沈美琴，施穎琦，陸飛，葛振明，錢俊波

南通市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 南通 226000

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。2020年我國(guó)胃癌新發(fā)病例47.9萬(wàn)例，死亡37.4萬(wàn)例，疾病負(fù)擔(dān)較重［1］。盡管近年來(lái)隨著內(nèi)鏡技術(shù)的普及，早期胃癌的檢出率逐年上升，但大多胃癌患者在診斷時(shí)已處于進(jìn)展期，即使接受根治性切除，預(yù)后仍較差［2］。因此還需進(jìn)一步了解胃癌發(fā)生、發(fā)展的驅(qū)動(dòng)因素。微小RNA（miRNA）通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展［3］。miR-143-3p是miRNA家族的一種高度保守成員。研究報(bào)道，miR-143-3p在肺癌、口腔鱗癌中異常表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展［4-5］。研究表明，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改變參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展［6］。LIM和Src同源結(jié)構(gòu)域3蛋白1（LASP1）是LIM（LIN11、ISL1、MEC3）蛋白亞家族的一種細(xì)胞骨架支架蛋白，參與維持肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定性［7］。目前，關(guān)于胃癌組織中miR-143-3p、LASP1表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究我們探討了胃癌組織中miR-143-3p、LASP1表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2017年1月—2018年1月本院收治的113例接受姑息性或根治性手術(shù)的胃癌患者，其中男52例、女61例，年齡43～78（60.35±6.35）歲；腫瘤部位：賁門或胃底39例、胃體20例、胃竇54例；腫瘤直徑：≥3 cm 61例、＜3 cm 52例；分化程度：低分化45例、中高分化68例；TNM分期［8］：Ⅰ期32例、Ⅱ期47例、Ⅲ期34例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為胃癌；初診且入院前未接受抗腫瘤治療；患者及家屬均知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤、全身感染、嚴(yán)重心、肝、腎功能損害；年齡＜18歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019KS095）。

1.2 胃癌組織中miR-143-3p、LASP1表達(dá)檢測(cè)收集術(shù)中切除部分癌組織和癌旁正常組織（距癌組織＞5 cm），TRIzol試劑盒（上海冠泰生物科技有限公司，編號(hào)：A2010A0401）提取組織總RNA，Nano-300微量分光光度計(jì)（杭州奧盛儀器有限公司）驗(yàn)證純度、濃度合格，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa Bio，編號(hào)：RR037B）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體積10μL：5×

PrimeScript RT Master Mix 2.0 μL、RNA 2.0 μL、

RNase Free H2O 6.0μL；反應(yīng)條件：37℃15 min、85℃5 s、4℃5 min反應(yīng)至結(jié)束后保存于-20℃冰箱中。以cDNA為模板按照SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（日本TaKaRa Bio，編號(hào)：RR902A）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-499a-5p正向引物：5＇-GCGCGCTACAGTATAGATGATG-3＇，反向引物：5＇-GCTGTCAACGATACGCTACG-3＇；內(nèi) 參U6正 向 引 物：5＇-GCGCGCGCGGGCAGGG-3＇，反向引物：5＇-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3＇；LASP1正向引物：5＇-TGCGGCAAGATCGTGTATCC-3＇，反向引物：5＇-GCAGTAGGGCTTCTTCTCGTAG-3＇；內(nèi)參GAPDH正向引物：5＇-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3＇，反向引物：5＇-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3＇。引物序列由上海新貝生物科技有限公司設(shè)計(jì)和合成。PCR反應(yīng)體積20μL：SYBR?Premix Ex Taq 10μL、正反向引物各0.8 μL、cDNA模板2.0 μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、RNase Free H2O 6.0 μL；反應(yīng)條件：95℃90 s、95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s，循環(huán)40次后收集Ct。采用2-ΔΔCt法計(jì)算組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪所有患者出院后通過(guò)門診或電話方式隨訪3年，隨訪截止到2021年1月，根據(jù)胃癌組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達(dá)的中位數(shù)分為高低表達(dá)者，統(tǒng)計(jì)不同表達(dá)的胃癌患者總生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS28.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s表示，比較采用t或F檢驗(yàn)；偏態(tài)分布以M（P25，P75）表示，比較采用U或H檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)性系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析；Kaplan-Meier法繪制胃癌患者生存曲線，組間生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達(dá)比較胃癌、癌旁組織中miR-143-3p相對(duì)表達(dá)量分別為1.42（1.21，1.66）、3.63（2.90，4.33），二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=12.531，P＜0.01）；胃癌、癌旁組織中LASP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.12（1.96，2.26）、1.18（1.03，1.32），二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=12.753，P＜0.01）。

2.2 胃癌組織中miR-143-3p與LASP1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)http：//www.targetscan.org/預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，LASP1的3'-非翻譯區(qū)1683至1689堿基處存在與miR-143-3p的結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。Spearman相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中miR-143-3p與LASP1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.810，P＜0.01）。

圖1 miR-143-3p與LASP1的結(jié)合位點(diǎn)示意圖

2.3 胃癌組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系胃癌組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達(dá)呈與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 胃癌組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 胃癌組織中miR-143-3p、LASP1 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系隨訪3年，113例胃癌患者中死亡35例，無(wú)失訪病例，總生存率為69.03%（78/113）。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，miR-143-3p高表達(dá)（≥1.42）者57例，3年總生存率為82.46%（47/57）；miR-143-3p低表達(dá)（＜1.42）者56例，3年總生存率為55.36%（31/56），miR-143-3p高表達(dá)者與低表達(dá)者3年總生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.735，P＜0.05）。LASP1 mRNA高表達(dá)（≥2.12）者55例，3年總生存率為58.18%（32/55）；LASP1 mRNA低表達(dá)（＜2.12）者58例，3年總生存率為79.31%（46/58），LASP1 mRNA高表達(dá)者與低表達(dá)者3年總生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.511，P＜0.05）。

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，我國(guó)70.8%的初診胃癌存在局部進(jìn)展［9］，晚期胃癌患者5年累積生存率不足30%［10］。近年來(lái)，以個(gè)體化、精準(zhǔn)化為特征的免疫和靶向治療雖然為進(jìn)展期胃癌的治療提供了新的方向，但尚未達(dá)到滿意效果。對(duì)部分進(jìn)展期胃癌和晚期胃癌療效仍然較差，有必要進(jìn)一步了解胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制，不僅有助于胃癌進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估，亦有助于開(kāi)放新的治療方案，對(duì)延長(zhǎng)胃癌患者生存期有重要意義。

非編碼RNA組成了生物體細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，廣泛參與腫瘤細(xì)胞各種生物學(xué)過(guò)程，miRNA是一種新發(fā)現(xiàn)的小分子非編碼RNA，通過(guò)與mRNA的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合而降解或抑制其翻譯而參與基因調(diào)控，在腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因功能［11-12］。miR-143-3p定位于人染色體5q32，是一種高度保守的miRNA。近年多項(xiàng)研究報(bào)道其與惡性腫瘤的關(guān)系，如郭亮等［13］研究報(bào)道，miR-143-3p在前列腺癌中低表達(dá)，能靶向三葉因子3抑制前列腺癌細(xì)胞增殖。WANG等［14］研究報(bào)道，miR-143-3p在腦轉(zhuǎn)移瘤中高表達(dá)，能靶向調(diào)控血管抑制素-1促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移瘤侵襲。這些研究提示，在不同腫瘤中miR-143-3p發(fā)揮不同作用。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-143-3p表達(dá)下調(diào)，提示miR-143-3p可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，其在胃癌中表達(dá)下調(diào)可能與miR-143-3p啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，胃癌組織中miR-143-3p表達(dá)下調(diào)、TNM分期增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-143-3p在胃癌中發(fā)揮抑癌基因作用，其低表達(dá)能促進(jìn)胃癌進(jìn)展，可能與miR-143-3p下調(diào)導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7上調(diào)有關(guān)。炎癥是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制之一，絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7是炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)，能被多種細(xì)胞因子刺激激活，促進(jìn)核因子-κB活化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［15-16］。FAN等［17］研究證實(shí)，胃癌中miR-143-3p能靶向下調(diào)絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7，抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，而抑制miR-143-3p能發(fā)揮相反作用。

肌動(dòng)蛋白是一類存在所有真核細(xì)胞中的微絲球狀多功能蛋白質(zhì)，能在細(xì)胞骨架和肌纖維中形如細(xì)絲，以維持細(xì)胞形態(tài)和保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，進(jìn)而參與諸多重要生命活動(dòng)。當(dāng)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架異常時(shí)可引起細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)紊亂，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖、遷移，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［6］。LIM是參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架形成的半胱氨酸富集蛋白，LASP1作為L(zhǎng)IM蛋白亞家族的一員，在維持肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，當(dāng)細(xì)胞骨架異常時(shí)可引起LASP1大量表達(dá)［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)，LASP1還存在于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子中，能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)基于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架與腫瘤的密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，LASP1表達(dá)上調(diào)與惡性腫瘤的增殖、遷移和侵襲有關(guān)［20-21］。近年研究發(fā)現(xiàn)，沉默LASP1能抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。然而鮮見(jiàn)研究報(bào)道LASP1對(duì)胃癌的臨床意義。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中LASP1表達(dá)上調(diào)，這與劉玉珍等［22］報(bào)道一致，提示LASP1可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，其在胃癌中表達(dá)上調(diào)可能與胃癌細(xì)胞異常增殖等破骨細(xì)胞骨架有關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，胃癌組織中LASP1表達(dá)上調(diào)、TNM分期增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示LASP1在胃癌中發(fā)揮促癌基因作用，其機(jī)制可能與LASP1表達(dá)上調(diào)反映胃癌細(xì)胞骨架異常，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖、遷移。近年研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LASP1表達(dá)能通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途徑抑制細(xì)胞增殖和遷移，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯［23-24］。本研究分析miR-143-3p、LASP1 mRNA與胃癌患者預(yù)后關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-143-3p高表達(dá)和LASP1 mRNA低表達(dá)胃癌患者生存率更高，說(shuō)明miR-143-3p和LASP1或可成為胃癌患者預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。本研究通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，LASP1的3'-非翻譯區(qū)與miR-143-3p的結(jié)合位點(diǎn)，相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-143-3p與LASP1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-143-3p與LASP1可能共同參與胃癌發(fā)生、發(fā)展。許鑫鑫等［25］通過(guò)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，上調(diào)miR-143-3p能靶向下調(diào)LASP1，抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究結(jié)果與之相符。

綜上所述，miR-143-3p在胃癌中低表達(dá)，LASP1 mRNA在胃癌中高表達(dá)，二者可能共同參與胃癌進(jìn)展，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，但本研究結(jié)果有待多中心進(jìn)一步研究證實(shí)。