石乙欣，馮耀元，邢曉婭，劉宣辰，練旭冬，毛瑩瑩，韓英浩，金美華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

糖尿病目前是嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病之一，假如不能及時進(jìn)行治療，可發(fā)展成心、腦、腎等多器官并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人們健康[1]。胰島素治療存在不可控性，無法隨時根據(jù)患者的身體狀態(tài)做出調(diào)整，還有可能影響患者身體狀態(tài)，造成損傷[2]。據(jù)估計，到2035年，全球糖尿病患者數(shù)量將超過5.5億人[3]。因此，研究出經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且有降血糖的藥物迫在眉睫。

糖尿病的發(fā)病原理主要包括三個方面，首先是根本上胰島素量的不足，不能夠有效控制血糖。再就是受體細(xì)胞對胰島素識別能力差，胰島素?zé)o法有效調(diào)控。第三是胰島素自身結(jié)構(gòu)缺陷，從而引起的代謝失衡。該病會導(dǎo)致無法及時進(jìn)行糖代謝，臨床癥狀表現(xiàn)為三多一少[4]。糖尿病會影響組織器官正常工作，形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)也會發(fā)生病變，并伴隨一系列并發(fā)癥，威脅糖尿病患者的健康。目前糖尿病治療局限在藥物治療、飲食與運(yùn)動穩(wěn)定控制。治療仍有很大的局限性。在飲食和運(yùn)動方面治療更多的是維持現(xiàn)狀，不能有效治療，并且存在不穩(wěn)定性。重度糖尿病患者往往只能通過胰島素注射緩解病情，也僅僅是能夠維持，注射胰島素會導(dǎo)致患者低血糖、組織水腫、過敏等不良反應(yīng)，而且糖尿病人在治療的過程中也會遭受痛苦的折磨。目前，糖尿病不僅影響著發(fā)達(dá)國家的經(jīng)濟(jì)還給社會帶來一定負(fù)擔(dān)，而同時給作為如中國、印度等的發(fā)展中國家的社會發(fā)展和經(jīng)濟(jì)建設(shè)等方面制造了難題和挑戰(zhàn)。

在探索研究糖尿病的過程中，發(fā)現(xiàn)或合成了許多能夠治療糖尿病的藥物，但是各有局限性[5]。在胰島素探索的道路上從人工胰島素到重組胰島素，再到胰島素類似物，胰島素相關(guān)技術(shù)不斷突破。胰島素可以靶向外周相關(guān)組織代謝活動從而調(diào)控葡萄糖水平[6]，能夠直接有效的控制機(jī)體血糖，但患者在自行注射胰島素過程中會發(fā)生用量過高導(dǎo)致低血糖的癥狀發(fā)生。不僅如此，目前市面上治療糖尿病的藥物或多或少都會都人體造成損害，磺脲類藥物就是其中之一，例如；格列吡嗪和格列本脲就是其中的典型藥物，其能夠提高胰島素分泌水平，長期使用磺脲類藥物會引起患者溶血性貧血等疾?。浑p胍類藥物是另外一種公認(rèn)的藥物類型，其作用機(jī)理是提高葡萄糖在人體的分解速率，降底葡萄糖利用率，還可以提高葡萄糖敏感度，加速糖代謝，長期使用該類藥物會對胃腸以及血小板造成損傷[7]。因此，通過研究一種天然藥物來加強(qiáng)糖尿病的治療作用，已成為糖尿病研究的一個重要領(lǐng)域，并會受到世界各國醫(yī)學(xué)界的普遍關(guān)注[8]。冬瓜皮作為中國傳統(tǒng)中藥[9]，其提取物中含有游離芳香化合物和糖基芳香化合物[10]，可能對糖尿病有治療效果。

因此，研究采用129/SVJ野生型小鼠為研究對象，利用鏈脲佐菌素建立糖尿病模型[11]，冬瓜皮提取物灌胃治療，制作病理組織切片，并采用H&E染色探究冬瓜皮提取物的降糖效果以及對胰腺、肝臟、腎臟形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)影響[12]，初步探討冬瓜皮提取物對糖尿病的治療效果，為探究冬瓜皮提取物治療糖尿病具體機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

試驗(yàn)動物為SPF級野生型（WT）129/SvJ小鼠24只雌雄各半，每籠三只小鼠，自由采食飲水，12 h光周期飼養(yǎng)，濕度維持在50%~60%。

1.1.2 主要試劑

冬瓜皮提取物；鏈脲佐菌素（Solarbio）；蘇木色精（阿拉丁生化公司）；伊紅Y（阿拉丁生化公司）；氨水（天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑）；無水乙醇（泉瑞試劑公司）；冰乙酸（天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑）；石蠟（德國萊卡公司）；10%中性福爾馬林（Solarbio）；中性樹膠（上海懿洋儀器公司）；二甲苯（泉瑞試劑公司）；蓋玻片、載玻片（世泰公司）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建糖尿病小鼠模型

將24只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)取6只作為對照組，其余18只構(gòu)建STZ糖尿病小鼠模型，斷糧12 h（不斷水），稱量并記錄空腹小鼠體重。造模組向小鼠腹腔內(nèi)注射1%鏈脲佐菌素溶液，（200 mg·L-1，使用pH4.5的檸檬酸緩沖液配制），對照組腹腔注入相同體積的0.9%氯化鈉注射液。尾尖采血檢測注射后第5天禁食12 h（不禁水）的小鼠空腹血糖值，糖尿病小鼠空腹血糖值≥11.1 mmol·L-1視為造模成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 進(jìn)行冬瓜皮提取物治療

將造模成功的小鼠隨機(jī)分配，分為為糖尿病模型組和冬瓜皮提取物治療組（每組各6只小鼠），冬瓜皮提取物治療組每天灌胃給藥（濃度：400 mg·L-1）1 mL，空白對照組和實(shí)驗(yàn)對照組灌胃同等體積的純凈水，連續(xù)給藥4周，每日觀察小鼠外觀并記錄各組飲水量和飲食量，每三天記錄小鼠血糖值和體重。

1.2.3 葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)

冬瓜皮提取物治療四周結(jié)束后，將小鼠禁食12 h，尾尖采血測量小鼠空腹血糖值，將所測得結(jié)果記為0 min，再通過腹腔注射葡萄糖溶液（2 g·L-1，0.9%生理鹽水）100 μL提高小鼠血糖濃度，在腹腔注射葡萄糖溶液后30 min至120 min時（每隔30 min）尾尖采血測量小鼠血糖值，觀察小鼠葡萄糖耐受能力變化。

1.2.4 小鼠胰島、肝臟和腎臟組織H&E染色

將小鼠處死后，使用生理鹽水心臟灌流，排出組織中存留血液，避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取出胰腺、肝臟、腎臟，生理鹽水沖洗，福爾馬林固定24 h。固定結(jié)束后，從福爾馬林中取出，對組織進(jìn)行修整，將剖面向上放入包埋盒中并放進(jìn)玻璃缸中流水沖洗1.5 h。沖洗結(jié)束后，用脫水機(jī)進(jìn)行常規(guī)脫水，脫水結(jié)束后進(jìn)行石蠟包埋，-20℃冷凍臺加速石蠟?zāi)蹋窠Y(jié)束后放入-20℃冰箱冷凍24 h。冷凍結(jié)束后進(jìn)行切片，將蠟塊切成5 μm薄片，在攤片機(jī)中將薄片攤平，用載玻片挑起石蠟組織薄片，自然晾干4~6 h，晾干后進(jìn)行常規(guī)H&E染色，自然晾干12 h。最后在多功能顯微鏡下觀察切片并采集照片[13]。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建糖尿病小鼠模型

研究利用腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠糖尿病模型，由表1數(shù)據(jù)可看出，在注射STZ溶液后禁食的五天所測得的血糖值，模型組的血糖值均高于對照組的血糖值，血糖值有上升趨勢，在禁食的3、4、5 d所測得的血糖值均≥11.1 mmol·L-1，糖尿病小鼠模型造模成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 葡萄糖對糖尿病小鼠模型的構(gòu)建情況Table 1 Construction of glucose on diabetic mouse model

2.2 冬瓜皮提取物對血糖的影響

從表2中可以看出冬瓜皮提取物治療3 d就起到了降糖效果，干預(yù)12 d后，對照組血糖持續(xù)升高，冬瓜皮提取物治療組小鼠血糖維持較穩(wěn)定，且從圖1中可以看出對照組和冬瓜皮提取物治療組的血糖值的變化差異。說明冬瓜皮提取物對糖尿病小鼠有很好的降糖效果

表2 冬瓜皮提取物對糖尿病小鼠血糖水平的影響Table 2 Effect of wax gourd peel extract on blood glucose level of diabetic mice

圖1 對照組和冬瓜皮提取物治療組血糖變化散點(diǎn)圖Fig.1 Blood glucose changes in the control group and wax gourd skin extract treatment groups

2.3 小鼠的葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)

由表3和圖2表現(xiàn)，在給藥4周后，小鼠禁食12 h，腹腔注入葡萄糖溶液（2 g·L-1，0.9%生理鹽水）100 μL時，30 min時差異最為顯著，可以明顯看出冬瓜皮提取物對小鼠葡萄糖耐受能力的提高。隨著時間延長60 min處差異縮小，90 min時兩組數(shù)值十分接近，說明冬瓜皮提取物治療后，相較于實(shí)驗(yàn)對照組，冬瓜皮治療組葡萄糖耐受能力明顯提高，在30 min處最為顯著。說明冬瓜皮提取物治療后小鼠的糖耐受能力提高。

表3 冬瓜皮提取物對小鼠糖耐量的影響Table 3 Effect of wax gourd peel extract on glucose tolerance in mice

圖2 小鼠葡萄糖耐受曲線Fig.2 A glucose tolerance curve in mice

2.4 冬瓜皮提取物對糖尿病小鼠胰腺的組織病理學(xué)的影響

胰腺H&E染色觀察結(jié)果如圖3所示，空白對照組的胰島胞漿飽滿、體積大、邊界清晰、形狀規(guī)則，胰島內(nèi)細(xì)胞飽滿，大小均勻[14]；實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠的胰島數(shù)量明顯減少，形態(tài)不規(guī)則細(xì)胞排列紊亂，并且胰島體積減小，血管輕度增生；冬瓜皮提取物治療組小鼠胰島體積較模型組增大，其胰島內(nèi)細(xì)胞大小更加均勻，排列較為有序，胞漿較為飽滿，有逐漸恢復(fù)正常的趨勢。說明冬瓜皮提取物對糖尿病小鼠胰腺有顯著修復(fù)效果，對糖尿病小鼠有治療效果。

圖3 冬瓜皮提取物對小鼠胰腺組織病理學(xué)的影響Fig.3 Effects of wax gourd skin extract on pancreatic histopathology in mice

2.5 冬瓜皮提取物對糖尿病小鼠肝臟的組織病理學(xué)的影響

各組小鼠的肝臟H&E的染色結(jié)果如圖4所示?？瞻讓φ战M小鼠的肝臟仍然保持索狀結(jié)構(gòu)，并且肝細(xì)胞飽滿[15]；糖尿病模型組的小鼠并未觀察到肝臟索狀結(jié)構(gòu)，其肝細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的腫脹和空泡；冬瓜皮治療組小鼠索狀結(jié)構(gòu)開始恢復(fù)，細(xì)胞較為飽滿，細(xì)胞排列緊密，空泡較實(shí)驗(yàn)對照組較少。說明冬瓜皮提取物對糖尿病小鼠的肝臟也具有治療修復(fù)效果，能夠改善糖尿病帶來的肝臟損傷。

2.6 冬瓜皮提取物對糖尿病小鼠腎臟的組織病理學(xué)的影響

各組小鼠的腎臟H&E的染色結(jié)果如圖5所示?？瞻讓φ战M的腎小球和腎小管規(guī)則并排列整齊，腎小球中沒有出現(xiàn)毛細(xì)血管基底膜或基質(zhì)的增生現(xiàn)象以及腎小球肥大現(xiàn)象，同時也沒有出現(xiàn)變性、壞死以及纖維化的現(xiàn)象；腎小管結(jié)構(gòu)也比較的完整，間質(zhì)內(nèi)沒有充血以及炎性細(xì)胞的浸潤；腎髓質(zhì)集合管結(jié)構(gòu)完整，并且無變性、壞死和脫落的現(xiàn)象[16]。而糖尿病模型組的腎小球發(fā)生了萎縮，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死以及纖維化，腎小管呈蛋白管型，間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤。冬瓜皮提取物治療組的腎組織病理損傷與糖尿病治療組相比腎小球、腎小管排列較為整齊，變性壞死現(xiàn)象有所改善，毛細(xì)血管基底膜或基質(zhì)增生以及腎小球肥大有所減少。

圖4 冬瓜皮提取物對小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響Fig.4 Effects of wax gourd skin extract on liver histopathology in mice

圖5 冬瓜皮提取物對小鼠腎臟組織病理學(xué)的影響Fig.5 Effects of wax gourd skin extract on renal histopathology in mice

3 結(jié)論與討論

糖尿病及并發(fā)癥屬于人體復(fù)雜性、綜合性、多系統(tǒng)性代謝性慢病，胰島素缺乏本質(zhì)上是胰腺胰島B細(xì)胞代謝障礙所致的。即屬于內(nèi)分泌系統(tǒng)胰腺器官胰島細(xì)胞自身代謝中氨基酸合成轉(zhuǎn)化為激素（胰島素、胰高血糖素等）途徑發(fā)生了障礙[17-18]。胰島素作用的靶向器官是肝臟，胰島素抵抗是2型糖尿病患者的主要發(fā)病原因[13]。糖尿病還能夠誘發(fā)腎臟并發(fā)癥，糖尿病性腎損傷也經(jīng)常會伴隨糖尿病出現(xiàn)[19]。所以在探究糖尿病的過程中，胰腺、肝臟、腎臟的變化以及內(nèi)在機(jī)理值得深入探究。STZ作為糖尿病動物模型常用誘導(dǎo)劑，藥物在損害胰腺的同時能夠造成肝損傷[20-21]。

通過對小鼠胰腺、肝、腎的HE染色過程，發(fā)現(xiàn)冬瓜皮提取物能夠有效的改善因STZ誘導(dǎo)糖尿病所造成的各種組織損傷，例如細(xì)胞數(shù)量增多排列緊密，索狀結(jié)構(gòu)等功能性結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)?？梢哉f明，冬瓜皮提取物可以有效修復(fù)治療STZ誘導(dǎo)模型小鼠胰腺、腎臟、肝臟形態(tài)學(xué)以及功能性損傷，有效地恢復(fù)各個器官的功能，對糖尿病的治療有極大的幫助。并且冬瓜皮提取物在治療的第3天就可以降低小鼠血糖恢復(fù)到正常水平并維持相對穩(wěn)定，并且能夠提高葡萄糖耐受量，可以說明冬瓜皮提取物對糖尿病的治療作用，為糖尿病人的治療提供一種新的可能。同時冬瓜皮也是一味傳統(tǒng)中藥，“味甘，性涼，無毒”這是《本草再新》中對冬瓜皮的描述，研究也能夠?yàn)閭鹘y(tǒng)中醫(yī)治療糖尿病提供新的思路。

研究僅對冬瓜皮提取物進(jìn)行研究，治療效果十分明顯，但是具體有效成分以及作用機(jī)制尚不清楚，對有效成分的探究可能進(jìn)一步提高治療效果，在查閱論文中發(fā)現(xiàn)冬瓜皮中的多糖、黃酮、多酚類物質(zhì)有較大的可能是治療糖尿病的有效物質(zhì)[23]，希望未來能夠發(fā)現(xiàn)冬瓜皮提取物治療糖尿病的有效成分。

研究結(jié)果為冬瓜皮提取物對糖尿病小鼠治療效果和糖耐量以及相關(guān)組織器官修復(fù)作用的初探，對于胰島素耐量、毒副作用以及相關(guān)信號通路等將會在后續(xù)研究中做出針對性開展。