劉英杰，黃 鈞，秦 輝，張宿義，董 異，王 超，王小軍，周榮清,2,*

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646699；3.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646699）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品不僅生產(chǎn)歷史悠久，也是食品及現(xiàn)代生物產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，且白酒產(chǎn)業(yè)與民族生物產(chǎn)業(yè)息息相關(guān)[1-2]。大曲是傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)過程中必需的發(fā)酵劑、酶制劑與獨特的原料，其微生物群落的多樣性對基酒的品質(zhì)和風味影響顯著[3]。大曲因原料、過程調(diào)控參數(shù)不同，主要分為濃、醬、清3種主要類型，在白酒的生產(chǎn)中，賦予其獨特工藝和風味特點。這些大曲生產(chǎn)工藝的共同特點是自然接種、生料發(fā)酵、控溫調(diào)濕定向馴化和調(diào)控其群落與代謝[4]。類似眾多的傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)，棲息在環(huán)境中的微生物與大曲群落多樣性和演替密切相關(guān)[5-6]。大曲坯是天然培養(yǎng)基[3]，原料、生產(chǎn)環(huán)境及設(shè)施等微生物群落結(jié)構(gòu)與大曲的密切相關(guān)[7-9]，且影響大曲發(fā)酵過程。如棲息在空氣和發(fā)酵設(shè)施的耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）是清香大曲酒發(fā)酵的主要菌源[10-11]，從釀造車間和曲房空氣中分離到了產(chǎn)特征風味的功能酵母和產(chǎn)酶細菌[12-13]，大曲生產(chǎn)環(huán)境空氣中棲息的微生物與大曲細菌群落的變遷關(guān)系密切[14-15]。生產(chǎn)環(huán)境與大曲間優(yōu)勢菌群相互交換，驅(qū)動大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的演替[16-18]，營造了獨特的微生態(tài)，是生產(chǎn)高質(zhì)量大曲的重要基礎(chǔ)。然而，大曲微生物群落來源和形成機制的研究仍然較少，且生產(chǎn)環(huán)境與成曲間群落互作關(guān)系迄今鮮見報道。

本研究以同企業(yè)使用周期差異顯著的新老制曲基地及生產(chǎn)的大曲為對象，應(yīng)用高通量測序技術(shù)探討生產(chǎn)環(huán)境（空氣、設(shè)施）、原料與大曲微生物群落結(jié)構(gòu)特點，通過溯源分析解析其微生物菌群對大曲群落組成的貢獻，旨在揭示濃香型大曲微生物群落的來源，為解析大曲群落定向馴化和驅(qū)動作用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Fast DNA SPIN基因提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司；Q5 DNA高保真聚合酶 美國New England Biolabs公司；瓊脂糖、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液TAE 美國Invitrogen公司；Marker DL2000 日本TaKaRa公司；Agencourt AMPure Beads 美國Beckman Coulter公司；PicoGreen dsDNA檢測試劑盒 美國Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PSW-Y液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器 常州普森電子儀器廠；GL-20G-II立式高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；Nanodrop ND-1000紫外分光光度計美國Thermo Fisher公司；2720聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 美國ABI公司；Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 空氣樣品的收集和處理

采樣時間正值大曲生產(chǎn)，采樣地點為石堡灣的瀘州老窖制曲生態(tài)園區(qū)（簡稱老廠，28°55'22''N、105°28'36''E）和黃艤的瀘州老窖制曲中心（簡稱新廠，28°51'46''N、105°34'14''E），前者使用周期長達25 a，采用機械制曲工藝；后者使用周期僅2 a，過程參數(shù)等控制與老廠一致，采用智能化制曲工藝，且將陳曲粉撒在曲房內(nèi)營造優(yōu)勢微生物的小生境。

環(huán)境設(shè)施表面參考Du Hai等[9]方法，磷酸鹽緩沖液預(yù)先潤濕的無菌脫脂棉球，均勻涂抹制曲車間地面、制曲機器、制曲工具、運輸推車和曲架等環(huán)境后，放入50 mL無菌離心管后密封。環(huán)境空氣采用液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器收集于15 mL無菌的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，采樣流量控制為12 L/min，采樣時間為15 min，然后裝入50 mL無菌離心管，于4 ℃保存待處理。隨后，0.22 μm硝酸纖維素濾膜真空抽濾，收集富集菌體的濾膜，置于50 mL離心管中，-80 ℃保藏用于DNA的提取、擴增。

在老廠和新廠的曲坯、制曲車間空氣及地面、原料、成曲（剛轉(zhuǎn)房的大曲）取平行樣，老廠制曲機器、制曲工具、手推車各取3個平行樣，新廠陳曲（存放3個月以上）[19]和曲架各取3個平行樣。因系多層制曲，老廠和新廠的成曲分別在上、中、下層各取3個平行樣，除老廠原料取了兩份平行樣外，其余樣品均為3個平行樣，樣品標簽參見表1。

表1 老廠和新廠樣品的名稱和標簽Table 1 Information about microbial samples from old and new Daqu production bases

1.3.2 DNA的提取和擴增

按照He Guiqiang[4]和Tang Qiuxiang[20]等方法提取總DNA并完成PCR擴增。按照Fast DNA SPIN提取試劑盒供應(yīng)商提供的操作程序提取各種樣品的總DNA，使用Nanodrop ND-1000初檢測其濃度和純度后，再用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其分子大小和純度。隨后分別按以下條件完成細菌和真菌的PCR擴增：細菌V3-V4區(qū)采用通用引物338F/806R，真菌ITS1區(qū)采用通用引物ITS5F/ITS1R。PCR擴增體系（25 μL）：5×reaction buffer和5×GC buffer各5 μL，0.25 μL DNA聚合酶（5 U/μL，Q5 High-Fidelity），2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），正反引物各1 μL（10 μmol/L），2 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O。細菌PCR參數(shù)：98 ℃預(yù)熱2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環(huán)，最后72 ℃保持5 min。真菌PCR參數(shù)：95 ℃預(yù)熱3 min，95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共32個循環(huán)，最后72 ℃保持10 min。PCR擴增產(chǎn)物用Agencourt AMPure Beads純化，使用PicoGreen dsDNA檢測試劑盒定量。

1.3.3 高通量測序和序列分析

PCR純化產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技有限公司，使用MiSeq基因測序試劑盒v3進行2×300 bp雙端測序。采用QIIME pipeline對原始序列進行處理，依據(jù)Caporaso等[21]方法去除一些低質(zhì)量序列，包括長度＜150 bp、序列平均質(zhì)量＜20、單堿基重復(fù)數(shù)＞8 bp以及模糊的堿基。最后利用UCLUST算法將高質(zhì)量的序列以97%的序列相似度聚成不同的可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[22]。隨后在Greengenes和UNITE數(shù)據(jù)庫中檢索比對這些序列，最后生成OTU表，記錄每個樣本中各OTU的豐度和分類。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 26.0進行單因素方差分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。序列數(shù)據(jù)分析主要使用QIIME（v1.8.0），使用R軟件（v4.0.5）進行聚類分析和非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析，并采用貝葉斯算法軟件SourceTracker（v1.0）[23]追溯曲坯微生物群落的來源，其他統(tǒng)計分析使用Origin 2021。

2 結(jié)果與分析

2.1 生產(chǎn)環(huán)境、原料及大曲的微生物群落多樣性差異

圖1 大曲及其潛在微生物來源的細菌（A、B）和真菌（C、D）α多樣性差異Fig. 1 Difference in α-diversity of bacteria (A, B) and fungi (C, D) from Daqu from old and new production bases and its potential microbial sources

所有樣品真菌和細菌的有效序列在53 979～103 223和55 328～120 392之間，其高質(zhì)量序列在47 331～101 111和38 476～107 863之間，稀疏曲線結(jié)果表明，測序深度可以表征微生物群落的多樣性。各種樣品的細菌和真菌α多樣性差異如圖1所示。

在老廠的曲坯細菌豐富度小于成曲，多樣性則略高，原料的α多樣性低于成曲。因長期粉塵沉降和富集，制曲車間地面的細菌豐富度和多樣性最高，真菌的豐富度亦最高。高溫定向馴化的作用降低了成曲的真菌豐富度和多樣性。原料的真菌多樣性最高，而制曲車間空氣的最低。在新廠中，曲坯微生物α多樣性與原料相當，發(fā)酵后細菌的α多樣性增高，真菌則降低。新廠車間空氣的α多樣性最低，且低于老廠。曲架因反復(fù)接觸曲坯，細菌和真菌α多樣性較高。因老廠使用周期長，空氣和環(huán)境中的α多樣性高于新廠，老廠曲坯的多樣性也高于原料和成曲。類似已報道的結(jié)果，兩個制曲基地的成曲真菌α多樣性低于原料及環(huán)境等[9,24]。

圖2 細菌（A）和真菌（B）的NMDSFig. 2 Bacterial (A) and fungal (B) NMDS

如圖2所示，老廠中的曲坯與原料、機器、工具等群落結(jié)構(gòu)相似度高，與制曲車間空氣則距離較遠。與老廠類似的是，新廠曲坯細菌和真菌群落與原料的距離都很近，而與車間空氣、地面等和曲架距離都較遠，新廠曲坯群落與環(huán)境的差異較老廠大，成曲和經(jīng)3個月存放的大曲（陳曲）群落結(jié)構(gòu)相似，說明通過撒陳曲粉營造了適合大曲生產(chǎn)的環(huán)境。

2.2 生產(chǎn)環(huán)境、原料及大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異

圖3 老廠優(yōu)勢細菌（A）和真菌（B）分布Fig. 3 Distribution of dominant bacteria (A) and fungi (B) in Daqu from old production base

老廠各種樣品中前16個優(yōu)勢細菌屬（至少在兩個樣品中相對豐度＞2%）的結(jié)果如圖3A所示。與原料聚為一簇的曲坯的優(yōu)勢細菌為Weissella（70.17%）、Pantoea（10.09%）、Leuconostoc（5.79%）和Lactobacillus（3.79%）。與曲坯聚為一亞簇的成曲中除Weissella（49.91%）、Lactobacillus（13.04%）和Leuconostoc（2.28%）是優(yōu)勢細菌外，Staphylococcus（21.64%）、Bacillus（3.29%）和Pediococcus（2.32%）也占優(yōu)勢。如圖3B所示，曲坯與除空氣外的環(huán)境樣品聚為一簇，其優(yōu)勢真菌包括Pichia（32.24%）、Hyphopichia（4.89%）、Wickerhamomyces（1.94%）。Thermoascus（46.90%）、Thermomyces（12.35%）、Rhizopus（9.90%）、Hyphopichia（9.30%）以及Aspergillus（8.71%）則是成曲中的優(yōu)勢真菌。車間空氣以Phialemoniopsis（97.58%）為主。曲坯中的3種優(yōu)勢真菌并不主要來自原料而可能源于地面、工具和機器等環(huán)境設(shè)施。

圖4 新廠優(yōu)勢細菌（A）和真菌（B）分布Fig. 4 Distribution of dominant bacteria (A) and fungi (B) in Daqu from new production base

新廠各種樣品中，前17個不同屬的細菌的聚類分析結(jié)果如圖4A所示。聚為同簇的曲坯、原料、成曲和陳曲中，Weissella和Leuconostoc為優(yōu)勢細菌，但各樣品間的豐度差異顯著，在曲坯中為98.22%和0.58%、原料中為87.37%和11.36%、成曲中為27.85%和12.55%，而在陳曲中則為47.03%和5.85%。成曲中的Bacillus和Lactobacillus分別增至2.50%和14.60%，Weissella顯著降低，而與陳曲聚類為同亞簇。新廠各樣品中的優(yōu)勢真菌屬如圖4B所示。曲坯與原料聚為同亞簇，Pichia（5.29%）、Hyphopichia（0.07%）和Alternaria（0.07%）為優(yōu)勢真菌，原料中檢出的Alternaria（5.83%）為優(yōu)勢真菌。成曲和陳曲中的優(yōu)勢真菌則為Thermoascus（44.20%和44.33%）、Thermomyces（31.25%和8.94%）、Pichia（4.55%和37.16%）以及Aspergillus（10.06%和5.67%）。地面和曲架的Aspergillus等豐度較高而聚類為同亞簇，制曲空氣仍為Phialemoniopsis（99.31%）占絕對優(yōu)勢。

兩個制曲基地中曲坯和成曲檢出的優(yōu)勢微生物都是曾報道大曲與白酒發(fā)酵的優(yōu)勢功能菌[9,16,25]。這些微生物包括合成多種風味前體物質(zhì)的Staphylococcus、產(chǎn)多種功能酶的Bacillus[26]及Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Weissella等乳酸菌[27]，發(fā)酵初期的窖泥和糟醅中的優(yōu)勢酵母Pichia和Hyphopichia[28]。Pichia可能來源于環(huán)境，在白酒發(fā)酵中具有關(guān)鍵作用[29]，是乙醇、有機酸和酯類等多種芳香化合物的貢獻者[9,30]。而Pantoea和Alternaria在小麥原料中為優(yōu)勢細菌和真菌[8]，Thermoascus和Thermomyces等為高效降解碳水化合物的嗜熱真菌[31-32]。此外，環(huán)境設(shè)施與大曲群落間相互交換，所以在空氣和環(huán)境設(shè)施中也都有檢出這些種屬。

2.3 大曲微生物群落的溯源性分析

進一步對兩廠大曲微生物進行溯源分析，以確定大曲中的微生物來源以及具體菌屬的貢獻。

老廠的20個樣本（不含成曲）檢出215個屬的細菌和137個屬的真菌，樣品曲坯設(shè)定為Sink，其余樣品設(shè)為不同Source，SourceTracker結(jié)果表明曲坯中細菌屬源于原料（49.3%）和制曲工具（40.3%），細菌的未知來源（0.8%）較少，車間空氣（0.1%）和地面（0.2%）貢獻度最低（圖5B）。進一步對曲坯屬水平細菌群落溯源分析，結(jié)果表明曲坯優(yōu)勢細菌如Weissella、Pantoea、Leuconostoc、Lactobacillus以及Bacillus等都主要來源于原料和制曲工具，而Rothia、Gluconobacter、Escherichia-Shigella和Rhodococcus等主要來源于制曲工具和機器，車間空氣和地面對曲坯細菌貢獻較低。曲坯中真菌屬主要來源于原料（56.1%），其次是制曲工具（16.7%）、制曲機器（5.3%）等環(huán)境設(shè)施樣品，車間空氣等其他環(huán)境樣品對曲坯微生物貢獻較少（圖5A）。原料可能并未對曲坯的優(yōu)勢真菌有較大貢獻。曲坯屬水平真菌群落的溯源分析結(jié)果表明曲坯優(yōu)勢真菌Hyphopichia和Wickerhamomyces來源于環(huán)境設(shè)施樣品，Alternaria主要來源于原料，而Pichia來源于原料與環(huán)境樣品，Trichosporon、Rhizopus和Aspergillus主要來源于原料和制曲工具，而車間空氣對曲坯真菌貢獻較少，主要貢獻了Pichia、Kazachstania和Phialemoniopsis。

對于新廠，18個樣本（不含成曲）共檢出183個屬細菌和76個屬真菌，陳曲因新廠撒陳曲粉而作為來源樣本分析。SourceTracker結(jié)果表明新廠曲坯中細菌屬主要來源于原料（96.5%），其次是陳曲（2.6%），而車間空氣（0.01%）貢獻最低（圖5C）。新廠曲坯中真菌屬主要來源于原料（96.4%），其次是陳曲（3.5%），車間地面等其他環(huán)境樣品對曲坯真菌貢獻較少。與老廠相比，原料貢獻度更高，結(jié)合前述分析表明撒陳曲粉強化發(fā)酵對曲坯細菌和真菌都有所貢獻且對后者貢獻更大。對屬水平真菌和細菌群落進行溯源分析（圖5C），結(jié)果表明，對于真菌，原料主要為曲坯貢獻了Alternaria、Aspergillus、Wickerhamomyces及其他菌屬，而陳曲貢獻了Thermoascus、Thermomyces、Trichosporon和Mucor等耐高溫菌屬以及Pichia、Hyphopichia、Candida等酵母菌屬。對于細菌，原料主要為曲坯貢獻了Weissella、Leuconostoc、Lactobacillus以及Staphylococcus、Acetobacter等，陳曲主要貢獻了Pediococcus和Bacteroides，這些細菌在大曲已檢出，也是白酒發(fā)酵過程中的重要功能菌[9,16,25]。

環(huán)境等對老廠曲坯的貢獻度更高，特別是細菌群落。與老廠相比，新廠空氣和環(huán)境對曲坯微生物的貢獻度很小，且原料對新廠曲坯的貢獻更高，新廠可能由于新建其曲坯群落與環(huán)境的差異較老廠大。由此可見，生產(chǎn)環(huán)境在濃香型大曲的制造過程中起到關(guān)鍵作用，同時通過撒陳曲粉的強化方式可快速營造適合大曲生產(chǎn)的環(huán)境。

圖5 老廠和新廠不同來源微生物對曲坯的平均貢獻率及屬水平溯源分析Fig. 5 Average contribution rates of microorganisms from different sources to microbial community in raw starter brick before incubation and genus-level traceability

經(jīng)過中高溫發(fā)酵過程，大曲的群落組成發(fā)生了顯著變化，進一步以相同的制曲環(huán)境和原料作為微生物來源，對成曲進行溯源分析，SourceTracker結(jié)果顯示，制曲環(huán)境和原料對老廠成曲細菌群落的貢獻度較高，尤其是制曲工具（76.3%），而對真菌群落的貢獻度較小且真菌未知來源較多（95.4%），如嗜熱真菌屬等（圖6A），并且新廠成曲細菌和真菌群落主要來源于原料（13.3%和0.6%）和陳曲（40.8%和14.8%），而受環(huán)境影響較小，真菌的未知來源仍較多（73.8%）（圖6B）。這些結(jié)果說明環(huán)境對老廠成曲細菌群落的貢獻度同樣較高，而真菌群落相對穩(wěn)定，受環(huán)境微生物的影響較小，這可能是大曲微生物群落受溫、濕度等環(huán)境參數(shù)調(diào)控和馴化所致[33]，尤其是真菌。新廠可能不如老廠環(huán)境微生物豐富和穩(wěn)定，撒陳曲粉強化營造了適合大曲生產(chǎn)的環(huán)境，有利于新廠大曲的定向馴化，對維持大曲品質(zhì)穩(wěn)定性具有十分重要的作用。

圖6 老廠（A）和新廠（B）不同來源微生物對成曲的平均貢獻率Fig. 6 Average contribution rates of microorganisms from different sources to mature Daqu from old (A) and new (B) production bases

3 結(jié) 論

以同企業(yè)的新老制曲基地及生產(chǎn)的大曲為對象，應(yīng)用高通量測序技術(shù)探討了生產(chǎn)環(huán)境（空氣、設(shè)施）及原料與大曲的群落結(jié)構(gòu)特點，通過溯源分析解析了其微生物菌群對大曲群落組成的貢獻。結(jié)果表明，在新老兩廠，大曲中檢出的優(yōu)勢微生物都是白酒發(fā)酵過程的重要功能菌，曲坯都以Weissella、Lactobacillus、Leuconostoc等乳酸菌和Pichia、Hyphopichia為主，而成曲中Bacillus、Lactobacillus增加，相應(yīng)地，Weissella減少，真菌則以Thermoascus和Thermomyces等嗜熱真菌為主。生產(chǎn)環(huán)境在濃香型大曲的制造過程中起著關(guān)鍵作用。環(huán)境設(shè)施與大曲微生物群落間相互交換，驅(qū)動大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的演替，且長期使用的生產(chǎn)環(huán)境的群落多樣性更高。SourceTracker結(jié)果顯示，老廠曲坯中微生物主要來源于原料和制曲工具，且老廠環(huán)境對曲坯和成曲細菌群落組成的貢獻度都更高，但真菌群落相對穩(wěn)定，受環(huán)境微生物的影響較小。新廠曲坯微生物主要來源于原料，陳曲對新廠成曲的微生物貢獻高于對曲坯的貢獻，通過適當強化方式營造適合大曲生產(chǎn)的環(huán)境，可以使生產(chǎn)環(huán)境乃至大曲本身朝著有利于大曲品質(zhì)的方向發(fā)展。研究結(jié)果揭示了濃香型大曲微生物群落的來源，為解析大曲群落定向馴化和驅(qū)動作用提供參考依據(jù)。