裴珍珍，王革生，宋光榮，蔡旭，杜勇，東瀟博

北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100078

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤，發(fā)病率約占所有惡性腦腫瘤的81%。而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最常見(jiàn)的膠質(zhì)瘤組織學(xué)類型，約占所有膠質(zhì)瘤的45%，其惡性程度和病死率極高，臨床治療效果差，5年存活率僅為5%［1］。鐵死亡是由DIXON等［2］提出的一種非凋亡、鐵依賴性、氧化性細(xì)胞死亡機(jī)制，與傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡和壞死不同，是鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化物積累的結(jié)果。鐵死亡在調(diào)節(jié)諸如淋巴細(xì)胞瘤、胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌等某些類型腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖方面起著重要作用。研究表明，鐵死亡可以殺死腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)［3］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一種被定義為超過(guò)200個(gè)核苷酸、缺乏蛋白質(zhì)編碼功能的轉(zhuǎn)錄本。lncRNA具有細(xì)胞和組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)，在癌癥中差異表達(dá)，并顯示出與臨床結(jié)果的明顯相關(guān)性。近年來(lái)，隨著對(duì)鐵死亡與腫瘤新療法的不斷研究，新的lncRNA功能不斷被揭示。然而，鐵死亡相關(guān)的lncRNA在GBM中的作用和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值仍不清楚。TCGA是美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）啟動(dòng)的一項(xiàng)公共資助項(xiàng)目，旨在利用創(chuàng)新的基因組測(cè)序分析技術(shù)加速對(duì)癌癥遺傳學(xué)的全面了解，幫助產(chǎn)生新的癌癥診斷、治療方法和預(yù)防策略［4-5］。而GBM是腫瘤基因組圖譜（TCGA）預(yù)實(shí)驗(yàn)研究的第一種癌癥，諸多鐵死亡相關(guān)的lncRNA在GBM的作用和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值未知。2021年7月－8月，我們以TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中GBM的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，借助R語(yǔ)言對(duì)基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，探索GBM中鐵死亡基因與lncRNA的共表達(dá)關(guān)系，篩選與GBM預(yù)后相關(guān)的鐵死亡相關(guān)lncRNA，為改善GBM患者預(yù)后、尋找新的治療方法提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源選取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中具備完整隨訪資料的GBM樣本，并下載GBM腫瘤組織和癌旁組織的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床資料。利用Perl對(duì)下載的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床資料分別進(jìn)行轉(zhuǎn)換和信息提取，以用于后續(xù)分析。數(shù)據(jù)下載截至2021年8月16日。通過(guò)文獻(xiàn)檢索和Ferrdb數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.zhounan.org/ferrdb）兩種方式獲取與鐵死亡相關(guān)的全部基因集。

1.2 GBM中鐵死亡差異表達(dá)基因的篩選通過(guò)R語(yǔ)言的“l(fā)imma”包對(duì)TCGA隊(duì)列中的腫瘤組織和癌旁組織做基因的差異表達(dá)分析，以|logFC|＞1和FDR＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過(guò)濾，篩選出與鐵死亡顯著相關(guān)的差異基因。

1.3 GBM中鐵死亡lncRNA的獲得及其與鐵死亡基因的共表達(dá)分析運(yùn)行“l(fā)imma”包計(jì)算鐵死亡基因和lncRNA之間表達(dá)的相關(guān)性，確定鐵死亡相關(guān)的lncRNA。P＜0.001，兩者之間存在共表達(dá)關(guān)系；cor（相關(guān)系數(shù)）＞0，兩者為正調(diào)控關(guān)系，cor＜0，兩者為負(fù)調(diào)控關(guān)系。借助Cytoscape軟件（version：3.8.2）構(gòu)建鐵死亡基因與鐵死亡lncRNA共表達(dá)關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 富集分析利用R語(yǔ)言的“clusterprofiler”包對(duì)篩選出的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的鐵死亡基因進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因百科全書(shū)（KEGG）分析；在線作圖軟件ImageGP繪制氣泡圖。GSEA軟件（Version：4.1.0）進(jìn)行基因集（GSEA）富集分析，研究高危組和低危組之間生物學(xué)功能的差異，定義富集分?jǐn)?shù)（ES）＞0的通路或功能在高風(fēng)險(xiǎn)組是活躍的，ES＜0的通路在低風(fēng)險(xiǎn)組是活躍的。其中，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05被認(rèn)為是顯著富集的功能或通路。

1.5 GBM預(yù)后模型的建立使用“survival”包對(duì)594例GBM患者鐵死亡相關(guān)lncRNA表達(dá)矩陣進(jìn)行單因素Cox回歸分析，評(píng)估每個(gè)lncRNA的預(yù)后價(jià)值，篩選出與GBM生存期相關(guān)的鐵死亡lncRNA（P＜0.01），為避免過(guò)度擬合帶來(lái)的干擾，采用LASSO Cox回歸降維方式過(guò)濾部分線性相關(guān)的特征，確定與GBM預(yù)后顯著相關(guān)的鐵死亡lncRNA，建立多基因預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。根據(jù)lncRNA表達(dá)量和相應(yīng)系數(shù)計(jì)算每個(gè)GBM患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)為截?cái)嘀担瑢⒒颊叻譃楦唢L(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。運(yùn)用R語(yǔ)言的“survminer”包和Kaplan-Meier生存分析對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行評(píng)價(jià)并繪制Kaplan-Meier生存曲線，評(píng)估高、低風(fēng)險(xiǎn)組樣本總體生存率的差異情況。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法基于R（Version：4.0.2）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBM中鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)差異分析通過(guò)文獻(xiàn)檢索和Ferrdb數(shù)據(jù)庫(kù)下載共獲得鐵死亡基因382個(gè)，其中246個(gè)鐵死亡基因在GBM表達(dá)。對(duì)該部分基因進(jìn)行差異分析，篩選出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的鐵死亡基因102個(gè)，其中，67個(gè)基因在腫瘤組上調(diào)，35個(gè)下調(diào)；對(duì)其進(jìn)行GO和KEGG富集分析，篩選差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能。差異基因顯著富集在細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激、氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平、細(xì)胞外刺激等生物學(xué)過(guò)程；細(xì)胞組成部分包括黏著斑、細(xì)胞-基底連接、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物等是差異基因富集最顯著的，分子功能富集結(jié)果主要集中在泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、鐵離子結(jié)合等。KEGG通路分析主要集中在癌癥中微小RNAs、自噬、鐵死亡、內(nèi)分泌抵抗等。GSEA富集分析顯示，高危組富集較顯著的通路包括細(xì)胞因子受體相互作用通路、溶酶體、谷胱甘肽代謝通路、半乳糖代謝通路、糖胺聚糖降解通路、氨基糖和核苷酸糖代謝通路等，低風(fēng)險(xiǎn)組未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的功能或通路。

2.2 GBM預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA及其與鐵死亡差異基因的共表達(dá)分析GBM中與鐵死亡相關(guān)的lncRNA 2 624個(gè)，通過(guò)單因素Cox分析共篩選出111個(gè)影響GBM預(yù)后的鐵死亡lncRNA，風(fēng)險(xiǎn)比（HR）＞1代表該lncRNA是影響預(yù)后的高危因素，反之為保護(hù)因素；69個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的鐵死亡基因與73個(gè)GBM預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA之間存在共表達(dá)關(guān)系，這73個(gè)lncRNA包含高、低風(fēng)險(xiǎn)，69個(gè)差異鐵死亡基因中，22個(gè)在GBM中下調(diào)，47個(gè)上調(diào)，表明在GBM中，鐵死亡基因與lncRNA之間具有復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，鐵死亡基因與鐵死亡lncRNA的共表達(dá)關(guān)系如圖1所示，中度值較高的鐵死亡基因與lncRNA見(jiàn)表1～2。

表1 共表達(dá)關(guān)系中度值≥8的鐵死亡基因

2.3 臨床預(yù)后模型的建立與驗(yàn)證以風(fēng)險(xiǎn)得分的中位數(shù)為截?cái)嘀?，GBM患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組79例和低風(fēng)險(xiǎn)組80例。Kaplan-Meier曲線分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)lncRNA特征的表達(dá)與較差的存活率相對(duì)應(yīng)（P＜0.001），低風(fēng)險(xiǎn)組生存時(shí)間大于高危組。

3 討論

GBM是世界衛(wèi)生組織Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤，其高度浸潤(rùn)性、遺傳異質(zhì)性以及血腦屏障（BBB）的保護(hù)為GBM的治療帶來(lái)了挑戰(zhàn)。GBM標(biāo)準(zhǔn)治療方法是手術(shù)切除，然后進(jìn)行放化療。然而，GBM細(xì)胞強(qiáng)大的DNA修復(fù)和自我更新能力，使GBM表現(xiàn)出對(duì)現(xiàn)有治療方法的不敏感性。在過(guò)去20年里，GBM患者生存期僅提高了10個(gè)月左右，腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率更接近100%［6-7］。美國(guó)的5年生存率僅達(dá)到7.2%［8］。改善GBM患者的生存預(yù)后、提高其生命質(zhì)量成為人類孜孜探索但迄今尚未攻克的難題。癌細(xì)胞的高鐵水平及其對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)的敏感性增加，使得鐵死亡成為腫瘤研究的熱點(diǎn)［9］。同時(shí)，高通量基因組學(xué)數(shù)據(jù)的發(fā)展為GBM患者帶來(lái)新希望，對(duì)GBM耐藥機(jī)制和腫瘤異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)，對(duì)基因突變特征和規(guī)律的探索，對(duì)有效治療靶點(diǎn)的篩選和藥物研發(fā)，將是開(kāi)發(fā)有效治療方法的關(guān)鍵，未來(lái)可能使GBM的總體治療效果獲得里程碑式突破。

表2 共表達(dá)關(guān)系中度值≥8的lncRNA

因此，本研究從GBM轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)著手，以鐵死亡基因?yàn)檩d體，探索GBM中鐵死亡基因與lncRNA的關(guān)系，獲取影響GBM預(yù)后的關(guān)鍵鐵死亡lncRNA。最終獲得了104個(gè)鐵死亡基因和2 624個(gè)鐵死亡相關(guān)的lncRNA，通過(guò)Cox分析確定了111個(gè)影響GBM預(yù)后的鐵死亡lncRNA，69個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的鐵死亡基因與73個(gè)GBM預(yù)后相關(guān)的lncRNA之間相互存在共表達(dá)關(guān)系；其中，AC004847.1、AC023043.3、LINC01127、LINC01574、LINC01943等是影響GBM預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)較高的lncRNA，鐵死亡基因SAT1、WIPI1、TNFAIP3、NCF2、ALOX5、FTL、NGB、ACSL4、GOT1、MAPK8、SLC2A12等與這些lncRNA在共表達(dá)關(guān)系中度值最高，調(diào)控關(guān)系較為復(fù)雜。

SAT1是本研究中與lncRNA共表達(dá)關(guān)系最復(fù)雜的鐵死亡基因之一，在GBM中表達(dá)上調(diào)。一項(xiàng)針對(duì)677個(gè)GBM患者腫瘤中SAT1評(píng)估，發(fā)現(xiàn)與低級(jí)別膠質(zhì)瘤相比，SAT1在高級(jí)別GBM中顯著過(guò)表達(dá)［10］。在針對(duì)GBM治療的研究中，Brett-Morris A證明抑制SAT1，可增加多形性GBM對(duì)放射的敏感性［11］。此后，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)過(guò)表達(dá)SAT1，再此印證了該結(jié)論［12］。這一發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)論相同：表達(dá)上調(diào)的SAT1與GBM的發(fā)生相關(guān)，提示SAT1可能是治療GBM的敏感靶點(diǎn)，啟示科研人員可借助基因治療甚至是藥物治療等方法去改變SAT1水平，增強(qiáng)GBM輻射反應(yīng)。

ACSL4、GOT1、MAPK8、SLC2A12等基因在GBM中表達(dá)下調(diào)。長(zhǎng)鏈酯酰輔酶A合成酶4（ACSL4）可參與磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等易氧化膜磷脂的合成，促進(jìn)多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，從而參與鐵死亡發(fā)生［13］。在宮頸癌、肺腺癌、三陰性乳腺癌等腫瘤中，高表達(dá)ACSL4均表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制［14-16］。本研究中，ACSL4在GBM中低表達(dá)，提示或許可通過(guò)高表達(dá)鐵死亡基因ACSL4，達(dá)到抑制GBM發(fā)展的效果，這可能是GBM治療的一個(gè)有意義的著手點(diǎn)。而同屬GBM中低表達(dá)基因GOT1，在肝癌、胰腺癌等消化系統(tǒng)腫瘤的研究中顯示相反的效果：沉默GOT1可抑制肝癌細(xì)胞的存活，減小裸鼠移植瘤的體積［17］。抑制GOT1表達(dá)可通過(guò)鐵死亡促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞死亡［18］。這一鐵死亡基因應(yīng)引起研究人員的關(guān)注，是否GOT1表達(dá)可在不同腫瘤中產(chǎn)生不同的結(jié)果，有待進(jìn)一步研究。

lncRNA是重要的表觀遺傳調(diào)控因子，在癌癥發(fā)生和惡性進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在GBM中，lncRNA的異常表達(dá)可能會(huì)改變基本的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，并導(dǎo)致GBM的惡性表型［19-20］。此外，特定lncRNA的差異表達(dá)也可能與GBM干細(xì)胞（GSC）的致瘤特性相關(guān)［21］。本 研 究 發(fā) 現(xiàn)，LINC01127、AC004847.1、LINC01574、LINC01943、AC023043.3、AL353796.1、AL133215.2、AC126407.1等lncRNA是影響GBM預(yù)后關(guān)鍵lncRNA，且與鐵死亡基因之間存在密切調(diào)控關(guān)系。其中，LINC01127、AC004847.1、LINC01574、LINC01943、AC023043.3等lncRNA是影響GBM的高?；?，而AL353796.1、AL133215.2、AC126407.1是GBM的保護(hù)基因。而諸如AC004847.1、LINC01574、AC023043.3、AL353796.1、AL133215.2等諸多l(xiāng)ncRNA尚未被研究；在GBM中，相關(guān)研究更少，甚至從未被研究，提示這些鐵死亡基因與lncRNA可能成為GBM研究的著手點(diǎn)，亟需更多關(guān)注。

本研究借助TCGA的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定了111個(gè)與鐵死亡相關(guān)的lncRNA。這是第一項(xiàng)針對(duì)GBM構(gòu)建的鐵死亡相關(guān)的lncRNA預(yù)后的研究，為臨床醫(yī)生和科研人員開(kāi)發(fā)了一種有效、實(shí)用的方法，可用于預(yù)測(cè)GBM患者的生存期并制定個(gè)性化治療方案。然而，本研究仍存在局限性，文中所涉及的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)僅來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，且對(duì)預(yù)后模型有效性的驗(yàn)證方法相對(duì)單一；檢測(cè)已鑒定的鐵死亡相關(guān)lncRNA在細(xì)胞系和臨床樣本中表達(dá)水平的相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)很少，部分鐵死亡lncRNA是之前未研究過(guò)的，其功能和機(jī)制有待進(jìn)一步體外和體內(nèi)研究，以期提供其作為治療GBM新候選靶點(diǎn)的潛力。