吳志強(qiáng)，石悅萌，寇曌婷，王 鑫，黃素文，段躍強(qiáng)

（內(nèi)蒙古華希生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010111）

近幾年，畜牧業(yè)發(fā)展進(jìn)入新階段，牛繁育規(guī)?；潭蕊@著提高，加上牛不斷被調(diào)入轉(zhuǎn)出，牛病也更加復(fù)雜化。牛病流行原因在于多種病毒、細(xì)菌混合感染。呼吸道疾病綜合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）是全球?qū)︷B(yǎng)牛業(yè)損害最嚴(yán)重的疾病之一。該病的病原多數(shù)為牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）及牛副流感3型病毒（BPIV3）等。除此之外，牛支原體（Mycoplasma bovis）也可以引起牛呼吸道感染。

BVDV可感染多種偶蹄目動(dòng)物，如豬、牛等[1]。BVDV感染牛后可出現(xiàn)流產(chǎn)、腹瀉等癥狀和呼吸道相關(guān)疾病[2]。在歐洲，奶牛BVDV陽(yáng)性抗體超過(guò)50%[3-4]。我國(guó)大多數(shù)省份都存在較高的發(fā)病率[1]。IBRV呈世界性流行，其主要臨床表現(xiàn)為呼吸困難、多量黏液性鼻漏、陰道炎、高熱、乳房炎和母畜流產(chǎn)等[5-7]。在全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)IBRV進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)奶牛平均陽(yáng)性率為35.8%，個(gè)別省份為70%[8]。BPIV在自然狀態(tài)下只感染牛，且多見于集約化飼養(yǎng)的奶牛和肉牛[9]。BPIV3單一感染時(shí)不會(huì)引起嚴(yán)重的臨床癥狀，只是引起輕微的呼吸道癥狀，但是病牛如果混合感染或繼發(fā)感染IBRV、牛支原體等則會(huì)使病情急劇惡化。牛支原體能夠引起關(guān)節(jié)炎、犢牛肺炎及乳房炎等疾病，統(tǒng)稱為牛支原體相關(guān)疾病，并可協(xié)同其他病原體導(dǎo)致病情加重[10]。2008年，我國(guó)大規(guī)模暴發(fā)了牛支原體肺炎，發(fā)病率高于50%，病死率也在20%左右[11]。

本試驗(yàn)通過(guò)從內(nèi)蒙古自治區(qū)、山西省某肉牛場(chǎng)采集的疑似感染呼吸道疾病牛的血液、鼻拭子中分離得到BVDV、IBRV、BPIV3和牛支原體病原，并對(duì)其進(jìn)行全面系統(tǒng)的鑒定，為研制牛呼吸道疾病綜合征疫苗提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)于全式金；DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)于Gibco公司；其他試劑為常見試劑。

1.2 病料采集

內(nèi)蒙古自治區(qū)、山西省某規(guī)模化牛場(chǎng)送檢感染呼吸道疾病的15份血液和32份鼻拭子樣本。

1.3 細(xì)胞

MDBK細(xì)胞，由本項(xiàng)目組制備并保存。

1.4 BVDV的分離鑒定

1.4.1 病毒分離與培養(yǎng)。將送檢的疑似BVDV血液樣本于37℃靜置1 h，4℃、5 000 r/min離心15 min分離血清，標(biāo)上序號(hào)和采樣日期。待MDBK傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用PBS(0.01 mol/L，pH值為7.2)清洗1次，將牛血清樣品接種于MDBK細(xì)胞，每個(gè)樣品接種4孔，另設(shè)2孔作為陰性對(duì)照。每孔0.5 mL，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)吸附1 h后棄上清液，用PBS清洗后加2 mL含2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞維持液，置37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日鏡檢觀察細(xì)胞病變（CPE)，5 d 后收獲培養(yǎng)液。

1.4.2 BVDV的RT-PCR鑒定。依據(jù)BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株公開基因序列，在其最保守的5′端非編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物，引物序列見表1。提取病毒cDNA進(jìn)行RT-PCR鑒定，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 BVDV引物序列

1.4.3 免疫熒光試驗(yàn)。將病毒液接種于長(zhǎng)滿單層的MDBK細(xì)胞，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和Oregon C24V病毒陽(yáng)性對(duì)照，置37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，棄培養(yǎng)液，用PBS(0.01 mol/L，pH值為7.2)清洗 3次后，用80%丙酮和20%甲醇混合液-20℃固定30 min。PBS清洗后，分別加入工作濃度熒光標(biāo)記的BVDV單克隆抗體0.1 mL，在37℃濕盒中作用40 min，PBS清洗后每孔再加50 μL PBS，置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 IBRV的分離鑒定

1.5.1 病毒分離與培養(yǎng)。送檢的疑似感染IBRV的牛鼻拭子液經(jīng)凍融3次后將棉簽擰干取出，4℃2 000 r/min 離心 10 min，取上清液，用 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，接種于24孔單層MDBK細(xì)胞的培養(yǎng)板，每孔接種0.5 mL，設(shè)細(xì)胞陰性孔，37℃吸附1 h。吸掉孔內(nèi)液體，PBS清洗2～3次，加入1 mL含2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4日，收獲出現(xiàn)細(xì)胞病變的培養(yǎng)液并傳代。

1.5.2 IBRV的PCR鑒定。根據(jù)GenBank參考序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)gB基因的引物，引物序列見表2。提取病毒液DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表2 IBRV gB基因擴(kuò)增引物序列引物名稱

1.5.3 病毒形態(tài)觀察。取第3代分離毒株細(xì)胞培養(yǎng)物送軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所進(jìn)行負(fù)染制樣，在透射電鏡下觀察病毒形態(tài)。

1.6 BPIV3的分離鑒定

1.6.1 病毒分離與培養(yǎng)。將疑似感染BPIV3的牛的鼻拭子液凍融3次后，按照1.5.1方法進(jìn)行，收獲出現(xiàn)細(xì)胞病變的培養(yǎng)液并傳代。

1.6.2 BPIV3的RT-PCR鑒定。參考GenBank中登錄的BPIV3船運(yùn)熱毒株全基因組序列(AF178655)，設(shè)計(jì)并合成1對(duì)特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，應(yīng)擴(kuò)增出425 bp目的片段。引物序列見表3。

表3 BPIV3引物序列

1.6.3 病毒形態(tài)觀察。取分離毒株細(xì)胞培養(yǎng)物送軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所進(jìn)行負(fù)染制樣，在透射電鏡下觀察病毒形態(tài)。

1.7 牛支原體的分離鑒定

1.7.1 分離與培養(yǎng)。將鼻拭子接種于Hayflick液體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)辄S色時(shí)，將濾液接種到固體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)傳代，置于37℃培養(yǎng)4～5 d，觀察固體培養(yǎng)基上有無(wú)菌落生長(zhǎng)，進(jìn)行吉姆薩染色、Dienes染色，并觀察菌體形態(tài)。

1.7.2 PCR鑒定。提取純化得到的培養(yǎng)液菌液DNA進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，引物序列見表4。

表4 牛支原體引物序列

1.7.3 生化鑒定。取分離菌株分別進(jìn)行生化鑒定。鑒定項(xiàng)目包括：紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)、分解葡萄糖試驗(yàn)、分解麥芽糖試驗(yàn)、分解尿素試驗(yàn)、分解精氨酸試驗(yàn)、氯化四氮唑還原試驗(yàn)、膽固醇需要試驗(yàn)、亞甲藍(lán)著色試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV分離鑒定

2.1.1 細(xì)胞試驗(yàn)。經(jīng)MDBK細(xì)胞盲傳至第2代，樣品接種后第2天可見有少量細(xì)胞聚堆的細(xì)胞病變（CPE)，至第3天主要表現(xiàn)為細(xì)胞聚堆、拉網(wǎng)等。對(duì)照組細(xì)胞正常（圖1)。

圖1 樣品感染MDBK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變（10×）

2.1.2 PCR試驗(yàn)。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增可得到約288 bp的特異性目的片段，陰性對(duì)照無(wú)條帶（圖2)。

圖2 BVDV PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.3 免疫熒光試驗(yàn)。在熒光顯微鏡下，將病毒液接種于MDBK細(xì)胞，加入BVDV特異性熒光抗體可見特異熒光。對(duì)照組細(xì)胞無(wú)可見熒光（圖3）。

圖3 免疫熒光檢測(cè)

2.2 IBRV分離鑒定

2.2.1 病毒分離。將無(wú)菌處理后的鼻拭子液接種于MDBK細(xì)胞，第1代即出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE)，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)、聚集成葡萄串樣。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞脫落、死亡。而對(duì)照孔無(wú)細(xì)胞病變（圖4）。

圖4 接種病料后的MDBK細(xì)胞（10×）

2.2.2 PCR試驗(yàn)。經(jīng)PCR反應(yīng)，可擴(kuò)增出一條大小為311 bp的特異性條帶，該條帶與預(yù)期片段大小相符合，如圖5所示。

圖5 IBRV PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.3 病毒形態(tài)。電鏡下觀察可見散在典型病毒顆粒及裸露的病毒粒子，見圖6。表面殼微體排列有序并呈放射狀，囊膜厚薄不勻稱，形態(tài)大小不一，且呈波浪狀，具有皰疹病毒獨(dú)有的形態(tài)特征即囊膜與衣殼間有一層不定形的物質(zhì)。

圖6 分離毒株電鏡負(fù)染形態(tài)學(xué)觀察

2.3 BPIV3分離鑒定

2.3.1 病毒分離。將無(wú)菌處理后的鼻拭子液接種于MDBK細(xì)胞，第1代即出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、補(bǔ)丁狀病變。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞崩解，培養(yǎng)液中有大量細(xì)胞碎片，為牛副流感病毒3型特征性CPE。而對(duì)照孔無(wú)細(xì)胞病變，見圖7。

圖7 接種病料后的MDBK細(xì)胞（10×）

2.3.2 PCR試驗(yàn)。經(jīng)PCR反應(yīng)，可擴(kuò)增出一條大小為425 bp的特異性條帶，該條帶與預(yù)期片段大小相符合。陰性對(duì)照未擴(kuò)增出目的片段，如圖8所示。

圖8 BPIV3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3.3 病毒形態(tài)。對(duì)分離毒株進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果觀察到有包膜的病毒離子，大小約為200 nm，與副黏病毒相符，結(jié)果見圖9。

圖9 分離毒株電鏡負(fù)染形態(tài)學(xué)觀察

2.4 牛支原體分離鑒定

2.4.1 形態(tài)特性。體視顯微鏡下觀察可見典型的“煎蛋狀”菌落，菌落中間厚且聚集、周邊為表面光滑的薄透明顆粒區(qū)，邊緣整齊，呈圓形，嵌入培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，可見β-溶血環(huán)（圖10A）；采用吉姆薩染色法對(duì)菌株進(jìn)行染色，100倍油鏡下觀察菌體形態(tài)，可見紫色球形顆粒，而且呈多種形態(tài)；采用Dienes染色法對(duì)菌株進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，牛支原體呈藍(lán)色，見圖10。

圖10 分離株形態(tài)特征

2.4.2 牛支原體PCR的鑒定。由圖11可見，在447 bp處出現(xiàn)了目的條帶，該條帶與預(yù)期片段大小相符合。陰性對(duì)照未擴(kuò)增出目的片段。

圖11 牛支原體PCR結(jié)果

2.4.3 生化特征。鑒定結(jié)果見表5。由表5可見，分離菌株與牛支原體模式株P(guān)G45生化指標(biāo)一致，分離株生化特性符合牛支原體的特性。

表5 分離牛支原體菌株的生化特征

3 結(jié)論

從內(nèi)蒙古自治區(qū)、山西省某肉牛場(chǎng)分離得到BVDV、IBRV、BPIV3和牛支原體病原，經(jīng)對(duì)其進(jìn)行全面系統(tǒng)的鑒定，均符合質(zhì)量要求。為了方便后續(xù)研究，筆者將其命名為 BVDV（HH03株）、IBRV(TY01株)、BPIV3（LH01 株）和牛支原體（CHF01 株）。

4 討論

BRDC俗稱運(yùn)輸熱，是由于病原與自然界、動(dòng)物相互作用導(dǎo)致的一種牛呼吸道疾病。BRDC嚴(yán)重威脅著牛群的健康，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失不可估量。近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)牛規(guī)模的擴(kuò)大和牛在不同省區(qū)來(lái)回調(diào)運(yùn)，母牛、種公牛以及胚胎、精液等遺傳物質(zhì)的大量引進(jìn)，使得一些疫病隨著動(dòng)物貿(mào)易而傳入我國(guó)，造成疫病流行，BRDC就是其中之一[12]。運(yùn)輸應(yīng)激造成的BRDC不斷遞增，死亡率呈上升趨勢(shì)，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的危害。BRDC主要由包括支原體、牛皰疹病毒Ⅰ型等一種或數(shù)種病原單獨(dú)或混合感染引起[13]。臨床出現(xiàn)牛肺炎及支氣管炎等癥狀，與應(yīng)激、環(huán)境改變、牧場(chǎng)管理和疫苗免疫有關(guān)[14-15]。

近年來(lái)，隨著內(nèi)蒙古自治區(qū)、山西省養(yǎng)殖業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和養(yǎng)牛業(yè)不斷發(fā)展，奶牛和黃牛的養(yǎng)殖數(shù)量呈擴(kuò)大趨勢(shì)，牛傳染性疾病也在不斷增加，對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)、山西省養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展造成巨大威脅。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該二省區(qū)牧場(chǎng)均發(fā)生過(guò)由多種病因混合感染引起的疾病，近年也有一些相關(guān)報(bào)道。例如，2013年童欽等[16]報(bào)道，內(nèi)蒙古自治區(qū)3個(gè)地區(qū) BVDV 血清陽(yáng)性率為58.35%。2011年，鄒世穎等[17]調(diào)查IBRV的血清陽(yáng)性率，河北省為28%、河南省為86%、內(nèi)蒙古自治區(qū)為58%。2022年，姜曉霞等[12]報(bào)道,BVDV、BRSV、IBRV和BPIV感染引起的牛呼吸道疾病的臨床癥狀相似，且有多種病毒共同感染現(xiàn)象。隨著細(xì)菌對(duì)自然環(huán)境的適應(yīng)能力逐漸增強(qiáng)，耐藥性已經(jīng)變得很普遍，不僅會(huì)降低藥效，而且會(huì)導(dǎo)致耐藥因子轉(zhuǎn)移到人的病原菌中，給人類相關(guān)疾病帶來(lái)“無(wú)藥可治”的嚴(yán)重局面。因此，給分離得到的病原進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)指導(dǎo)臨床規(guī)范用藥、降低耐藥菌株產(chǎn)生和傳播速度具有深遠(yuǎn)意義。該試驗(yàn)病例由不同種病原混合感染所引起，因此制定合理的牛場(chǎng)免疫程序，按期進(jìn)行疫苗接種非常關(guān)鍵。建議在牛呼吸道疾病高發(fā)期適當(dāng)使用可提高牛機(jī)體抵抗力的藥物，以降低牛呼吸道疾病綜合征的發(fā)生率[18]。同時(shí)，控制牛呼吸道疾病綜合征需要良好的環(huán)境作為基礎(chǔ)保障，不僅需要溫度適宜，還要保持通風(fēng)。

由于病毒和支原體是導(dǎo)致BRDC最重要的因素，因此用于防治病毒和支原體感染的疫苗對(duì)BRDC發(fā)揮了重要的作用?；钜呙缁驕缁钜呙缍寄軌驕p少因BRDC造成的臨床感染，降低經(jīng)濟(jì)損失，有效避免牛場(chǎng)呼吸道疾病的發(fā)生，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。