李傳博，魯明杰，張慶芳，林禹彤，竇少華

（大連大學(xué)生命健康學(xué)院，遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一種氧化還原酶[1]，以分子氧為電子受體，與過氧化氫酶形成氧化還原系統(tǒng)，專一性催化β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸[2-4]。GOD的催化效率和反應(yīng)速率通常受各種因素影響，如酸度和堿度、溫度、氧氣和動力學(xué)參數(shù)[5-7]。GOD作為一種高特異性氧化還原酶，在食品領(lǐng)域發(fā)揮著極其重要的作用[8-11]。例如GOD常用于保鮮劑。馬清河等[12]發(fā)現(xiàn)，GOD對鮮蝦具有抗褐變保鮮作用，冷藏（-18 ℃）12個月后仍能保持二級鮮度。GOD作為保鮮劑抑制鮮蝦褐變的現(xiàn)象為是否可以通過設(shè)計不同帶電短肽影響酶的催化作用提供了新的思路。

早在2000年，李菲等[13]便基于表面靜電互補的方法建立短肽抑制劑與酶識別的模式。陳瑞華[14]發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶、蛋白酶K和α-糜蛋白酶水解桿菌肽底物時，Zeta電位絕對值增加，并且酶抑制劑的添加增加了胰蛋白酶和蛋白酶K的Zeta電位值，負(fù)電荷的增加會抑制酶與底物的酶促反應(yīng)。由此可知，添加具有不同電荷性質(zhì)蛋白質(zhì)可以直接影響酶促反應(yīng)進程。劉榮娜[15]研究了不同帶電蛋白質(zhì)對酶促反應(yīng)的影響表明，酶活力的改變與不同帶電蛋白質(zhì)濃度呈正相關(guān)，并提出加入與酶帶同種電荷的蛋白質(zhì)，并且當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與酶形成一定距離時會對酶本身產(chǎn)生微弱的斥力，使酶在酶促反應(yīng)中更好地發(fā)揮催化活性。本研究將PF1、PF2兩條短肽的基因在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21中克隆表達，產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA純化后加入GOD酶促反應(yīng)，并對GOD活力及Zeta電位進行檢測，旨在為今后研究肽鏈PF1、PF2對GOD之間相互作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)，可以為酶的食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)應(yīng)用等研究提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E. coliBL21（DE3）用于pET系列載體的誘導(dǎo)表達，質(zhì)粒pET-30a（+）為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)的表達載體，均保藏于遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心。

Pyrobest DNA Polymerse、NdeI、Hind III限制性內(nèi)切酶、T4 DNA ligase、Kan、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification試劑盒 TaKaRa（大連）有限公司；BM5000 DNA ladder 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DNA Marker DL2000 北京全式金生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物 生工生物工程（上海）股份有限公司；Ni-NTA His·Bind Resins 中國科學(xué)院過程工程研究所；蛋白定量試劑盒 美國Bio-Rad公司；正己烷（色譜純） 德國Meker公司；GF254薄層色譜硅膠 青島海洋化工廠；所有分離用有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基及溶液：LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基、STE緩沖液、TBST（Tris-HCl+Tween）緩沖液、PBST（PBS+Tween）緩沖液、TE（Tris-EDTA）緩沖液、TAE（Trisacetate-EDTA）緩沖液等均參考《精編分子生物學(xué)實驗指南》[16]和《分子克隆實驗指南》[17]附錄部分以及相關(guān)文獻[18]配制。

1.2 儀器與設(shè)備

MilliQ plus超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；CR-22E高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；LTI-700低溫恒溫培養(yǎng)箱 上海愛朗儀器有限公司；JY99-IIIBN超聲波連續(xù)流細(xì)胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；PowerPac 300蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；FE20/EL20 pH計 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 人工設(shè)計肽鏈PF1、PF2基因序列的獲得

根據(jù)E. coliBL21（DE3）的密碼子偏好性[19]，人工設(shè)計并合成了2 條帶有不同電荷肽鏈基因PF1、PF2，等電點分別為12.01、3.18，基因全長均為309 bp。

1.3.2 引物的設(shè)計與合成

采用primer 5.0軟件對PF1、PF2序列進行比對分析后，對照pET-30a（+）載體上的多克隆酶切位點，設(shè)計基因的特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物PF1-F、PF1-R和PF2-F、PF2-R[20]，見表1。引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3.3 構(gòu)建重組表達載體

PCR體系50 μL，用正向引物PF1-F、PF2-F和反向引物PF1-R、PF2-R進行擴增[21]。通過1 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的條帶。PF1、PF2通過T4 DNA于4 ℃連接反應(yīng)過夜至pET-30a（+）載體。然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E. coliBL21（DE3），用TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification試劑盒提取陽性克隆。PCR擴增該基因，PCR產(chǎn)物通過NdeI和HindIII雙酶切鑒定。

1.3.4 人工設(shè)計短肽PF1、PF2在E. coliBL21（DE3）的誘導(dǎo)表達

將測序正確的重組菌命名為pET-30a（+）-PF1/BL21、pET-30a（+）-PF2/BL21。轉(zhuǎn)化子接入5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下過夜培養(yǎng)。次日，取1 mL過夜菌接種至100 mL新LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600nm為0.6～0.8左右，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，pET-30a（+）-PF1/BL21與pET-30a（+）-PF2/BL21分別以誘導(dǎo)15 ℃、160 r/min培養(yǎng)16 h和37 ℃、160 r/min培養(yǎng)4 h[22]。離心收集菌體，并用Binding Buffer洗滌3次。加入5 mL Binding Buffer重懸細(xì)胞，超聲波破碎后（開5 s、關(guān)4 s，時間40 min），4 ℃、12 000 r/min離心30 min，舍掉沉淀獲得粗蛋白溶液[23]。

1.3.5 Ni-NTA純化粗蛋白溶液

由pET-30a（+）載體表達的靶蛋白具有6個組氨酸的蛋白質(zhì)標(biāo)簽，組氨酸可以與Ni2+鰲合，從而使帶有組氨酸標(biāo)簽的靶蛋白質(zhì)與Ni-NTA純化介質(zhì)結(jié)合。誘導(dǎo)表達后的粗酶液上樣Ni-NTA柱，并用40 mmol/L咪唑緩沖液洗柱子，直到考馬斯亮藍藍色不變?yōu)橹埂Ｈ∩鲜霾襟E中收集的100 μL溶液，加入100 μL 2×蛋白電泳上樣緩沖液；沸水煮10 min，14 000 r/min離心5 min，取上清液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測[24-26]。

1.3.6 純化后蛋白PF1和PF2 Zeta電位檢測

開啟Zeta電位儀，設(shè)置儀器溫度為35 ℃，預(yù)熱30 min。將1.4 mL 0.004 mg/mL的GOD溶液加入到Zeta電位樣品池中，測定Zeta電位。分別將1.4 mL 1 mg/mL的PF1和PF2溶液加入到Zeta電位樣品池中，測定Zeta電位。分別將0.7 mL 2 mg/mL的PF1和PF2溶液加入到0.7 mL 0.008 mg/mL的GOD溶液中處理5 min，測定GOD Zeta電位。

1.3.7 純化后蛋白PF1和PF2對GOD活力影響

分別將1 mg/mL的肽鏈PF1和PF2溶液加入到0.1 mL 0.004 mg/mL的GOD溶液中處理5 min，測定酶活力，將0.1 mL磷酸緩沖液同樣加入到0.1 mL 0.004 mg/mL的GOD溶液中處理5 min作為對照，測定酶活力。在實驗溫度和pH值下，60 s內(nèi)將1.0 μmol催化葡萄糖氧化成為H2O2和葡萄糖酸所需要的GOD量定義為一個酶活力單位[3]。

GOD活力測定：酶標(biāo)儀設(shè)定為500 nm波長處連續(xù)進行300次吸光度測定，每秒測定一次。分別在試管中加入2.5 mL鄰聯(lián)茴香胺緩沖液、0.3 mL葡萄糖溶液和0.1 mL過氧化氫酶溶液并混勻，放置水浴鍋中給定溫度水浴5 min。將0.1 mL GOD溶液和0.1 mL磷酸緩沖液迅速加入混合溶液中，在20 s內(nèi)分別將3個0.31 mL混合液加入到96 孔板中測定吸光度，根據(jù)下式計算GOD活力：

式中：ΔA500nm為每秒吸光度的降低值；N為酶液的稀釋倍數(shù)；Vt為樣品反應(yīng)的總體積/mL；11.3為消光系數(shù)（L/mol）；Vs為稀釋后酶液加入體積/mL；t為反應(yīng)時間/min；m為GOD樣品質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工設(shè)計肽鏈PF1、PF2基因的PCR擴增

利用特異性引物PF1-F、PF1-R和PF2-F、PF2-R，使用PF1、PF2基因DNA作為模板擴增目的片段，大小約為309 bp（圖1），與預(yù)計的片段大小相近。切膠回收并測序，確定為目的基因的DNA片段。

圖1 PF1（A）、PF2（B）基因片段的電泳檢測Fig. 1 Argarose gel electrophoresis of the conserved region fragments of PF1 (A) and PF2 (B)

2.2 重組質(zhì)粒pET-30a（+）-PF1、pET-30a（+）-PF2的構(gòu)建及鑒定

2.2.1PF1、PF2基因PCR產(chǎn)物雙酶切

用NdeI/Hind III雙酶切PF1、PF2基因PCR產(chǎn)物，取1 μL產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，圖2結(jié)果顯示，在750 bp附近出現(xiàn)特異性條帶與理論設(shè)計值相符。

圖2 PF1和PF2基因PCR產(chǎn)物雙酶切的電泳檢測Fig. 2 Detection of PF1 and PF2 PCR products by double enzyme digestion

2.2.2 原核表達質(zhì)粒pET-30a（+）雙酶切

用NdeI/Hind III雙酶切原核表達載體pET-30a（+），取1 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。質(zhì)粒pET-30a（+）雙酶切產(chǎn)物條帶單一，且在5 000～6 000 bp之間，符合預(yù)期。

圖3 原核表達質(zhì)粒pET-30a（+）雙酶切Fig. 3 Identification of prokaryotic expression plasmid pET-30a(+) by double enzyme digestion

2.2.3 菌落PCR篩選陽性克隆

從pET-30a（+）-PF1/BL21、pET-30a（+）-PF2/BL21轉(zhuǎn)化的平板上分別隨機挑取17個白斑直接作為模板進行PCR擴增（圖4），pET-30a（+）-PF1/BL21經(jīng)電泳分析發(fā)現(xiàn)8號、9號和12號PCR產(chǎn)物與目的基因（309 bp）大小一致，表明8號、9號和12號成功將靶基因與表達質(zhì)粒pET-30a（+）相連。pET-30a（+）-PF2/BL21經(jīng)電泳分析發(fā)現(xiàn)4號、9號和15號PCR產(chǎn)物與目的基因（309 bp）大小一致，表明4號、9號和15號成功將靶基因成功連接到表達質(zhì)粒pET-30a（+）上。

圖4 菌落PCR驗證PF1（A）、PF2（B）基因的電泳檢測Fig. 4 Agarose gel electrophoresis analysis of positive clones of PF1 (A) and PF2 (B) selected by colony PCR

2.2.4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定和測序鑒定

通過質(zhì)粒提取試劑盒提取pET-30a（+）-PF1、pET-30a（+）-PF2重組質(zhì)粒，用限制性核酸內(nèi)切酶NdeI/Hind III進行雙酶切，酶解產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯觯亟M質(zhì)粒pET-30a（+）-PF1、pET-30a（+）-PF2酶切產(chǎn)物片段大小分別約為309 bp和5 422 bp，即表達的pET-30a（+）-PF1、pET-30a（+）-PF2和原核表達載體pET-30a（+）。說明PF1、PF2基因已成功亞克隆至表達載體pET-30a（+）中。

圖5 pET-30a（+）-PF1（A）、pET-30a（+）-PF2（B）經(jīng)Nde I/Hind III酶切產(chǎn)物Fig. 5 Agarose gel electrophoresis analysis of pET-30a(+)-PF1 (A) and pET-30a(+)-PF2 (B) digested with Nde I/Hind III

2.3 pET-30a（+）-PF1、pET-30a（+）-PF2重組質(zhì)粒在E. coli BL21（DE3）中的表達

如圖6所示，泳道4、5、7、8、10、11約11 kDa蛋白帶與PF1的理論分子質(zhì)量（11.1 kDa）一致，表明IPTG成功誘導(dǎo)蛋白表達。肽鏈PF1在15 ℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)16 h表達較好。與泳道3、6、9未誘導(dǎo)的陰性對照相比，重組菌pET-30a（+）-PF1/BL21在約11 kDa處表現(xiàn)出特異性蛋白帶，重組蛋白成功表達，且可溶性較好。

圖6 重組pET-30a（+）-PF1的誘導(dǎo)表達SDS-PAGEFig. 6 SDS-PAGE analysis of PF1 expressed in BL21(DE3)

以His抗體為一抗，Western Blot分析鑒定表達產(chǎn)物免疫反應(yīng)性。由圖7可以看出，誘導(dǎo)產(chǎn)物在相同位置具有單個特異性條帶。PF1蛋白分子大小與SDS-PAGE鑒定大小一致。

圖7 重組質(zhì)粒pET-30a（+）-PF1的Western Blot鑒定Fig. 7 Western blot analysis of PF1 expressed in BL21(DE3)

如圖8所示，泳道4、5、7、8約11 kDa蛋白帶與PF2的理論分子質(zhì)量（11.1 kDa）一致，表明IPTG成功誘導(dǎo)表達蛋白表達。肽鏈PF2在37 ℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h表達較好。與泳道3、6、9未誘導(dǎo)的陰性對照相比重組菌pET-30a（+）-PF2/BL21在約11 kDa處表現(xiàn)出特異性蛋白帶，重組蛋白成功表達，且可溶性較好。

圖8 重組pET-30a（+）-PF2的誘導(dǎo)表達Fig. 8 SDS-PAGE analysis of PF2 expressed in BL21(DE3)

以His抗體為一抗，Western Blot分析鑒定表達產(chǎn)物免疫反應(yīng)性。由圖9可以看出，誘導(dǎo)產(chǎn)物在相同位置具有單個特異性條帶。PF2蛋白分子大小與SDS-PAGE鑒定大小一致。

圖9 重組質(zhì)粒pET-30a（+）-PF2的Western Blot鑒定Fig. 9 Western blot analysis of PF2 expressed in BL21(DE3)

2.4 pET-30a（+）-PF1、pET-30a（+）-PF2重組質(zhì)粒Ni-NTA純化

通過Ni-NTA親和層析柱純化PF1、PF2，SDS-PAGE檢測洗脫的收集液，如圖10所示。目標(biāo)蛋白主要被300 mmol/L咪唑溶液洗脫下來，且洗脫液中無雜蛋白。

圖10 重組pET-30a（+）-PF1與重組pET-30a（+）-PF2的純化Fig. 10 SDS-PAGE analysis of purifeid recombinant pET-30a(+)-PF1 and pET-30a(+)-PF2

2.5 純化后蛋白PF1和PF2對GOD Zeta電位檢測

由表2可知，純化后蛋白PF1表面Zeta電位為-18.16 mV，帶負(fù)電荷，而PF2表面Zeta電位為10.32 mV，帶正電荷。且經(jīng)過PF1處理過的GOD電位由-14.60 mV下降至-16.07 mV，PF2處理過得GOD電位由-14.60 mV上升至-9.26 mV。

表2 純化后蛋白PF1和PF2對GOD Zeta電位檢測Table 2 Effect of purified proteins PF1 and PF2 on GOD zeta potential

2.6 純化后蛋白PF1和PF2對GOD活力影響

由表3可知，使用純化后帶負(fù)電荷蛋白PF1處理后GOD活力提高了8.34%，帶正電荷蛋白PF2處理后GOD活力降低了6.88%。證明本研究生物方法合成的帶不同電荷蛋白對GOD活力同樣有激活和抑制作用。

表3 純化后蛋白PF1和PF2對GOD活力影響Table 3 Effect of purified proteins PF1 and PF2 on the activity of GOD

3 結(jié) 論

人工設(shè)計并合成了2 條肽鏈PF1、PF2，基因全長309 bp，以ATG作為起始密碼子開始，以TGA作為終止密碼子結(jié)束，編碼93個氨基酸肽鏈。將其擴增至pET-30a（+）載體中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30a（+）-PF1和pET-30a（+）-PF2。隨后將酶切鑒定正確的表達質(zhì)粒pET-30a（+）-PF1和pET-30a（+）-PF2轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞E. coliBL21（DE3）中，0.1 mmol/L IPTG大量誘導(dǎo)表達收集菌體細(xì)胞。通過超聲破碎菌體細(xì)胞以獲得粗酶溶液，利用重組質(zhì)粒pET-30a（+）-PF1和pET-30a（+）-PF2上C端融合6個組氨酸的蛋白質(zhì)標(biāo)簽，經(jīng)Ni-NTA純化分離純化得到純蛋白。SDS-PAGE與Western Blot分析表明：表達出的靶蛋白分子質(zhì)量為11.1 kDa，這與預(yù)估大小一致。PF1和PF2人工設(shè)計蛋白的pI值分別為12.01、3.18，且表達產(chǎn)物以可溶性蛋白存在于細(xì)胞漿中。以上結(jié)果都指向同一結(jié)論：人工設(shè)計肽鏈基因PF1、PF2在E. coliBL21（DE3）中得到成功表達。

純化后的蛋白PF1和PF2在pH 5.5的緩沖液中測定Zeta電位后發(fā)現(xiàn)，PF1 Zeta電位為-18.16 mV，帶負(fù)電；PF2 Zeta電位為10.32 mV，帶正電。通過使用純化后的蛋白PF1和PF2處理GOD后，GOD活力出現(xiàn)了明顯的變化，今后可以設(shè)計并合成更多的肽鏈對GOD進行處理，檢測其對GOD活力的影響，并檢測肽鏈與GOD的相互作用。短肽PF1和PF2的基因克隆及表達為后續(xù)將短肽PF1和PF2應(yīng)用于大規(guī)模食品或工業(yè)化生產(chǎn)新型酶激活劑打下堅實基礎(chǔ)。