肖洪秋，亓偉峰，郝 鵬，李 曈，高 存，司立博，孫振國，田 輝

（山東大學齊魯醫(yī)學院齊魯醫(yī)院胸外科，山東 濟南 250012）

肺癌是嚴重威脅人類健康的疾病之一，目前其發(fā)病率和死亡率已經(jīng)躍居所有癌癥之首[1]。隨著精準醫(yī)學的不斷發(fā)展，近年來肺癌的診斷與治療手段不斷完善，但其生長迅速、易轉(zhuǎn)移復發(fā)及快速耐藥的特點使得患者的總體預后仍較差，5 年生存率只有15%[2]。MiRNAs (microRNA) 是一類內(nèi)源性的長約19 ～24 個核苷酸的短鏈非編碼RNA，可通過多種方式參與基因表達的調(diào)控，進而參與細胞增殖、凋亡、遷移等過程，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[3]。肺癌組織中的MiRNA 具有穩(wěn)定的表達譜，其檢測方法也較mRNA 更加簡便，因此其作為新一代腫瘤分子生物標志物和靶向治療位點已成為近年來廣泛研究的熱點之一[4]。miR-21 是由位于17p23. 2 染色體區(qū)域的MIR21 轉(zhuǎn)錄的內(nèi)源性非編碼RNA[5]。成熟的miR-21 約由22 個核苷酸分子組成，其可通過與各種靶基因mRNA 的3′非翻譯區(qū)形成不完全堿基配對參與RNA 誘導的沉默復合體的形成，導致特定的mRNA的翻譯減少，下調(diào)靶基因的表達[3,5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21作為一種致癌的miRNA（oncomiR），在多種實體瘤中的表達顯著增加，如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎細胞癌等[6-8]。miR-21 在非小細胞肺癌（NSCLC）中可以通過改變各種靶分子（如3- 磷酸激酶、程序性蛋白死亡受體等）的表達來調(diào)節(jié)癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移、凋亡，降低遺傳穩(wěn)定性[9]。作為在肺癌中表達量最高的miRNAs 之一，盡管其潛在調(diào)節(jié)機制在很大程度上尚不清楚，但大量研究已經(jīng)證實其表達水平在預測NSCLC 的診斷和預后方面具有重要的意義。本文現(xiàn)就miR-21 在NSCLC 發(fā)生發(fā)展中作用的研究進展進行綜述。

1 miR-21 促進肺癌的作用及機制

miR-21 可通過影響細胞周期蛋白質(zhì)D1 和E1 的合成和活化來調(diào)控肺癌細胞增殖和細胞周期進程[10]，此外它還可以作用于PTEN，降低癌癥抑制因子PTEN的蛋白表達水平，通過PTEN/Caspase 3 抑制肺癌細胞的凋亡[11]。有研究指出，與普通PC-9 細胞相比，吉非替尼耐藥的PC-9 細胞中miR-21 的表達明顯上調(diào)，而PTEN 明顯下調(diào)。臨床試驗證實，高miR-21、低PTEN表達水平往往預示著NSCLC 患者對于酪氨酸激酶抑制劑的臨床反應較差，總體生存率較低[12]。在對細胞侵襲的作用方面，miR-21 可以抑制RECK 的表達，從而提高MMP-2/MMP-9 的水平，促進細胞侵襲[13]；還可以通過PTEN/Akt/GSK3β 級聯(lián)信號通路來調(diào)節(jié)E-cadherin、 vimentin、 snail、slug 、β-catenin 等侵襲標記物的表達，促進癌細胞的侵襲及間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。

有研究指出，miR-21 可直接作用于Tropomyosin 1(TPM1) 基因，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄，miR-21 的過度表達會降低TPM1 的蛋白水平，介導細胞遷移和侵襲[15]。在程序性細胞死亡4（PDCD4）基因的3'-UTR 中也存在潛在的miR-21 靶基因結(jié)合位點，miR-21 可降低人和小鼠細胞中Pdcd4 蛋白的水平。研究表明，通過上調(diào)PDCD4 的表達抑制miR-21 的表達可減少A549 NSCLC 細胞的增殖、遷移和侵襲[16]。miR-21 還會參與EGFR 介導的信號通路，激活EGFR 信號通路可上調(diào)miR-21 的表達，增強細胞耐藥[17]。

2 miR-21 在NSCLC 診斷中的應用

Yanaihara 等[18]率先利用基因芯片發(fā)現(xiàn)miR-21在肺癌組織中呈現(xiàn)高表達。后續(xù)的研究中，Tian等[19]通過qPCR 測定了204 對福爾馬林固定石蠟包埋NSCLC 組織樣本及其相應的鄰近正常組織中miRNA-21 的表達水平，發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比，NSCLC 組織中miR-21 的表達顯著增加。后來的多項研究均證實，相對于癌旁正常肺部組織，NSCLC 組織中miR-21 的表達異常增高，其表達水平與患者TNM分期以及轉(zhuǎn)移及預后情況相關[20-21]。

由于采血操作侵入性小，血液樣本的獲取較為容易，血清中不同miRNA 的表達水平與各種腫瘤預后之間的關系已成為許多研究的焦點。最近的研究表明，它們是預測各類癌癥發(fā)生和預后的有效生物標志物。有研究表明，肺癌患者血清中的miR-21 顯著高于健康人的水平，檢測血清中的miR-21 可作為肺癌早期非侵入性篩查的新策略[19,22]。Geng 等[23]發(fā)現(xiàn)，NSCLC 患者五種miRNA（miR-20a、miR-223、miR-21、miR-221和miR-145）的表達水平相對于健康志愿者明顯失調(diào)，隨后他們在126 例早期肺癌患者、42 例非腫瘤性肺部疾病患者和60 名健康志愿者的血漿樣本中檢測了這5 種miRNA 的表達情況，并分析了這種組合在NSCLC 早期診斷中的應用價值。結(jié)果顯示，單獨使用這5 種miRNA 診 斷 早 期NSCLC 的AUC 分 別 為0.89、0.94、0.77、0.92 和0.77。進一步的分析表明，血漿miR-20a、miR-223、miR-21 和miR-145 在吸煙者中比在非吸煙者中顯示出更好的診斷價值，而miR-155 可能更適合于非吸煙者人群。此外，它們在晚期患者和鱗癌亞組中的準確性會更高，能夠?qū)SCLC 與非腫瘤性疾病以及健康人區(qū)分開來。Zhao 等[24]從60名健康人中收集血清作為對照，使用實時熒光定量PCR 檢測80 例NSCLC 患者血清中miR-21 的相對表達水平，繪制受試者操作曲線分析血清中miR-21 最合適的臨界值和診斷值。結(jié)果證實，NSCLC 患者血清miR-21 的水平明顯高于健康人（P＜0.05）。在臨界值設為1.22 的情況下，ROC 曲線下的面積為0.812（95% 可信區(qū)間：0.736，0.888），敏感度為73.8%，特異度為71.7%。根據(jù)該臨界值區(qū)分NSCLC 患者為高表達組還是低表達組，進行Kaplan-Meier 分析表明，高miR-21 表達組的生存時間為23.1 個月，低miR-21 表達組的生存時間為34.3 個月，高miR-21表達組的生存時間顯著短于低miR-21 表達組。有研究表明，聯(lián)合檢測miR-21 和其他相關分子可以提高NSCLC 早期診斷的準確性和特異性。Tang 等[25]從62 名NSCLC 患者和60 名健康的吸煙者的血清中分離并鑒定出了3 種異常表達的miRNA（miR-21、miR-145和miR-155），隨后在34 名惡性腫瘤患者、30 名良性肺結(jié)節(jié)患者和32 名健康吸煙者中測試并驗證這3種miRNA 的表達水平及聯(lián)合診斷效率，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測miR-21、miR-145 和miR-155 的表達水平不僅可以區(qū)分肺癌患者和健康吸煙者（AUC：0.872，敏感度：76.5%，特異度：81.3%），對于肺癌患者與良性肺結(jié)節(jié)患者也有較好的分辨能力（AUC ：0.841，敏感度：76.5%，特異度：80.0%）?？傊@些研究表明，miR-21和其他分子的不同組合在NSCLC 中存在潛在診斷價值，血漿miR-21 的水平可能是NSCLC 患者早期診斷的重要補充。

痰液和肺泡灌洗液中miR-21 的表達水平也是NSCLC 的重要診斷依據(jù)。Kim 等[26]通過聯(lián)合檢測痰液中的5 種miRNA（miR-21、miR-143、miR-155、miR-210 和miR-372）發(fā)現(xiàn)，診斷早期NSCLC的敏感度和特異度分別高達67.8% 和90%。同時，這種miRNA 組合在肺泡灌洗液組的敏感度和特異度分別 高 達86.7% 和100%。Razzak 等[27]從21 例 早 期NSCLC 患者（Ⅰ期和Ⅱ期）、22 例晚期NSCLC 患者（Ⅲ期及以上）和10 例健康對照者中收集痰樣本，進一 步 分 析miR-21、miR-210 和miR-372 在NSCLC早期診斷中的潛在應用價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用這3 種miRNA 診斷早期NSCLC 的敏感度和特異度分別高達67% 和90%，對晚期NSCLC 的敏感度和特異度分別高達64% 和100%。因此，優(yōu)化痰樣本中特異性miRNA 的組合，以實現(xiàn)早期診斷NSCLC 將是未來研究的一個重點。

3 miR-21 的表達水平可以預測NSCLC 的預后情況

除了協(xié)助肺癌的診斷以外，miR-21 的表達情況還可以提示NSCLC 的預后情況。上文提到的Tian等[19]的研究不僅發(fā)現(xiàn)NSCLC 組織中miR-21 的表達顯著增加，還進一步分析了miR-21 在晚期NSCLC（Ⅱb ～Ⅲa 期）組織中的表達遠高于早期NSCLC（Ⅰa ～Ⅱa 期）組織中的表達。有研究指出，miR-21高表達的患者也有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，但是miR-21表達水平與腫瘤大小之間沒有相關性。Kaplan-Meier生存分析進一步證實，與miR-21 低表達的NSCLC患者相比，miR-21 高表達的NSCLC 患者的總生存時間（OS）和無進展生存時間（PFS）顯著減少。因此，miR-21 表達增高或許是NSCLC 患者OS 降低的一個新的獨立預后因素，癌組織內(nèi)miRNA-21 的表達水平可以預測NSCLC 的預后。此外，miR-21 的表達也可能是伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者的潛在預后標志物。Stenvold 等[28]在NSCLC Ⅰ期至Ⅲa 期患者中收集了335 個腫瘤組織，并使用原位雜交法測定了腫瘤細胞和腫瘤間質(zhì)細胞中的miR-21 水平。出乎意料的是，研究結(jié)果表明，腫瘤細胞中miR-21 表達量的增高是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的積極預后指標，而基底細胞中miR-21 的高表達是他們的不良預后指標。這項研究的結(jié)果與其他研究的結(jié)果不一致，因此，需要進一步的研究來闡明這種差異的原因。

鑒于在NSCLC 患者的預后中，血清miR-21 水平與癌組織中miR-21 水平的影響一致[29]，結(jié)合血清miR-21 的表達水平進行相關評估極有可能成為預測NSCLC 預后的一個重要方向。Wang 等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-21 高表達的NSCLC 患者的3 年生存率明顯低于血清miR-21 低表達的NSCLC 患者，且NSCLC 患者血清miR-21 水平的升高與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關?；贜SCLC 患者OS 的多元邏輯回歸分析顯示，血清miR-21 水平是該疾病的獨立預后因素（HR ：2.01）。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，癌細胞分泌的外泌體在各種腫瘤的診斷和預后判斷中具有潛在應用價值[30]。外泌體是一種細胞外囊泡，直徑為30 ～100nm，廣泛存在于體液中，其內(nèi)部可攜帶多種生物分子，包括蛋白質(zhì)、RNA、DNA 和脂質(zhì)等，對細胞通訊及細胞活動的調(diào)控起著重要作用[31]。Munagala等[32]最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的miR-21 水平也可能是肺癌復發(fā)的標志。他們建立了原發(fā)性和復發(fā)性肺癌的裸鼠模型，并分別檢測了腫瘤中和血清外泌體中miRNA 的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)性腫瘤相比，復發(fā)性腫瘤中miR-21 和miR-155 兩種miRNA的表達顯著上調(diào)，這些miRNA 在復發(fā)性腫瘤動物的血清外泌體中的表達也明顯增加。該研究表明，外泌體中的miRNA 信號可能提示肺癌的預后與復發(fā)，在作為肺癌的生物標志物方面有著巨大潛力。

4 miR-21 在臨床治療中的應用前景

基于miRNA 在基因表達調(diào)節(jié)以及與患者臨床預后相關性的證據(jù)越來越確鑿，上調(diào)或下調(diào)特定miRNA 的表達水平可能是治療癌癥的一個有希望的方法。一般情況下，靶向miRNA 的療法有兩種方法，一種是miRNA 替代療法，對于在腫瘤中表達下調(diào)的miRNA，可以使用與miRNA 結(jié)構相似的mimics，模擬miRNA 的功能，恢復腫瘤抑制基因的功能；另一種是miRNA 拮抗劑，對于在腫瘤中表達上調(diào)的miRNA，利用反義技術合成的靶向性的反義寡核苷酸可以與它們結(jié)合形成互補的RNA，從而被RNA酶分解，可阻斷其功能，增加該種miRNA 靶向的mRNA的翻譯[33]。然而，到目前為止，這兩種方法在臨床上的應用都非常有限，大多數(shù)相關研究都是在體外進行的。由于miR-21 在肺癌中的表達上調(diào)，應用miR-21反義寡核苷酸治療肺癌已成為該病治療的新希望[34-35]。

5 總結(jié)

miRNA 在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，miR-21 已經(jīng)被證實可通過多種方式參與肺癌和其他惡性腫瘤的發(fā)生。miR-21 相關的診斷與預后信息對于臨床決策有著重要的作用，靶向miR-21 的治療可能會成為肺癌治療的新方向。筆者認為，隨著未來對miRNA 研究的深入，miRNA 將會越來越多地應用于相關疾病的診治中。