阿曼古麗·莫明，卡依賽爾·阿布都肉蘇力，雷泓，張琪，宋云林

1新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學中心，烏魯木齊 830054；2新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學研究中心

腸屏障主要由單層上皮細胞緊密連接組成的機械屏障、黏液層組成的化學屏障和固有層的免疫屏障構(gòu)成［1］。其中黏液層作為腸屏障中的第一道天然屏障，可將腸上皮細胞層與腸腔隔開，起到保護上皮細胞免受病原菌或其他毒素等的刺激和攻擊［2］，維持其完整性對于保護腸屏障功能尤其重要。黏蛋白2（MUC2）是黏液層的主要成分，其水平降低會引起黏液層變薄、通透性增加，促進病原菌大量遷移至上皮細胞，進而引起各種腸道疾?。?］。異常水平的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可激活JNK信號通路，形成TNF-α/JNK連接炎癥/應激信號的網(wǎng)絡(luò)，從而影響腸屏障功能［4］。然而，TNF-α、JNK信號通路及MUC2之間的相互影響和腸道發(fā)病機制的特征尚不明確。2022年3月—7月，我們探討了TNF-α對腸屏障功能的影響及作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)直腸腺癌（Caco-2）細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司，TNF-α購自義翹神州科技股份有限公司；PBS、DMEM高唐培養(yǎng)基和CCK8試劑盒均購自白鯊生物科技有限公司；胎牛血清和胰酶購自美國Gibco公司；兔抗MKK4、MEKK1、GAPDH兔抗多克隆抗體和羊抗兔Ⅱ抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；全蛋白提取試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司；RT-PCR試劑盒購自成都福際生物技術(shù)有限公司；引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組取Caco-2細胞，使用含20%胎牛血清、1%雙抗和DMEM高糖培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中，24 h換1次液，待其長滿用0.25%胰酶消化，2∶1傳代培養(yǎng)，待其穩(wěn)定生長，取對數(shù)生長期的細胞開展后續(xù)實驗。細胞穩(wěn)定生長后隨機分為四組，對照組給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，低劑量組給予TNF-α 100μg/L，中劑量組給予TNF-α 120 μg/L，高劑量組給予TNF-α 140μg/L，培養(yǎng)6 h后，收集細胞、上清及蛋白等。

1.3 細胞形態(tài)學改變倒置顯微鏡下觀察Caco-2細胞形態(tài)學改變。將細胞用胰酶消化，1 000 r/min離心5 min（離心半徑17.79 cm），棄上清，加1 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，并使用細胞計數(shù)板計數(shù)，以1×106/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，每組設(shè)3個復孔，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，使細胞貼壁并進入對數(shù)生長期進行干預，6 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS洗1次，使用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變。

1.4 細胞活力檢測采用CCK-8法。將穩(wěn)定生長的Caco-2細胞以1×104/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)5個復孔，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，使細胞貼壁并進入對數(shù)生長期進行干預，待6 h后，先棄去原有培養(yǎng)基，避光狀態(tài)下每孔加入100 μL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋10 μL CCK-8試劑，再放回細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，取出后用酶標儀檢測450 nm波長處光密度（OD）。細胞活力=［OD（加藥）-OD（空白）］/［OD（未加藥）-OD（空白）］×100%，計算每組細胞的細胞活力。

1.5 細胞MUC2 mRNA檢測采用RT-qPCR法。使用RNA提取試劑盒提取各組Caco-2細胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再使用實時熒光定量PCR儀進行PCR檢測。PCR反應條件：95℃3 min，95℃10 s、60℃30 s共40個循環(huán)，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCT進行分析，每個樣本重復3次。引物序列：GAPDH正向引物：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，反向 引物：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。MUC2正向引物：5'-CCTTCCTCTGTGCTTATCTGCTGTG-3'，反向引物：5'-GGTGTCTCCGTATGTGCCGTTG-3'。

1.6 JNK1和MKK4蛋白表達檢測采用Western blotting法。待干預時間到6 h，收集四組細胞并用預冷的PBS洗2次，用胰酶消化并以1 000 r/min離心5 min（離心半徑17.79 cm），再用PBS重懸細胞移至1.5 mL的EP管；根據(jù)全蛋白提取試劑盒的操作說明進行貼壁細胞蛋白提取，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整各組蛋白濃度至一致并使蛋白變性，上樣進行SDS-PAGE分離；電泳結(jié)束后用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，洗膜5次/5 min，牛奶封閉2 h，洗膜5次/5 min；隨后加入一抗，JNK1抗體（稀釋比例1∶1 500）、MKK4抗體（稀釋比例1∶1 000）和GAPDH抗體（稀釋比例1∶20 000），4℃冰箱過夜。次日，回收一抗，洗膜5次/5 min，孵育二抗HRP（稀釋比例1∶10 000），洗膜5次/5 min，配制ECL顯色液，進行曝光。

1.7 統(tǒng)計學方法采用Graphpad Prism 8.0.1軟件。計量資料符合正態(tài)分布以±s表示，多組數(shù)據(jù)間的比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TNF-α對Caco-2細胞形態(tài)的影響不同濃度的TNF-α分別干預Caco-2細胞6 h后，倒置顯微鏡觀察可見，對照組細胞形態(tài)無明顯變化，排列整齊，細胞間緊密連接清晰可見（圖1A）。不同濃度TNF-α刺激6 h后，細胞形態(tài)發(fā)生變化，由不均一多邊形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形，排列紊亂且細胞間緊密連接逐漸消失（圖1B-D）。

圖1 不同濃度TNF-α對Caco-2細胞形態(tài)的影響

2.2 不同 濃 度TNF-α對Caco-2細 胞 活 力 的 影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示，對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細胞活力分別為1.071±0.021、0.767±0.028、0.487±0.021、0.249±0.005；與對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組細胞活力下降（P均＜0.05）；低劑量組、中劑量組和高劑量組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；TNF-α對Caco-2細胞活性有抑制作用，存在劑量依賴性。

2.3 不同濃度TNF-α對Caco-2細胞中MUC2 mRNA表達的影響RT-qPCR結(jié)果顯示，對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組MUC2 mRNA相對表達量分別為1、0.451±0.071、0.159±0.040、0.109±0.001；與對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組MUC2 mRNA表達逐漸降低，高劑量組較明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

2.4 不同濃度TNF-α對Caco-2細胞中JNK1和MKK4蛋白表達的影響Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組JNK1蛋白表達逐漸升高，高劑量組較明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；與對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組MKK4蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 不同組中JNK1和MKK4蛋白表達比較（±s）

表1 不同組中JNK1和MKK4蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，#P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05。

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組JNK1蛋白表達0.444±0.038 0.861±0.040*0.929±0.036*3.501±0.068*#△MKK4蛋白表達1.038±0.056 1.280±0.032*1.297±0.043*4.808±0.111*#△

3 討論

腸屏障中黏液層是保護胃腸道的第一道防線，可有效防止腸上皮細胞層與腸腔內(nèi)的病原微生物及毒素等的直接接觸，同時在建立共生腸道菌群等方面扮演重要角色［5-6］。目前，雖然對黏液層的調(diào)節(jié)越來越受到科學界的關(guān)注，但因其是一個復雜的動態(tài)系統(tǒng)，對其仍知之甚少。MUC2是一種高度糖基化的分泌型黏蛋白，可從杯狀細胞被釋放后形成黏液層的基本骨架，因此是黏液層最主要的結(jié)構(gòu)和功能成分。其可以通過與腸內(nèi)的樹突狀細胞（DC）相互作用，調(diào)控免疫信號的傳遞來阻止腸道抗原的免疫原性，保護腸上皮細胞免遭腔內(nèi)細菌和食物抗原等的侵害，進而預防腸道炎癥的發(fā)生［7］。此外，MUC2的寡糖鏈結(jié)構(gòu)為腸道共生菌提供黏附點，有助于增強益生菌的定殖能力。然而，其合成與分泌的改變均會導致黏液層的變薄，促進病原微生物侵襲和黏附腸上皮細胞，造成腸屏障功能障礙，進而誘發(fā)一系列的腸源性疾病發(fā)生，如炎癥性腸病、結(jié)直腸癌、腸道感染（一系列由寄生蟲、病毒和細菌引起）、其他腸道疾?。ㄈ缛槊訛a、囊性纖維化）等［8］。因此，MUC2與許多重要的腸道病理密切相關(guān)，在保護腸屏障、調(diào)節(jié)菌群穩(wěn)態(tài)和預防腸道疾病等方面發(fā)揮重要作用［9］。

然而部分炎癥標志物，如TNF-α，可激活NF-κB通路并刺激MUC2的轉(zhuǎn)錄，而通過JNK通路起到抑制性作用［10］。TNF-α是炎癥反應中的重要介質(zhì)，主要由活化的巨噬細胞分泌，其主要有3種信號傳導途徑，分別是Caspase家族介導的細胞凋亡、銜接蛋白TRAF介導的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和JNK蛋白激酶的活化等［11］。一般情況下，生理水平的TNF-α具有免疫調(diào)節(jié)和抗感染等作用，但其異常水平和持續(xù)時間會破壞機體的免疫平衡，導致其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，擴大炎癥反應的水平，促進急性期蛋白表達，介導創(chuàng)傷后病理改變，引起多器官功能障礙綜合征（MODS）、IBD和CRC等［12-13］。有研究表明，持續(xù)高水平的TNF-α會引起急性結(jié)腸炎；在腸黏膜損傷過程中，TNF-α活化多形核粒細胞，使其產(chǎn)生大量的氧化劑和蛋白水解酶，最終導致腸屏障功能障礙［14］。與此同時，TNF-α誘導IL-1和IL-6的基因表達，活化磷脂酶A2，使得花生四烯酸分解，生成炎癥介質(zhì)，從而加重腸道的炎癥反應和缺血缺氧［5］。

c-Jun氨基末端蛋白激酶（JNK）信號通路作為絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）的一個亞家族，是一種細胞應激通路，參與調(diào)節(jié)多種細胞過程，包括細胞增殖、分化、存活、凋亡和炎癥等［15］。MAPK通路中的每一條通路均通過一系列的磷酸化反應激活，在JNK信號通路中，MAP3K家族上游成員磷酸化并激活MAP2K酶（MKK4和MKK7），進而磷酸化并激活JNK。促炎細胞因子和氧化應激等與腸屏障功能障礙相關(guān)的因素均會激活JNK信號通路，如異常的TNF-α信號激活JNK信號通路，形成連接炎癥/應激信號的網(wǎng)絡(luò)TNF-α/JNK，隨后，通過轉(zhuǎn)錄因子c-Jun在轉(zhuǎn)錄水平上對某基因的表達進行調(diào)節(jié)［16-17］。本研究中，使用不同濃度的TNF-α干預細胞，6 h后倒置顯微鏡觀察到細胞形態(tài)的變化。對照組細胞形態(tài)無明顯變化，排列整齊，細胞間緊密連接清晰可見；但用TNF-α處理的3組細胞形態(tài)發(fā)生變化，由不均一多邊形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形，排列紊亂且細胞間緊密連接逐漸消失。同時CCK-8檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，其他3組細胞活力下降，差異有統(tǒng)計學意義；表明異常水平的TNF-α對Caco-2細胞活性有抑制作用，并且存在劑量依賴性，隨著TNF-α濃度升高，對Caco-2細胞活性的抑制作用增強。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，其他3組的MUC2 mRNA表達逐漸降低，而Western blotting結(jié)果顯示，通路相關(guān)蛋白JNK1和MKK4表達逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學意義。表明TNF-α經(jīng)JNK信號通路參與了MUC2表達調(diào)控，而MUC2表達改變進一步導致腸屏障功能障礙，誘發(fā)一系列的腸源性疾病發(fā)生。

綜上所述，異常水平的TNF-α經(jīng)過JNK信號通路降低MUC2表達，造成腸屏障功能障礙；其機制可能是異常水平的TNF-α激活JNK信號通路，下調(diào)MUC2的表達，使得黏液層變薄、通透性增加，促進細菌大量遷移至腸上皮細胞，引起各種腸道疾病。本研究存在以下不足：①僅進行了細胞實驗，并未做到體內(nèi)-外實驗結(jié)合；②僅選擇了單一時間點對細胞進行干預處理，未做時效研究；③本研究中檢測通路相關(guān)蛋白時，僅從蛋白水平進行了檢測，未在基因水平對其表達進行驗證。今后尚需進一步研究完善結(jié)論。