫助臨床在早期采用更加合理的治療方案，探索合適的生化指標輔助評估ITP的預(yù)后情況是必要的。

ITGB3又稱CD61，是一種Ca2+依賴的異源二聚體復(fù)合物，相對分子質(zhì)量為(90～110)×103，其編碼基因位于17號染色體，包括αvβ3 和αⅡbβ3兩種類型，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、傷口愈合、凝血止血及免疫應(yīng)答等病理生理過程[6]。BERTRAM等[7]發(fā)現(xiàn)，在拮抗ITGB3后，小鼠腦血管內(nèi)皮細胞大量凋亡，血管密度減低，血管生成相關(guān)因子沉默，從而導(dǎo)致顱內(nèi)出血。在ITGB3基因缺失的小鼠中，循環(huán)血管生成細胞分化減少，同時對損傷的內(nèi)皮細胞下膜的黏附性降低，無法與纖維蛋白原結(jié)合，提高了血管滲血或出血的風(fēng)險[6]。本研究結(jié)果表明，ITP組血清中ITGB3水平較對照組明顯下降(P<0.05)，提示ITGB3可能是影響ITP發(fā)病的重要因素。其原因可能是抗PLT自身抗體能夠特異性識別PLT表面的ITGB3，抗體與ITGB3結(jié)合后，誘導(dǎo)巨噬細胞將其吞噬分解，使血清中的ITGB3水平降低[8]。本研究結(jié)果顯示，隨著ITP嚴重程度的增加，血清中ITGB3水平逐漸降低(P<0.05)，提示ITGB3可能參與了ITP的進展。其機制可能是血清中ITGB3水平降低后，其自身的ICY 結(jié)構(gòu)域失活，發(fā)生去磷酸化，阻礙信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和細胞骨架蛋白肌球蛋白在糖蛋白(GP)Ⅱb /Ⅲa結(jié)構(gòu)域中積聚，從而使PLT活性喪失，加重ITP病情[8]。此外，ITGB3失活能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，使血管通透性增加，同時，內(nèi)皮細胞凋亡使機體凝血系統(tǒng)異常，PLT合成受阻，導(dǎo)致血清中PLT計數(shù)下降[2,9]。

PRDX6是僅含有1個保守半胱氨酸(Cys)殘基的PRDX超家族成員，包含224個氨基酸，同時具有磷脂酶A2(PLA2)和谷胱甘肽(GSH)過氧化物酶功能，在抵御細胞膜表面氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮重要作用[10]。VRBENSKY等[10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PRDX6失活時，白細胞介素-1表達增加，促進腫瘤壞死因子釋放，抑制花生四烯酸合成，阻礙PLT激活，并誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡。動物實驗表明，在PRDX6基因敲除的大鼠體內(nèi)，炎癥細胞浸潤程度增加，促進活性氧(ROS)釋放，抑制PLT生長因子活性，提高大鼠肺泡出血風(fēng)險[11]。本研究結(jié)果表明，ITP組血清中PRDX6水平較對照組明顯下降(P<0.05)，提示PRDX6可能在ITP發(fā)病過程中起到重要作用。其原因可能是PRDX6基因啟動子沉默，無法轉(zhuǎn)錄合成PRDX6，造成血清中PRDX6水平下降，但其具體調(diào)控機制尚不清楚[12]。本研究結(jié)果表明，隨著ITP嚴重程度的增加，血清中PRDX6水平逐漸降低(P<0.05)，提示PRDX6可能在ITP進展具有調(diào)控作用。其原因可能是PRDX6下調(diào)后能夠激活絲/蘇氨酸激酶(AKT)信號通路，促進促凋亡蛋白Bad磷酸化，誘導(dǎo)PLT失活，促進ITP進展[12]。此外，PRDX6活性降低能夠使ROS大量合成，促進線粒體去極化，使內(nèi)環(huán)境處于氧化還原狀態(tài)，各種凋亡相關(guān)蛋白被激活，促進PLT凋亡[13]。

本研究結(jié)果表明，血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計數(shù)、CD4+T細胞 /CD8+T細胞比值均呈正相關(guān)(P<0.05)，提示血清中ITGB3、PRDX6水平能夠在一定程度上反映機體免疫應(yīng)答狀態(tài)和血液中PLT含量。其機制可能是ITGB3水平降低能夠促進內(nèi)皮細胞凋亡，使細胞間黏附分子-1(ICAM-1)下調(diào)，抑制CD4+T細胞活性，導(dǎo)致CD4+T細胞 /CD8+T細胞比值失衡，誘導(dǎo)B淋巴細胞產(chǎn)生識別PLT的特異性抗體，破壞血管內(nèi)的PLT[14]。PRDX6下調(diào)后無法消耗ROS，導(dǎo)致機體內(nèi)ROS水平明顯上升，使CD4+T細胞對有絲分裂原不應(yīng)答，抑制其分裂、增殖，使CD4+T細胞/CD8+T細胞比值下降，同時，過量的ROS通過氧化應(yīng)激反應(yīng)使巨核細胞的細胞膜受損，無法分化PLT，導(dǎo)致PLT計數(shù)下降[15]。本研究中預(yù)后不良患兒血清中ITGB3、PRDX6水平均較預(yù)后良好患兒明顯下降(P<0.05)，提示ITGB3和PRDX6水平可能影響ITP患兒的預(yù)后情況，對輔助臨床早期篩查具有重要意義。ROC曲線顯示，ITGB3和PRDX6聯(lián)合檢測判斷ITP患兒預(yù)后不良的AUC明顯高于ITGB3、PRDX6單一檢測的AUC，靈敏度和特異度分別為88.89%和78.12%，提示兩指標聯(lián)合檢測能夠提高對ITP患兒是否發(fā)生預(yù)后不良的診斷價值，同時，聯(lián)合檢測的靈敏度明顯高于單一指標檢測，有利于早期篩查可能發(fā)生預(yù)后不良的患兒，為臨床早期進行針對性治療提供可靠支持。

綜上所述，ITP患兒血清中ITGB3和PRDX6水平降低。同時，血清中ITGB3和PRDX6水平能夠反映機體免疫應(yīng)答狀態(tài)和PLT計數(shù)。這兩指標聯(lián)合檢測對ITP患兒是否發(fā)生預(yù)后不良具有良好的診斷效能，且靈敏度較高，為臨床早期針對性治療提供幫助。但受試驗設(shè)備的限制，血清中ITGB3和PRDX6水平變化的具體機制尚不清楚，需要在后續(xù)的基礎(chǔ)實驗中進一步證實。