鄺敏賢，潘弟儀，陳用年，劉少君

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510360

青皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco 及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮?！吨袊幍洹?020 年版將青皮分為“個青皮”和“四花青皮”兩種不同的規(guī)格［1-2］。自然掉落于5～6 月的幼果，采集晾干后，俗稱“個青皮”；采摘于7～8月份未成熟的果實，在果皮上縱剖成4 瓣至基部，切去瓤，干燥后，被稱為“四花青皮”。青皮味苦、辛，性溫，具有破氣行痰、消痞除滿、理氣健脾、燥濕化痰等功效，用于治療胸脅脹痛、疝氣疼痛、乳癖、乳癰、食積氣滯、脘腹脹痛等病癥［3］。如廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院（以下簡稱我院）中醫(yī)外科，醫(yī)師多利用青皮破氣、消痞等功效來治療婦人乳腺方面的疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，青皮具有去痰平喘、利膽、調(diào)節(jié)腸胃功能、抗休克、抗病毒、抗腫瘤及抗氧化等活性［4-6］。青皮主要含有揮發(fā)油、黃酮類和生物堿類等成分，其中黃酮類成分主要為橙皮苷、蕓香柚皮苷、橘皮素等，是其有效成分。2020 年版《中國藥典》一部青皮項下只將橙皮苷作為指標成分，用于對其進行品質(zhì)的控制［1］。目前國家公示的青皮配方顆粒國家標準中，在特征圖譜項下規(guī)定了辛弗林、蕓香柚皮苷、橘皮素等7個特征峰。說明青皮中至少含有這7 個成分。

一測多評法（QAMS）確定其他成分與內(nèi)參照物間的相對校正因子（RCF），利用內(nèi)參照物含量和RCF 可以通過計算得到其他成分的含量，實現(xiàn)對中藥材中多個成分的含量結(jié)果的同時測定，QAMS 已逐漸應(yīng)用于中藥材和中成藥制劑的質(zhì)量控制中［7-9］。本研究通過建立QAMS，以橙皮苷為內(nèi)參照物，同時測定青皮中辛弗林、蕓香柚皮苷、川陳皮素、橘皮素5 種化學(xué)成分的含量，以期進一步優(yōu)化青皮藥材的質(zhì)量標準，為我院采購和驗收青皮藥材或飲片及后續(xù)院內(nèi)制劑研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型超高效液相色譜儀（安捷倫）；Waters Acquity 型超高效液相色譜儀（沃特世）；Eco-S15 實驗室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器）；Quintix系列分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器）；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵；HH-S2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 試藥

橙皮苷（批號：110721-201818，純度96.2%），辛弗林（批號：110727-201809，純度99.5%）購自中國食品藥品檢定研究院。蕓香柚皮苷（批號：wkq19041908，純度≥98%），川陳皮素（批號：wkq20031701，純度≥98%）購自四川維克奇生物科技有限公司。橘皮素（批號：151021，純度98%以上）來自成都普菲德生物技術(shù)。甲醇、乙腈等純度為色譜純（Merck 公司）；甲酸購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純；水使用超純水，其他試劑純度為分析純。10 批青皮藥材均符合2020 年版《中國藥典》一部青皮項下相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［3］

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）梯度洗脫（0～2 min，1%→8% A；2～5 min，8%→13% A；5～12 min，13%→19% A；12～13 min，19%→22% A；13～20 min，22%→35% A；20～21 min，35%→51% A；21～30 min，51%→54% A；30～31 min，54%→1% A；31～35 min，1% A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：275 nm；進樣量：1 μL。

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素和橘皮素對照品適量，置20 mL 量瓶中，加10%甲醇溶解并定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為540.261 6、23.417 6、53.277 5、21.196 3、17.751 2 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取青皮藥材細粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，取出，放冷，再次稱定重量，用10%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，加10%甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件依次進樣測定，記錄色譜圖。以對照品的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，進行線性回歸，得到各待測組分的回歸方程及線性范圍見表1。可知5 個成分于相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.3 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6 次，計算得辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素色譜峰峰面積的RSD 分別為0.73%、0.76%、0.46%、0.32%、0.30%，表明儀器的精密度良好。

圖1 專屬性考察UPLC色譜圖：A.空白溶劑；B.供試品溶液；C.混合對照品溶液

2.4.4 重復(fù)性試驗 取青皮樣品適量，精密稱定，按“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，計算得辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素色譜峰峰面積的RSD 分別為1.28%、1.40%、0.46%、1.74%、2.06%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取青皮樣品適量，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，分別在0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 進樣進行測定，計算得辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素色譜峰峰面積的RSD 分別為1.75%、2.48%、1.00%、1.50%、1.08%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性。

2.4.6 加樣回收率試驗 取同一批次成分含量已知的青皮樣品9 份，每份取約0.1 g，分為3 組，每組分別按高、中、低濃度精密加入混合對照品溶液。按“2.3”項下的方法制備得到供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣進行測定，記錄各自峰面積，計算各成分的加樣回收率及對應(yīng)的RSD。結(jié)果見表2，辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的平均回收率及RSD 分別為101.05%（RSD 2.82%）、96.01%（RSD 2.92%）、96.93%（RSD 1.73%）、94.01%（RSD 2.78%）、103.86%（RSD 2.00%）。表明該方法準確度良好。

表2 青皮中5種成分的加樣回收率試驗結(jié)果

表2 （續(xù)）

2.5 相對校正因子的確定［10-11］

精密吸取“2.4.2”項下的混合對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣進行測定，以橙皮苷為內(nèi)參照物，以各自的峰面積和質(zhì)量濃度，代入公式計算，得其余4 種成分的相對校正因子（fs/k），公式為fs/k=fs/fk=（As×Ck）/（Ak×Cs），其中As為 內(nèi)參照物峰面積，Cs為內(nèi)參照物質(zhì)量濃度，Ak為待測成分峰面積，Ck為待測成分質(zhì)量濃度，結(jié)果見表3。

表3 各成分相對校正因子

2.6 耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性研究

2.6.1 不同品牌色譜儀器及色譜柱對相對校正因子的影響［12］以橙皮苷為內(nèi)參照物，考察其他4 種成分在Agilent 1260 型、Waters Acquity 型兩種高效液相色譜系統(tǒng)，以及沃特世ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），安捷倫ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），YMC Triart C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）等三種色譜柱下的相對校正因子（RCF），結(jié)果見表4，表明不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對各成分RCF 無顯著影響。

表4 不同品牌色譜儀、色譜柱對相對校正因子的影響

2.6.2 不同柱溫對相對校正因子的影響［12］采用Agilent 1260 型高效液相色譜儀、安捷倫ZORBAX SB-C18 色譜柱，考察柱溫設(shè)定為25、30、35、40 ℃下對每種成分的相對校正因子的影響，結(jié)果見表5，不同柱溫條件下4 種成分的RSD 分別為1.48%、1.70%、2.54%、2.62%，均小于3%，表明柱溫對4 種成分相對校正因子無顯著影響。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.6.3 不同流速對相對校正因子的影響［12］采用Agilent 1260 型高效液相色譜儀、安捷倫 ZORBAX SB-C18 色譜柱，考察流速0.2、0.3、0.4 mL/min 對4 種成分相對校正因子的影響，結(jié)果見表6，不同流速條件下4 種成分的RSD 分別為0.94%、1.17%、1.32%、2.76%，表明不同流速對各成分相對校正因子無顯著影響。

表6 不同流速對相對校正因子的影響

2.6.4 不同進樣體積對相對校正因子的影響［12］采用Agilent 1260 型高效液相色譜儀、安捷倫 ZORBAX SB-C18色譜柱，考察進樣體積0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL 對4 種成分相對校正因子的影響，結(jié)果見表7，各成分的RSD 分別為0.88%、2.35%、2.55%、1.80%，表明進樣體積的波動對各成分相對校正因子無顯著影響。

表7 不同進樣體積對相對校正因子的影響

2.7 待測成分色譜峰的定位［13］

在一測多評的運用中，能否在不同色譜體系中對待測組分的色譜峰進行準確定位是關(guān)鍵，目前常用的色譜峰定位方法有相對保留值法、保留時間差法、時間校正法等。相對保留值法計算公式：ti/s=ti/ts。ti為待測組分保留時間，ts為內(nèi)參照物保留時間。本實驗采用相對保留時間進行待測組分色譜峰的定位，以橙皮苷為內(nèi)參照物，考察其他4 種成分在Agilent 1260 型和Waters Acquity 型兩種高效液相色譜系統(tǒng)，以及3 根不同廠家的色譜柱（Waters ACQUITY UPLC BEH C18、Agilent ZORBAX SBC18、YMC Triart C18）的相對保留時間。結(jié)果見表8，采用相對保留值法各成分的RSD 均小于3%，表明采用相對保留值法對待測成分的定位是可行的。

表8 各成分相對保留時間

2.8 一測多評法與外標法測定結(jié)果比較

取10 批青皮適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別采用外標法（ESM）和QAMS 測定5 種成分的含量，利用SPSS 26.0 軟件對兩組檢測結(jié)果進行配對t 檢驗及Pearson 相關(guān)性分析。結(jié)果見表9，兩種方法之間的相關(guān)系數(shù)r均為1.00，表明兩種方法測定結(jié)果具有高相關(guān)性，且兩種方法測定結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05），建立的一測多評法具有較好的可信度。

表9 外標法與一測多評測定結(jié)果比較

3 討論

本研究對供試品溶液的提取方式（超聲法、回流法），提取溶劑（10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇、10%甲醇、20%甲醇、50%甲醇），提取時間（30、45、60 min）和稀釋體積（20、50、100 mL）進行了考察。結(jié)果表明，按“2.3”項下的方法制備得到供試品溶液時色譜峰的峰面積和分離度均較好。在210～400 nm 內(nèi)對供試品溶液進行掃描，發(fā)現(xiàn)在275 nm 時色譜圖基線平穩(wěn)、噪聲小，各組分的響應(yīng)值較高，因此，選擇275 nm 作為檢測波長。

目前，對青皮的研究主要集中于不同產(chǎn)地、不同規(guī)格等方面［3,14-15］。本次實驗以我院的常用藥材青皮為研究對象，希望能同時測定青皮含有的5 種黃酮類成分。引入一測多評法，實驗過程中對測定方法進行方法學(xué)考察，比較不同成分的峰面積和質(zhì)量濃度得到4 種成分與橙皮苷的相對校正因子，還使用外標法來驗證了本實驗建立的一測多評法的準確性，從而考察一測多評法在青皮5 種黃酮類成分的含量測定上是否具有可行性和可操作性。

結(jié)果表明，使用QAMS 測得的青皮5 種黃酮類成分的含量與外標法測定結(jié)果沒有明顯差異，證明建立的一測多評法可行，具有較好的穩(wěn)定性和準確性。此方法的建立，可使青皮藥材從單一成分測定升級為更多成分測定，為更全面地評價青皮藥材質(zhì)量提供了方法。該方法的建立，能大大提高測定速度和降低測定成本，為我院在采購及驗收青皮藥材或飲片質(zhì)量控制提供參考。