劉英杰,黃 鈞,秦 輝,張宿義,董 異,王 超,王小軍,周榮清,2,*
(1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院,四川 成都 610065;2.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,四川 瀘州 646699;3.瀘州老窖股份有限公司,四川 瀘州 646699)
傳統(tǒng)發(fā)酵食品不僅生產(chǎn)歷史悠久,也是食品及現(xiàn)代生物產(chǎn)業(yè)的重要組成部分,且白酒產(chǎn)業(yè)與民族生物產(chǎn)業(yè)息息相關(guān)[1-2]。大曲是傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)過程中必需的發(fā)酵劑、酶制劑與獨特的原料,其微生物群落的多樣性對基酒的品質(zhì)和風味影響顯著[3]。大曲因原料、過程調(diào)控參數(shù)不同,主要分為濃、醬、清3種主要類型,在白酒的生產(chǎn)中,賦予其獨特工藝和風味特點。這些大曲生產(chǎn)工藝的共同特點是自然接種、生料發(fā)酵、控溫調(diào)濕定向馴化和調(diào)控其群落與代謝[4]。類似眾多的傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn),棲息在環(huán)境中的微生物與大曲群落多樣性和演替密切相關(guān)[5-6]。大曲坯是天然培養(yǎng)基[3],原料、生產(chǎn)環(huán)境及設(shè)施等微生物群落結(jié)構(gòu)與大曲的密切相關(guān)[7-9],且影響大曲發(fā)酵過程。如棲息在空氣和發(fā)酵設(shè)施的耐酸乳桿菌(Lactobacillus acetotolerans)是清香大曲酒發(fā)酵的主要菌源[10-11],從釀造車間和曲房空氣中分離到了產(chǎn)特征風味的功能酵母和產(chǎn)酶細菌[12-13],大曲生產(chǎn)環(huán)境空氣中棲息的微生物與大曲細菌群落的變遷關(guān)系密切[14-15]。生產(chǎn)環(huán)境與大曲間優(yōu)勢菌群相互交換,驅(qū)動大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的演替[16-18],營造了獨特的微生態(tài),是生產(chǎn)高質(zhì)量大曲的重要基礎(chǔ)。然而,大曲微生物群落來源和形成機制的研究仍然較少,且生產(chǎn)環(huán)境與成曲間群落互作關(guān)系迄今鮮見報道。
本研究以同企業(yè)使用周期差異顯著的新老制曲基地及生產(chǎn)的大曲為對象,應(yīng)用高通量測序技術(shù)探討生產(chǎn)環(huán)境(空氣、設(shè)施)、原料與大曲微生物群落結(jié)構(gòu)特點,通過溯源分析解析其微生物菌群對大曲群落組成的貢獻,旨在揭示濃香型大曲微生物群落的來源,為解析大曲群落定向馴化和驅(qū)動作用提供一定的參考依據(jù)。
Fast DNA SPIN基因提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司;Q5 DNA高保真聚合酶 美國New England Biolabs公司;瓊脂糖、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液TAE 美國Invitrogen公司;Marker DL2000 日本TaKaRa公司;Agencourt AMPure Beads 美國Beckman Coulter公司;PicoGreen dsDNA檢測試劑盒 美國Invitrogen公司。
PSW-Y液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器 常州普森電子儀器廠;GL-20G-II立式高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器有限公司;Nanodrop ND-1000紫外分光光度計美國Thermo Fisher公司;2720聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀 美國ABI公司;Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。
1.3.1 空氣樣品的收集和處理
采樣時間正值大曲生產(chǎn),采樣地點為石堡灣的瀘州老窖制曲生態(tài)園區(qū)(簡稱老廠,28°55'22''N、105°28'36''E)和黃艤的瀘州老窖制曲中心(簡稱新廠,28°51'46''N、105°34'14''E),前者使用周期長達25 a,采用機械制曲工藝;后者使用周期僅2 a,過程參數(shù)等控制與老廠一致,采用智能化制曲工藝,且將陳曲粉撒在曲房內(nèi)營造優(yōu)勢微生物的小生境。
環(huán)境設(shè)施表面參考Du Hai等[9]方法,磷酸鹽緩沖液預(yù)先潤濕的無菌脫脂棉球,均勻涂抹制曲車間地面、制曲機器、制曲工具、運輸推車和曲架等環(huán)境后,放入50 mL無菌離心管后密封。環(huán)境空氣采用液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器收集于15 mL無菌的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中,采樣流量控制為12 L/min,采樣時間為15 min,然后裝入50 mL無菌離心管,于4 ℃保存待處理。隨后,0.22 μm硝酸纖維素濾膜真空抽濾,收集富集菌體的濾膜,置于50 mL離心管中,-80 ℃保藏用于DNA的提取、擴增。
在老廠和新廠的曲坯、制曲車間空氣及地面、原料、成曲(剛轉(zhuǎn)房的大曲)取平行樣,老廠制曲機器、制曲工具、手推車各取3個平行樣,新廠陳曲(存放3個月以上)[19]和曲架各取3個平行樣。因系多層制曲,老廠和新廠的成曲分別在上、中、下層各取3個平行樣,除老廠原料取了兩份平行樣外,其余樣品均為3個平行樣,樣品標簽參見表1。
表1 老廠和新廠樣品的名稱和標簽Table 1 Information about microbial samples from old and new Daqu production bases
1.3.2 DNA的提取和擴增
按照He Guiqiang[4]和Tang Qiuxiang[20]等方法提取總DNA并完成PCR擴增。按照Fast DNA SPIN提取試劑盒供應(yīng)商提供的操作程序提取各種樣品的總DNA,使用Nanodrop ND-1000初檢測其濃度和純度后,再用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其分子大小和純度。隨后分別按以下條件完成細菌和真菌的PCR擴增:細菌V3-V4區(qū)采用通用引物338F/806R,真菌ITS1區(qū)采用通用引物ITS5F/ITS1R。PCR擴增體系(25 μL):5×reaction buffer和5×GC buffer各5 μL,0.25 μL DNA聚合酶(5 U/μL,Q5 High-Fidelity),2 μL dNTPs(2.5 mmol/L),正反引物各1 μL(10 μmol/L),2 μL DNA模板,8.75 μL ddH2O。細菌PCR參數(shù):98 ℃預(yù)熱2 min,98 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共25個循環(huán),最后72 ℃保持5 min。真菌PCR參數(shù):95 ℃預(yù)熱3 min,95 ℃變性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共32個循環(huán),最后72 ℃保持10 min。PCR擴增產(chǎn)物用Agencourt AMPure Beads純化,使用PicoGreen dsDNA檢測試劑盒定量。
1.3.3 高通量測序和序列分析
PCR純化產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技有限公司,使用MiSeq基因測序試劑盒v3進行2×300 bp雙端測序。采用QIIME pipeline對原始序列進行處理,依據(jù)Caporaso等[21]方法去除一些低質(zhì)量序列,包括長度<150 bp、序列平均質(zhì)量<20、單堿基重復(fù)數(shù)>8 bp以及模糊的堿基。最后利用UCLUST算法將高質(zhì)量的序列以97%的序列相似度聚成不同的可操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)[22]。隨后在Greengenes和UNITE數(shù)據(jù)庫中檢索比對這些序列,最后生成OTU表,記錄每個樣本中各OTU的豐度和分類。
原始數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 26.0進行單因素方差分析,P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。序列數(shù)據(jù)分析主要使用QIIME(v1.8.0),使用R軟件(v4.0.5)進行聚類分析和非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析,并采用貝葉斯算法軟件SourceTracker(v1.0)[23]追溯曲坯微生物群落的來源,其他統(tǒng)計分析使用Origin 2021。
圖1 大曲及其潛在微生物來源的細菌(A、B)和真菌(C、D)α多樣性差異Fig. 1 Difference in α-diversity of bacteria (A, B) and fungi (C, D) from Daqu from old and new production bases and its potential microbial sources
所有樣品真菌和細菌的有效序列在53 979~103 223和55 328~120 392之間,其高質(zhì)量序列在47 331~101 111和38 476~107 863之間,稀疏曲線結(jié)果表明,測序深度可以表征微生物群落的多樣性。各種樣品的細菌和真菌α多樣性差異如圖1所示。
在老廠的曲坯細菌豐富度小于成曲,多樣性則略高,原料的α多樣性低于成曲。因長期粉塵沉降和富集,制曲車間地面的細菌豐富度和多樣性最高,真菌的豐富度亦最高。高溫定向馴化的作用降低了成曲的真菌豐富度和多樣性。原料的真菌多樣性最高,而制曲車間空氣的最低。在新廠中,曲坯微生物α多樣性與原料相當,發(fā)酵后細菌的α多樣性增高,真菌則降低。新廠車間空氣的α多樣性最低,且低于老廠。曲架因反復(fù)接觸曲坯,細菌和真菌α多樣性較高。因老廠使用周期長,空氣和環(huán)境中的α多樣性高于新廠,老廠曲坯的多樣性也高于原料和成曲。類似已報道的結(jié)果,兩個制曲基地的成曲真菌α多樣性低于原料及環(huán)境等[9,24]。
圖2 細菌(A)和真菌(B)的NMDSFig. 2 Bacterial (A) and fungal (B) NMDS
如圖2所示,老廠中的曲坯與原料、機器、工具等群落結(jié)構(gòu)相似度高,與制曲車間空氣則距離較遠。與老廠類似的是,新廠曲坯細菌和真菌群落與原料的距離都很近,而與車間空氣、地面等和曲架距離都較遠,新廠曲坯群落與環(huán)境的差異較老廠大,成曲和經(jīng)3個月存放的大曲(陳曲)群落結(jié)構(gòu)相似,說明通過撒陳曲粉營造了適合大曲生產(chǎn)的環(huán)境。
圖3 老廠優(yōu)勢細菌(A)和真菌(B)分布Fig. 3 Distribution of dominant bacteria (A) and fungi (B) in Daqu from old production base
老廠各種樣品中前16個優(yōu)勢細菌屬(至少在兩個樣品中相對豐度>2%)的結(jié)果如圖3A所示。與原料聚為一簇的曲坯的優(yōu)勢細菌為Weissella(70.17%)、Pantoea(10.09%)、Leuconostoc(5.79%)和Lactobacillus(3.79%)。與曲坯聚為一亞簇的成曲中除Weissella(49.91%)、Lactobacillus(13.04%)和Leuconostoc(2.28%)是優(yōu)勢細菌外,Staphylococcus(21.64%)、Bacillus(3.29%)和Pediococcus(2.32%)也占優(yōu)勢。如圖3B所示,曲坯與除空氣外的環(huán)境樣品聚為一簇,其優(yōu)勢真菌包括Pichia(32.24%)、Hyphopichia(4.89%)、Wickerhamomyces(1.94%)。Thermoascus(46.90%)、Thermomyces(12.35%)、Rhizopus(9.90%)、Hyphopichia(9.30%)以及Aspergillus(8.71%)則是成曲中的優(yōu)勢真菌。車間空氣以Phialemoniopsis(97.58%)為主。曲坯中的3種優(yōu)勢真菌并不主要來自原料而可能源于地面、工具和機器等環(huán)境設(shè)施。
圖4 新廠優(yōu)勢細菌(A)和真菌(B)分布Fig. 4 Distribution of dominant bacteria (A) and fungi (B) in Daqu from new production base
新廠各種樣品中,前17個不同屬的細菌的聚類分析結(jié)果如圖4A所示。聚為同簇的曲坯、原料、成曲和陳曲中,Weissella和Leuconostoc為優(yōu)勢細菌,但各樣品間的豐度差異顯著,在曲坯中為98.22%和0.58%、原料中為87.37%和11.36%、成曲中為27.85%和12.55%,而在陳曲中則為47.03%和5.85%。成曲中的Bacillus和Lactobacillus分別增至2.50%和14.60%,Weissella顯著降低,而與陳曲聚類為同亞簇。新廠各樣品中的優(yōu)勢真菌屬如圖4B所示。曲坯與原料聚為同亞簇,Pichia(5.29%)、Hyphopichia(0.07%)和Alternaria(0.07%)為優(yōu)勢真菌,原料中檢出的Alternaria(5.83%)為優(yōu)勢真菌。成曲和陳曲中的優(yōu)勢真菌則為Thermoascus(44.20%和44.33%)、Thermomyces(31.25%和8.94%)、Pichia(4.55%和37.16%)以及Aspergillus(10.06%和5.67%)。地面和曲架的Aspergillus等豐度較高而聚類為同亞簇,制曲空氣仍為Phialemoniopsis(99.31%)占絕對優(yōu)勢。
兩個制曲基地中曲坯和成曲檢出的優(yōu)勢微生物都是曾報道大曲與白酒發(fā)酵的優(yōu)勢功能菌[9,16,25]。這些微生物包括合成多種風味前體物質(zhì)的Staphylococcus、產(chǎn)多種功能酶的Bacillus[26]及Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Weissella等乳酸菌[27],發(fā)酵初期的窖泥和糟醅中的優(yōu)勢酵母Pichia和Hyphopichia[28]。Pichia可能來源于環(huán)境,在白酒發(fā)酵中具有關(guān)鍵作用[29],是乙醇、有機酸和酯類等多種芳香化合物的貢獻者[9,30]。而Pantoea和Alternaria在小麥原料中為優(yōu)勢細菌和真菌[8],Thermoascus和Thermomyces等為高效降解碳水化合物的嗜熱真菌[31-32]。此外,環(huán)境設(shè)施與大曲群落間相互交換,所以在空氣和環(huán)境設(shè)施中也都有檢出這些種屬。
進一步對兩廠大曲微生物進行溯源分析,以確定大曲中的微生物來源以及具體菌屬的貢獻。
老廠的20個樣本(不含成曲)檢出215個屬的細菌和137個屬的真菌,樣品曲坯設(shè)定為Sink,其余樣品設(shè)為不同Source,SourceTracker結(jié)果表明曲坯中細菌屬源于原料(49.3%)和制曲工具(40.3%),細菌的未知來源(0.8%)較少,車間空氣(0.1%)和地面(0.2%)貢獻度最低(圖5B)。進一步對曲坯屬水平細菌群落溯源分析,結(jié)果表明曲坯優(yōu)勢細菌如Weissella、Pantoea、Leuconostoc、Lactobacillus以及Bacillus等都主要來源于原料和制曲工具,而Rothia、Gluconobacter、Escherichia-Shigella和Rhodococcus等主要來源于制曲工具和機器,車間空氣和地面對曲坯細菌貢獻較低。曲坯中真菌屬主要來源于原料(56.1%),其次是制曲工具(16.7%)、制曲機器(5.3%)等環(huán)境設(shè)施樣品,車間空氣等其他環(huán)境樣品對曲坯微生物貢獻較少(圖5A)。原料可能并未對曲坯的優(yōu)勢真菌有較大貢獻。曲坯屬水平真菌群落的溯源分析結(jié)果表明曲坯優(yōu)勢真菌Hyphopichia和Wickerhamomyces來源于環(huán)境設(shè)施樣品,Alternaria主要來源于原料,而Pichia來源于原料與環(huán)境樣品,Trichosporon、Rhizopus和Aspergillus主要來源于原料和制曲工具,而車間空氣對曲坯真菌貢獻較少,主要貢獻了Pichia、Kazachstania和Phialemoniopsis。
對于新廠,18個樣本(不含成曲)共檢出183個屬細菌和76個屬真菌,陳曲因新廠撒陳曲粉而作為來源樣本分析。SourceTracker結(jié)果表明新廠曲坯中細菌屬主要來源于原料(96.5%),其次是陳曲(2.6%),而車間空氣(0.01%)貢獻最低(圖5C)。新廠曲坯中真菌屬主要來源于原料(96.4%),其次是陳曲(3.5%),車間地面等其他環(huán)境樣品對曲坯真菌貢獻較少。與老廠相比,原料貢獻度更高,結(jié)合前述分析表明撒陳曲粉強化發(fā)酵對曲坯細菌和真菌都有所貢獻且對后者貢獻更大。對屬水平真菌和細菌群落進行溯源分析(圖5C),結(jié)果表明,對于真菌,原料主要為曲坯貢獻了Alternaria、Aspergillus、Wickerhamomyces及其他菌屬,而陳曲貢獻了Thermoascus、Thermomyces、Trichosporon和Mucor等耐高溫菌屬以及Pichia、Hyphopichia、Candida等酵母菌屬。對于細菌,原料主要為曲坯貢獻了Weissella、Leuconostoc、Lactobacillus以及Staphylococcus、Acetobacter等,陳曲主要貢獻了Pediococcus和Bacteroides,這些細菌在大曲已檢出,也是白酒發(fā)酵過程中的重要功能菌[9,16,25]。
環(huán)境等對老廠曲坯的貢獻度更高,特別是細菌群落。與老廠相比,新廠空氣和環(huán)境對曲坯微生物的貢獻度很小,且原料對新廠曲坯的貢獻更高,新廠可能由于新建其曲坯群落與環(huán)境的差異較老廠大。由此可見,生產(chǎn)環(huán)境在濃香型大曲的制造過程中起到關(guān)鍵作用,同時通過撒陳曲粉的強化方式可快速營造適合大曲生產(chǎn)的環(huán)境。
圖5 老廠和新廠不同來源微生物對曲坯的平均貢獻率及屬水平溯源分析Fig. 5 Average contribution rates of microorganisms from different sources to microbial community in raw starter brick before incubation and genus-level traceability
經(jīng)過中高溫發(fā)酵過程,大曲的群落組成發(fā)生了顯著變化,進一步以相同的制曲環(huán)境和原料作為微生物來源,對成曲進行溯源分析,SourceTracker結(jié)果顯示,制曲環(huán)境和原料對老廠成曲細菌群落的貢獻度較高,尤其是制曲工具(76.3%),而對真菌群落的貢獻度較小且真菌未知來源較多(95.4%),如嗜熱真菌屬等(圖6A),并且新廠成曲細菌和真菌群落主要來源于原料(13.3%和0.6%)和陳曲(40.8%和14.8%),而受環(huán)境影響較小,真菌的未知來源仍較多(73.8%)(圖6B)。這些結(jié)果說明環(huán)境對老廠成曲細菌群落的貢獻度同樣較高,而真菌群落相對穩(wěn)定,受環(huán)境微生物的影響較小,這可能是大曲微生物群落受溫、濕度等環(huán)境參數(shù)調(diào)控和馴化所致[33],尤其是真菌。新廠可能不如老廠環(huán)境微生物豐富和穩(wěn)定,撒陳曲粉強化營造了適合大曲生產(chǎn)的環(huán)境,有利于新廠大曲的定向馴化,對維持大曲品質(zhì)穩(wěn)定性具有十分重要的作用。
圖6 老廠(A)和新廠(B)不同來源微生物對成曲的平均貢獻率Fig. 6 Average contribution rates of microorganisms from different sources to mature Daqu from old (A) and new (B) production bases
以同企業(yè)的新老制曲基地及生產(chǎn)的大曲為對象,應(yīng)用高通量測序技術(shù)探討了生產(chǎn)環(huán)境(空氣、設(shè)施)及原料與大曲的群落結(jié)構(gòu)特點,通過溯源分析解析了其微生物菌群對大曲群落組成的貢獻。結(jié)果表明,在新老兩廠,大曲中檢出的優(yōu)勢微生物都是白酒發(fā)酵過程的重要功能菌,曲坯都以Weissella、Lactobacillus、Leuconostoc等乳酸菌和Pichia、Hyphopichia為主,而成曲中Bacillus、Lactobacillus增加,相應(yīng)地,Weissella減少,真菌則以Thermoascus和Thermomyces等嗜熱真菌為主。生產(chǎn)環(huán)境在濃香型大曲的制造過程中起著關(guān)鍵作用。環(huán)境設(shè)施與大曲微生物群落間相互交換,驅(qū)動大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的演替,且長期使用的生產(chǎn)環(huán)境的群落多樣性更高。SourceTracker結(jié)果顯示,老廠曲坯中微生物主要來源于原料和制曲工具,且老廠環(huán)境對曲坯和成曲細菌群落組成的貢獻度都更高,但真菌群落相對穩(wěn)定,受環(huán)境微生物的影響較小。新廠曲坯微生物主要來源于原料,陳曲對新廠成曲的微生物貢獻高于對曲坯的貢獻,通過適當強化方式營造適合大曲生產(chǎn)的環(huán)境,可以使生產(chǎn)環(huán)境乃至大曲本身朝著有利于大曲品質(zhì)的方向發(fā)展。研究結(jié)果揭示了濃香型大曲微生物群落的來源,為解析大曲群落定向馴化和驅(qū)動作用提供參考依據(jù)。