李 強 曾 姝 陳建祥 王 俠 張偉明 胡慶龍 鄧美儀 梁容瑞

惡性黑色素瘤是由皮膚和其他器官黑素細胞產(chǎn)生的腫瘤，常見的皮膚惡性黑色素瘤可分為4型，即淺表擴散型、結(jié)節(jié)型、肢端雀斑樣型、惡性雀斑樣型，我國以肢端雀斑樣型最常見[1]。皮膚惡性黑色素瘤發(fā)病率雖低，但惡性程度居所有皮膚腫瘤之首[2]，轉(zhuǎn)移發(fā)生早，死亡率高，晚期惡性黑色素瘤患者的5年生存率不足20%[3]，因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療成為延長惡性黑色素瘤患者生存期的關(guān)鍵。皮膚惡性黑色素瘤診斷的金標準為病理檢查，目前臨床上行病理檢查時已經(jīng)結(jié)合免疫組化染色觀察，通過檢測黑色素瘤特異的分子標志物如S-100、HMB-45 等的表達情況幫助惡性黑色素瘤的診斷。此外，相關(guān)基因表達水平的檢測也是診斷黑色素瘤發(fā)生的重要手段[4]。本實驗通過對32例原發(fā)性黑色素瘤和16例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織芯片的免疫檢測分析，探討p-ERK和MGMT在惡性黑色素瘤組織中的表達水平及臨床病理價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 惡性黑色素瘤組織芯片 石蠟包埋的惡性黑色素瘤組織微陣列芯片，由西安艾麗娜生物科技有限公司提供。含TNM和臨床分期，48例/48點，含32例原發(fā)性黑色素瘤，16例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，一例一點。

1.1.2 試劑 一抗Rabbit anti-human MGMT、Rabbit anti-p-ERK1/2來自美國CST公司，二抗HRP Goat anti-Rabbit IgG(H+L)來自美國immunoway公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 (1)惡性黑色素瘤組織芯片蠟塊切片脫蠟和水化；(2)消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；(3)抗原修復：水浴鍋加熱0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至95 ℃左右，放入組織芯片加熱10～15 min,緩沖液自然冷卻后將玻片置于PBS(pH=7.4)中在搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；(4)封閉：在組化圈內(nèi)滴加5%正常山羊血清均勻覆蓋切片，室溫封30 min，甩去多余液體；(5)滴加一抗：在切片上滴加配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜后玻片置于PBS(pH=7.4)中在搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；(6)加二抗：甩去多余液體后滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min；(7)DAB顯色：玻片置于PBS(pH=7.4)中在搖床上洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，3～5分鐘，棕黃色為陽性，蒸餾水充分沖洗切片終止顯色；(8)復染細胞核：蘇木精復染45 s左右，蒸餾水洗，蘇木精分化液分化幾秒，蒸餾水沖洗，蘇木精返藍液返藍，蒸餾水沖洗；(9)脫水封片：將切片依次浸泡；(10)透明：將切片放入100%二甲苯 10 min脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片；(11)顯微鏡鏡檢并拍照。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定 由2位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進行雙盲閱片。陽性表達為細胞膜和(或)胞漿上呈現(xiàn)棕黃色顆粒；采用半定量的結(jié)果判斷，分別對鏡下陽性細胞的百分比和染色強度給予評分。(1)陽性著色細胞：每張切片上觀察5個高倍視野(×200)，計數(shù)陽性細胞百分比，陽性細胞數(shù)<5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分， >75%為4分。(2)陽性著色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(3)兩者計分相乘即為陽性等級：0分為陰性(-)，1～4為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.3 觀察指標

根據(jù)惡性黑色素瘤組織芯片中p-ERK和MGMT免疫組化檢測的評分結(jié)果(-、+、++、+++)將惡性黑色素瘤患者分為p-ERK和MGMT陽性組、p-ERK陽性和MGMT陰性組、p-ERK陰性和MGMT陽性組、p-ERK和MGMT陰性組4組，分析惡性黑色素瘤組織中p-ERK和MGMT的表達與惡性黑色素瘤患者臨床病理因素(年齡、性別、病理類型、病理分級分期)的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行卡方檢驗，定P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 p-ERK和MGMT在惡性黑色素瘤組織中的表達水平

根據(jù)MGMT和p-ERK免疫組化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，48例惡性黑色素瘤組織中，p-ERK和MGMT均陽性的有19例、p-ERK陽性和MGMT陰性的有11例、p-ERK陰性和MGMT陽性有1例、p-ERK和MGMT均陰性的有17例。結(jié)果顯示，惡性黑色素瘤組織中p-ERK和MGMT的表達水平呈正相關(guān)，結(jié)果見表1。

表1 MM組織中MGMT和p-ERK1/2免疫組化檢測結(jié)果/例

2.2 惡性黑色素瘤組織中p-ERK、MGMT表達水平與其臨床病理特征的相關(guān)性

MM組織中p-ERK、MGMT表達水平與患者年齡、性別、TNM分期、標本來源等均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

3 討論

黑色素瘤發(fā)展和進展相關(guān)的最常見的基因突變是BRAF突變[5]。超過50%的黑色素瘤存在激活BRAF激酶突變[6]，其結(jié)果是RAF絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號的結(jié)構(gòu)性激活，以促進黑色素瘤增殖和抗凋亡[7]。p-ERK是磷酸化激活的ERK，活化后由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進而介導EIK-1,ATF,Ap-1，c-fos和c-Jun的轉(zhuǎn)錄活化，參與細胞增殖分化、形態(tài)維持、骨架構(gòu)建、細胞凋亡和細胞癌變等多種生物學反應(yīng)。有研究證明了p-ERK是PTEN受損的黑色素瘤中與BRAF抑制劑抵抗相關(guān)的一種重要介質(zhì)[8]。許多研究報道，p-ERK還介導腫瘤進展和耐藥性[9]。例如，p-ERK的激活通過誘導細胞上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[10]促進腫瘤轉(zhuǎn)移。

表2 MM患者MGMT、p-ERK1/2檢出情況與其臨床病理因素的相關(guān)性分析

06-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)是一種損傷逆轉(zhuǎn)自殺酶，在與烷化劑相關(guān)的化療耐藥性中起著重要作用[11]。相關(guān)的研究支持MGMT是轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者對烷化劑治療的臨床反應(yīng)的預測因子[12]。Stefano等的數(shù)據(jù)表明，MGMT啟動子甲基化可能是決定哪些黑色素瘤患者應(yīng)接受TMZ化療的一個重要因素[13]，但是其在惡性黑色素瘤中的預后價值尚未明確。TMZ屬烷化劑類化療藥物，是晚期黑色素瘤化療中的常用藥物。TMZ對腫瘤細胞的殺傷作用主要是使DNA鏈的甲基化，不但阻斷DNA復制，還可進一步引起DNA單鏈或雙鏈斷裂，導致腫瘤細胞周期阻滯，進而引起腫瘤細胞分裂增殖停止或死亡。而MGMT可修復細胞中DNA烷基化損傷，抑制烷化劑引起的細胞毒性作用，這可能是黑色素瘤細胞對TMZ產(chǎn)生耐藥的原因。

當前研究表明惡性黑色素瘤組織中p-ERK和MGMT的表達水平呈正相關(guān)。之前的研究表明，ERK阻斷劑U0126通過阻斷MAPK/ERK途徑下調(diào)MGMT mRNA和MGMT蛋白的表達[14]，這提示ERK和其活化形式p-ERK可能與MGMT的表達水平成正相關(guān)關(guān)系，但具體的機制還有待進一步研究。我們的研究結(jié)果說明MGMT表達與惡性黑色素瘤患者的年齡、病理分期、標本來源無關(guān)(P>0.05),原因可能是我們所采用的標本量較少，為了進一步驗證MGMT和p-ERK表達與惡性黑色素瘤臨床病理的相關(guān)性，需進一步采集更多的標本研究。

綜上所述，我們通過免疫組織化學方法檢測惡性黑色素瘤組織芯片中MGMT和p-ERK蛋白的表達水平，結(jié)果表明MGMT與p-ERK的蛋白表達水平呈正相關(guān)。這提示，ERK通路抑制劑與TMZ聯(lián)用有望增加TMZ對惡性黑色素瘤細胞的殺傷作用，逆轉(zhuǎn)惡性黑色素瘤對TMZ的耐藥，增強臨床治療效果，但仍需進一步實驗研究予以證實。