楊慧軒，羅 欣，朱立賢，楊嘯吟，韓廣星，李 和，董鵬程,*，張一敏

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系臨沂站，山東 臨沂 276000；3.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系通遼站，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

隨著居民生活水平、城市化進(jìn)程的提高，我國冷鮮牛肉的消費(fèi)逐漸成為主流，屠宰加工企業(yè)由凍肉向鮮肉轉(zhuǎn)型趨勢(shì)明顯[1-2]。但是，由于冷鮮牛肉營養(yǎng)物質(zhì)豐富、水分活度高，其在加工、銷售過程中，腐敗菌引起的資源浪費(fèi)[3]以及食源性致病菌滋生（如沙門氏菌、單核細(xì)胞性李斯特菌和致病性大腸桿菌）引發(fā)的健康風(fēng)險(xiǎn)[4-6]是產(chǎn)業(yè)面臨的嚴(yán)峻問題。研發(fā)能夠替代傳統(tǒng)化學(xué)抑菌劑的天然高效肉制品保鮮方式是市場(chǎng)的迫切需求。乳酸菌因其能夠產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素及其他抑菌物質(zhì)，是天然的減少肉品腐敗、控制食源性病原體滋生的有益菌株，可作為生物保護(hù)菌而代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)抑菌劑，具有良好的應(yīng)用前景[7]。

乳酸菌如乳桿菌屬（Lactobacillus）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）和乳球菌屬（Lactococcus）等均可在肉品中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，并抑制單核細(xì)胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）以及其他有害微生物的生長[8]。Chen Xue等[9]在真空包裝牛肉的微生物多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的菌群優(yōu)勢(shì)度是決定牛肉貨架期的重要因素。此外，保護(hù)菌還能賦予肉品理想的感官特性，形成良好的風(fēng)味。Nie Xiaohua等[10]發(fā)現(xiàn)接種乳酸菌的香腸內(nèi)生成了高濃度的纈氨酸和亮氨酸，纈氨酸和亮氨酸和亮氨酸是風(fēng)味化合物形成的前體。Slima等[11]發(fā)現(xiàn)益生菌的加入可以改善牛肉香腸組織結(jié)構(gòu)，降低產(chǎn)品硬度。因此，篩選具有生物保護(hù)功能的乳酸菌，豐富適用于肉制品的生物保護(hù)菌菌種資源，對(duì)于發(fā)展多元化的防腐保鮮技術(shù)、提高生鮮肉制品生物安全水平具有重要意義。

真空包裝是冷鮮牛肉的主要方式之一[12]，乳酸菌較易在真空包裝牛肉的菌群中占據(jù)優(yōu)勢(shì)[13]，這為乳酸菌作為生物保護(hù)菌提供了應(yīng)用前景。雖然大量乳酸菌被認(rèn)為是“公認(rèn)安全（generally regarded as safe，GARS）”[14]，但仍有研究認(rèn)為將具有抗生素抗性基因的乳酸菌作為保護(hù)菌使用，具有引發(fā)耐藥性基因傳播的風(fēng)險(xiǎn)[15]，并且未經(jīng)安全性檢測(cè)的乳酸菌還可能存在編碼激活溶細(xì)胞素和產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶等相關(guān)的毒力基因[16-18]，對(duì)食品安全造成威脅。因此乳酸菌的安全性檢測(cè)十分必要。

本研究以真空包裝牛肉作為分離源，分離純化優(yōu)勢(shì)乳酸菌，使用生理生化方法結(jié)合16S rDNA分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，分析菌株的最適生長溫度、生長和產(chǎn)酸能力、耐藥性、毒力基因等生物學(xué)特性，并進(jìn)一步通過瓊脂擴(kuò)散法研究了其抑菌性能，篩選安全可靠的生物保護(hù)菌株。旨在獲得具有應(yīng)用前景的乳酸菌，為生物保護(hù)菌的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)和菌株儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛背最長肌樣品采自山東陽信億利源清真肉類有限公司。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯北京陸橋技術(shù)股份有限公司；生理生化鑒定管阿拉伯糖、纖維二糖、七葉靈、甘露醇、松三糖、蜜二糖、棉籽糖、水楊苷和海藻糖購自青島海博生物技術(shù)有限公司，其余均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌DNA試劑盒、溶菌酶 康維世紀(jì)生物科技有限公司；Tris、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、Triton X-100、過氧化氫酶、革蘭氏染色液試劑盒、抗生素 北京索萊寶科技有限公司；2×AccurateTaqMaster Mix（dye plus） 艾科瑞生物工程有限公司；蛋白酶K 美國Merck公司；通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'）以及毒力基因引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；SW-CJ-1CU 潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MQT-60R振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；BAGMIXER 400均質(zhì)拍打器 法國Interscience公司；BX41TF生物顯微鏡 日本Olympus公司；T100TMThermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；Epoch2酶標(biāo)儀美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分離

參照Mcsharry等[19]研究中乳酸菌菌群變化趨勢(shì)，牛肉樣品被無菌切分為牛排后立即真空包裝并于室溫放置48 h后取樣，從牛肉表面收集10 g樣品置于拍打袋中，加入90 mL無菌生理鹽水，隨后用均質(zhì)拍打器拍打2 min。 拍打液經(jīng)生理鹽水梯度稀釋后取100 μL稀釋液于MRS+2% CaCO3培養(yǎng)基上涂板，37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。選擇具有明顯溶鈣圈并且符合乳酸菌菌落形態(tài)的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)，之后選取目標(biāo)菌株接種至MRS肉湯中。參照Sabo等[20]研究結(jié)果，為使菌體大量富集，在搖床內(nèi)于37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)18～24 h，富集后的菌液轉(zhuǎn)移至30%甘油凍存管中于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)[21]中乳酸菌生理生化反應(yīng)對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.3 16S rDNA分子生物學(xué)鑒定

使用細(xì)菌DNA提取試劑盒獲取待測(cè)菌株DNA，用16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'）作為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系（50 μL）：2×AccurateTaqMaster Mix（dye plus）25 μL，模板2 μL，引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，RNase free water補(bǔ)至終體積50 μL；PCR擴(kuò)增條件：第1階段：95 ℃預(yù)變性3 min；第2階段：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；第3階段：72 ℃延伸2 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.3.4 最適生長溫度的測(cè)定

將活化3 代并生長至對(duì)數(shù)期的新鮮菌液按2%接種比例接種到MRS肉湯中，為測(cè)定不同溫度條件對(duì)分離菌株生長的影響，將菌液在4、20、25、30、35、40 ℃培養(yǎng)24 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值（OD600nm）。

1.3.5 生長產(chǎn)酸能力測(cè)定

參照潘曉倩等[22]方法，活化3次的乳酸菌按2%的接種比例轉(zhuǎn)接至MRS肉湯中，于搖床培養(yǎng)，搖床條件設(shè)置為30 ℃、200 r/min。前18 h每2 h取樣測(cè)定菌液光密度值（OD600nm）以及pH值，18 h后每6 h取樣測(cè)定，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3次平行。

1.3.6 耐藥性測(cè)定

參照Maragkoudakis等[23-24]方法，選擇四環(huán)素、慶大霉素、青霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、卡那霉素和紅霉素進(jìn)行乳酸菌的耐藥性測(cè)試。將乳酸菌菌液（1%，V/V）接種至含有抗生素（2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024 μg/mL）的MRS肉湯中，混勻后轉(zhuǎn)移至96 孔板內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600nm并判斷菌株對(duì)抗生素的敏感性，其結(jié)果通過最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）（μg/mL）表示，耐藥性標(biāo)準(zhǔn)參照歐洲食品安全局耐藥折點(diǎn)水平[25]。

1.3.7 毒力基因測(cè)定

表1 毒力基因篩選引物Table 1 Primers used for screening of virulence factor genes

續(xù)表1

利用上述引物（表1）對(duì)乳酸菌分離株的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件參照Hossain等[26]方法，具體條件如下：94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃最終延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物最后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小，使用10 000 bp的標(biāo)記物作為分子質(zhì)量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.8 分離菌株抑菌性測(cè)定

1.3.8.1 分離菌株發(fā)酵液制備

參考Zoumpopoulou等[27]方法，使用分離菌株的發(fā)酵液用于研究其在體外對(duì)抗病原菌的拮抗活性。將分離菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，之后將培養(yǎng)基液體4 ℃、8 000 r/min離心20 min，然后通過微孔濾膜（0.22 μm）過濾以收集無細(xì)胞發(fā)酵液。

1.3.8.2 分離菌株抑菌性測(cè)定

為測(cè)定分離菌株對(duì)致病菌的拮抗能力，采用瓊脂擴(kuò)散法評(píng)估分離菌株的抗菌活性，并選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、單核細(xì)胞性李斯特菌1/2a血清型CMCC 54004、單核細(xì)胞性李斯特菌4b血清型ATCC 19115、大腸桿菌O157:H7 S2和金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為指示菌。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：在無菌培養(yǎng)皿中先傾倒15 mL胰蛋白胨大豆瓊脂，待其凝固后，再覆蓋5 mL含有1 g/100 mL瓊脂粉和6（lg（CFU/mL））指示菌的胰蛋白胨大豆肉湯。然后將牛津杯（d＝8 mm）插入雙層平板中，并在孔內(nèi)注入240 μL無細(xì)胞發(fā)酵液。在37 ℃培養(yǎng)18～24 h后測(cè)量每個(gè)抑制圈的直徑，每組平行測(cè)定6次。

1.3.9 分離菌株抗菌物質(zhì)的確定

為進(jìn)一步探究分離菌株的抗菌物質(zhì)，參照Zoumpopoulou[27]和Salehizadeh[28]等方法，分別采用2 mg/mL蛋白酶K、0.5 mg/mL過氧化氫酶和1 mol/L NaOH作為抑制劑處理發(fā)酵液，以檢測(cè)乳酸菌抑菌性是否來源于蛋白質(zhì)類代謝產(chǎn)物、H2O2或有機(jī)酸。通過觀察抑菌圈的直徑減少范圍顯示抑制劑的抑制作用。排除實(shí)驗(yàn)均在雙層平板上等距放置8 mm直徑牛津杯，孔內(nèi)分別填充240 μL乳酸菌發(fā)酵液和經(jīng)排除實(shí)驗(yàn)處理的發(fā)酵液，指示菌濃度設(shè)置為5（lg（CFU/mL）），平皿覆蓋陶瓦蓋后于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈，每組設(shè)置6個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

菌株序列應(yīng)用BLAST程序，在GenBank基因數(shù)據(jù)庫中比對(duì)測(cè)序結(jié)果，最終的數(shù)據(jù)集使用MEGA X進(jìn)行分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，非加權(quán)組平均法進(jìn)行聚類分析，以序列間差異數(shù)值作為單位長度。最適生長溫度和抑菌性測(cè)定相關(guān)指標(biāo)采用雙因素方差分析，使用IBM SPSS Statistics 26軟件的一般線性模型中單變量，選用最小顯著性差異法對(duì)雙因素的主效應(yīng)進(jìn)行多重比較，并以F檢驗(yàn)判斷雙因素交互作用的顯著性（P＜0.05，交互顯著）。結(jié)果使用SigmaPlot 14.0軟件作圖，并以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離與篩選

圖1 分離菌株的菌落和菌體形態(tài)特征Fig. 1 Colonial and morphological characteristics of isolated strains

研究從MRS+2% CaCO3共篩選分離得到43 株疑似菌株，經(jīng)純化后選出7 株活化性能好、具有明顯溶鈣圈、革蘭氏陽性、具備乳酸菌菌落和菌體形態(tài)特征以及接觸酶陰性的備選菌株作為研究對(duì)象。其編號(hào)分別為RS-13、RS-16、RS-24、RS-25、RS-32、RS-33和RS-41。研究通過對(duì)分離菌株的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)（圖1）觀察可知，7 株分離菌株菌落形態(tài)均為圓形、白色菌落，菌落大小均為2 mm以上，且質(zhì)地柔軟邊緣整齊，輕微隆起但不透明，均具備乳酸菌菌落特征。本研究中7 株分離菌株形態(tài)均為桿狀，成對(duì)排列，其中RS-41桿狀較為細(xì)長，上述分離株菌體形態(tài)具有一般乳桿菌屬的形態(tài)特征。

2.2 分離菌株的生化鑒定

由表2可知，7 株分離菌株均與標(biāo)準(zhǔn)菌株清酒乳桿菌清酒亞種（Lactobacillus sakeisubsp.sakei）BNCC185970的鑒定結(jié)果一致。該結(jié)果與沈雷[29]和Tsafrakidou[30]等對(duì)清酒乳桿菌的生理生化鑒定結(jié)果一致，均未對(duì)甘露醇、棉籽糖、松三糖、鼠李糖、山梨醇、木糖反應(yīng)呈陽性。根據(jù)上述結(jié)果初步判斷7 株分離菌株具備清酒乳桿菌生理生化特征。

表2 分離菌株的鑒定Table 2 Biochemical identification of the isolates

2.3 分離菌株的16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定

圖2 分離菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of the isolates

將分離菌株經(jīng)16S rDNA測(cè)序，均得到長度約為1 500 bp的序列，采用系統(tǒng)發(fā)育樹方法，通過進(jìn)化距離對(duì)乳酸菌進(jìn)行種水平鑒定，最終分析結(jié)果如圖2所示。本研究分離菌株與BLAST平臺(tái)上清酒乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性均在99.8%以上，序列分析表明，分離菌株序列均與清酒乳桿菌序列聚類，并結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果可基本判定7 株分離菌株為清酒乳桿菌。

2.4 分離菌株的最適生長溫度和產(chǎn)酸能力

表3 分離菌株最適生長溫度Table 3 Optimum growth temperatures of the isolates

由表3可知，乳酸菌株和溫度雙因素交互顯著（P＜0.05），7 株分離乳酸菌在25～35 ℃之間均能較好生長，在20 ℃以下或40 ℃以上時(shí)生長能力均受到不同程度抑制。7 株乳酸菌在不同生長溫度下的生長能力具有顯著差異，其中菌株RS-16和RS-25在所有溫度下均具有較好的生長能力。

根據(jù)7 株分離株的最適生長溫度結(jié)果，本研究在30 ℃條件下繼續(xù)探究了分離株的生長和產(chǎn)酸能力，結(jié)果如圖3所示。分離菌株生長遲滯期較短為0～4 h，在此間生長速度和產(chǎn)酸速度均較為緩慢，4～14 h期間為分離株的生長對(duì)數(shù)期，菌株快速生長并且大量生產(chǎn)有機(jī)酸，菌株活性在期間最強(qiáng)，培養(yǎng)基pH值顯著下降，14 h后達(dá)到對(duì)數(shù)末期，菌株生長速度逐漸減緩，進(jìn)入生長穩(wěn)定期，同時(shí)pH值趨于穩(wěn)定。本研究分離的菌株在生長和產(chǎn)酸趨勢(shì)與潘曉倩[22]及趙改名[31]等研究一致。在本研究中，不同菌株生長時(shí)期所持續(xù)的時(shí)間基本一致，但最終積累的細(xì)胞數(shù)量不同。菌株的生長能力與產(chǎn)酸能力相關(guān)，其中相同時(shí)間內(nèi)RS-16和RS-25富集的菌量較多，其產(chǎn)酸能力也較強(qiáng)，可將pH值降至4.2左右，而生長能力相對(duì)較弱的RS-33僅能將pH值降至5左右，在所分離的7 株菌中，有6 株可將培養(yǎng)基pH值降低到4.6以下，大部分菌株均具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

圖3 分離菌株生長曲線（A）和產(chǎn)酸曲線（B）Fig. 3 Growth curves (A) and acid-producing curves (B) of the isolates

2.5 分離菌株的耐藥性和毒力基因分析

耐藥性和耐藥基因的傳遞是威脅公共衛(wèi)生安全的重要因子，因此該指標(biāo)對(duì)生物保護(hù)菌的評(píng)價(jià)具有重要意義。分離菌株的MIC值及毒力基因檢測(cè)結(jié)果如表4所示。本研究分離的乳酸菌株對(duì)臨床重要的抗生素普遍敏感，而RS-41則表現(xiàn)出了對(duì)于紅霉素和慶大霉素的抗性，該結(jié)果與Maragkoudakis等[24]研究一致，該研究使用肉湯稀釋法對(duì)肉制品和乳制品中分離出的10 株具有潛在生物保護(hù)功能的乳酸菌進(jìn)行了耐藥分析，存在部分菌株對(duì)紅霉素和慶大霉素產(chǎn)生抗性。部分乳酸菌不能合成細(xì)胞色素的基本成分血紅素卟啉，因此缺乏細(xì)胞色素介導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（與氨基糖苷類抗生素的攝取相關(guān)）[32]，導(dǎo)致其對(duì)氨基糖苷類抗生素（如慶大霉素）耐藥[33]。由于該固有耐藥性沒有在細(xì)菌間傳遞的風(fēng)險(xiǎn)，這種“耐藥”的乳酸菌通常用于防止抗生素使用條件下的菌群失調(diào)，其與抗生素的聯(lián)合使用可以預(yù)防和治療腸道感染[15,34]。相反，同屬于乳酸菌的腸球菌由于其編碼四環(huán)素、紅霉素和氯霉素的Tn916-Tn1545家族轉(zhuǎn)座子被報(bào)道可以通過偶聯(lián)轉(zhuǎn)移到其他革蘭氏陽性菌中[35]，其作為生物保護(hù)菌的使用受到了限制。Hummel等[36]發(fā)現(xiàn)許多用于肉類發(fā)酵的乳酸菌，除對(duì)慶大霉素外，同時(shí)存對(duì)環(huán)丙沙星、鏈霉素、氨芐西林、氯霉素、青霉素G、四環(huán)素和紅霉素的耐藥菌株。乳酸菌的耐藥性由于菌株之間的差異會(huì)有所不同，如多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞壁自溶系統(tǒng)缺陷以及耐藥基因的存在都可能導(dǎo)致了菌株之間的差異[35]。與此同時(shí)，培養(yǎng)基中的成分也會(huì)影響到耐藥性的評(píng)估，例如在含有膽汁的培養(yǎng)基中乳酸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素會(huì)更敏感[36]，因此，在比較、分析不同報(bào)道耐藥性時(shí)應(yīng)明確測(cè)定方法、培養(yǎng)條件等。

表4 各抗生素對(duì)分離菌株的MIC和毒力基因檢測(cè)Table 4 MIC of antibiotics against the isolates and their virulence genes

大部分離菌株均未檢測(cè)出表1中常見的毒力基因，而RS-33則檢測(cè)具有cylLL基因，該基因與cylLS共同編碼溶細(xì)胞素的2個(gè)結(jié)構(gòu)亞基，與溶細(xì)胞素的表達(dá)、成熟、分泌和激活相關(guān)。值得注意的是，由于細(xì)菌致病性的產(chǎn)生需要多個(gè)系統(tǒng)協(xié)同運(yùn)作（如沙門氏菌毒力島），個(gè)別存在的毒力基因并非與致病性必然有關(guān)，例如聚集蛋白相關(guān)的agg和參與免疫逃避相關(guān)的esp等基因則與腸道定植有關(guān)，反而有助于其發(fā)揮益生作用[37-38]。本研究中除RS-41表現(xiàn)出耐藥性以及RS-33檢測(cè)具有cylLL基因以外，其他菌株均未表現(xiàn)出耐藥性或發(fā)現(xiàn)毒力基因存在，可作為生物保護(hù)菌備選菌株。另外，我國已出臺(tái)了在食品中應(yīng)用乳酸菌的安全性指導(dǎo)原則，如國家總局2020年發(fā)布的《保健食品原料用菌種安全性檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》。但是目前生物保護(hù)菌的概念還相對(duì)模糊，根據(jù)乳酸菌不同用途所進(jìn)行的安全性檢驗(yàn)仍需細(xì)致劃分，與乳酸菌相關(guān)的致病機(jī)理需要進(jìn)一步探討，為乳酸菌安全性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

2.6 分離菌株的抑菌性

以大腸桿菌O157:H7、單核細(xì)胞性李斯特菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌株，測(cè)定7 株分離菌株的抑菌效果，結(jié)果顯示乳酸菌菌株和指示菌株雙因素交互顯著（P＜0.05）（表5）。由表5可知，7 株分離菌株對(duì)所有指示菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑均大于8 mm，均產(chǎn)生拮抗作用，但不同菌株對(duì)不同指示菌的拮抗效果有較大差異：分離菌株對(duì)沙門氏菌抑菌效果最好（P＜0.05），其次為大腸桿菌O157:H7，最后為單核細(xì)胞性李斯特菌和金黃色葡萄球菌。這可能是因?yàn)椴煌闹甘揪鷮?duì)與乳酸菌的代謝物質(zhì)耐受能力、亞致死的環(huán)境脅迫（例如酸脅迫）下的應(yīng)激反應(yīng)不同[39]。Salah等[40]研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌比其他指示菌對(duì)乳酸菌代謝產(chǎn)物具有更強(qiáng)的耐受力。Cattaneo等[41]研究結(jié)果也顯示金黃色葡萄球菌在所有指示菌株中的拮抗效果不顯著，測(cè)試的所有乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出的抑菌效果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與較強(qiáng)的生產(chǎn)、產(chǎn)酸能力對(duì)應(yīng)，在不同分離菌株中，RS-16和RS-25對(duì)其抑制效果最好（P＜0.05）。鑒于以上結(jié)果，本研究以鼠傷寒沙門氏菌為指示菌，進(jìn)一步分析了RS-16和RS-25的主要抑菌產(chǎn)物。由表6可知，分離菌株發(fā)酵液經(jīng)蛋白酶K、H2O2酶處理后產(chǎn)生的抑菌圈范圍與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05），而經(jīng)NaOH處理后，菌株抑菌圈完全消失，證明菌株抑菌性來源于有機(jī)酸。同時(shí)驗(yàn)證了“分離菌株對(duì)于鼠傷寒沙門氏菌抑制效果較好，而單核細(xì)胞性李斯特菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果則相對(duì)較差的研究結(jié)果”：在單核細(xì)胞性李斯特菌中存在的谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)[42]以及金黃色葡萄球菌的轉(zhuǎn)錄起始因子（σB）[43]會(huì)促進(jìn)其耐酸性，進(jìn)而降低乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)其的抑菌效果。與大腸桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌相比，鼠傷寒沙門氏菌缺乏谷氨酸耐酸代謝系統(tǒng)，因此耐酸性存在一定缺陷[44]。大量相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸（尤其是乳酸和乙酸）對(duì)廣泛的微生物具有抑制作用，其可造成較低的pH值環(huán)境，并且，有機(jī)酸分子之間還存在協(xié)同作用，例如乳酸造成的酸化有利于乙酸非解離形式的存在，從而增強(qiáng)抗菌活性[45]。此外，除有機(jī)酸以外，乳酸菌可能存在其他多種抑菌途徑（如產(chǎn)生胞外多糖、細(xì)菌素，營養(yǎng)競(jìng)爭抑制等），其抑菌機(jī)制仍需全面探究與驗(yàn)證。

表5 分離菌株對(duì)致病菌的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of the isolated strains on pathogenic bacteria

表6 排除各假定抗菌物質(zhì)對(duì)菌株抑菌能力的影響Table 6 Influence of protease, catalase or alkaline treatment on the antibacterial ability of the selected strains

3 結(jié) 論

可作為生物保護(hù)菌的乳酸菌分離源極為廣泛，但以牛肉源作為分離源的研究在相關(guān)研究領(lǐng)域鮮有報(bào)道，并且真空包裝是生鮮牛肉普遍的包裝方式，具有良好的應(yīng)用前景。本研究對(duì)真空包裝牛肉中具有生物保護(hù)功能的乳酸菌進(jìn)行分離篩選，共得到7 株具有生物保護(hù)潛力的菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA分子生物學(xué)鑒定后，7 株乳酸菌均可鑒定為清酒乳桿菌。由最適生長溫度、生長產(chǎn)酸能力結(jié)果可知RS-25和RS-16具有較好的生長產(chǎn)酸能力，為其發(fā)揮生物效果提供了前提條件。通過細(xì)菌耐藥性測(cè)試和毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)除菌株RS-41對(duì)紅霉素和慶大霉素產(chǎn)生抗性，以及菌株RS-33發(fā)現(xiàn)存在cylLL基因外，其他菌株均未檢出耐藥性和毒力基因。雖然對(duì)不同目標(biāo)菌屬的拮抗程度不同，但7 株分離菌株對(duì)所有目標(biāo)指示菌的拮抗均有顯著效果。其中RS-25和RS-16對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑制效果最好。進(jìn)一步的抑菌物質(zhì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)證實(shí)了有機(jī)酸是分離出生物保護(hù)菌的重要抑菌物質(zhì)之一，但是所篩選的保護(hù)菌株代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸是否會(huì)造成牛肉酸敗、具體應(yīng)用方法，亟待進(jìn)一步的接種實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究表明真空包裝牛肉可作為生物保護(hù)菌良好的分離源，其中分離得到的清酒乳桿菌RS-25和RS-16具有良好的生物保護(hù)潛力，為生物保護(hù)菌的開發(fā)應(yīng)用提供了菌株儲(chǔ)備和理論依據(jù)。