歐陽曉倫，陳昭，，竇鑫，張洪奇，高亞梅，晏磊，邱化蛟，王偉東

（1.黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點實驗室/黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心；3江蘇進(jìn)化樹生物科技有限公司；4中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所）

生物防治（biological control）是利用有益生物及其產(chǎn)物控制或消滅有害生物的防治技術(shù)，常用于植物病蟲害的治理。芽孢桿菌具有形成芽孢、產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)以及促進(jìn)植物生長的特性，這些特性使芽孢桿菌屬被認(rèn)為是一種很有前途的生物防治菌[1-2]。遲惠榮等[3]從多花黃精的根部分離出貝萊斯芽孢桿菌ZJU-3，該菌能夠產(chǎn)生表面活性素、泛革素和伊枯草菌素等脂肽類化合物，其對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）具有拮抗作用。貝萊斯芽孢桿菌能夠有效預(yù)防由子囊菌引起的植物真菌性病害，例如，從種植番茄的園藝大棚土壤中分離到貝萊斯芽孢桿菌S6，發(fā)酵液原液和100倍稀釋液對由番茄早疫病原菌（Alternaria solani）和灰霉病原菌（Botrytis cinerea Pers.）引起番茄早疫病的田間防治效果分別為80.83%和64.88%[4]。Sun等[5-6]從梨園根際土壤中分離到一株貝萊斯芽孢桿菌L-1，其對貝倫格葡萄座腔菌和粉紅單端孢菌等梨輪紋病菌的抑制率達(dá)到了76.55%。如今，以植物有益的芽孢桿菌為基礎(chǔ)的制劑是目前生物農(nóng)藥市場上使用最廣泛的制劑[7]。貝萊斯芽孢桿菌最初于西班牙貝萊斯河水中分離[8]，普遍存在于植物組織、水體、土壤、空氣及發(fā)酵食品等環(huán)境中[9-11]。貝萊斯芽孢桿菌具有幾個明顯的優(yōu)勢，包括特定地定植在給定作物的某些部分，形成生物膜，產(chǎn)生抗微生物代謝物，并誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性[12-14]。鐮刀菌屬擁有多種致病菌，可引起植物的萎蔫、穗腐和根腐等多種病癥，如小麥赤霉病、玉米穗粒腐病和根腐病，已成為世界上重要的致病真菌之一[15]。彎孢菌能侵染水稻，高粱、玉米、番茄、辣椒、香蕉、唐菖蒲等多種作物及花卉，甚至可引起嚴(yán)重的病害[16]。彎孢菌是引起玉米葉斑病的主要病原菌，其中新月彎孢菌的致病性最強(qiáng)[17-18]。水稻易受到各種病害的危害，其中最具破壞性的是稻瘟病，稻瘟病每年造成水稻產(chǎn)量損失10%～30%，在疾病流行期間產(chǎn)量損失可達(dá)到50%[19-20]。

為了分離出對多種植物病害真菌具有生防潛力的拮抗細(xì)菌，從銀杏果實外種皮中分離到一株貝萊斯芽孢桿菌YX-3，并進(jìn)行了對藤倉鐮刀菌等幾種菌的拮抗作用研究，期待為該株作為生防菌的菌劑生產(chǎn)及田間病害生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株分離樣品來源

供菌株分離篩選的銀杏外種皮來源江蘇省徐州市邳州市銀杏種植林。

1.1.2 試驗病原菌

試驗的供試病原菌灰梨孢菌（Pyricularia oryzae）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、藤倉鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）、新月彎孢菌（Curvularia lunata）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）由黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、V-P培養(yǎng)基、甲基紅培養(yǎng)基、檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基、葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基（含酚紅指示劑）、基礎(chǔ)培養(yǎng)基[21-22]。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株YX-3的分離

銀杏外種皮的表面消毒：首先，挑選外表皮完好的銀杏果實，用純凈水沖洗表面附著的沙塵及土壤等大顆粒雜質(zhì)，用濾紙吸干水分。然后對銀杏果實進(jìn)行表面消毒，第一步在超凈臺中，將銀杏果實放在含有效氯1%的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min，接著使用無菌水緩慢充分沖洗5次；第二步使用75%乙醇溶液浸泡3 min，接著使用無菌水緩慢充分洗滌3次；最后使用1%升汞浸泡1 min，接著用無菌水緩慢充分沖洗5次。

表面消毒效果驗證：取最后一次沖洗后的廢液30 μL分別在PDA及LB培養(yǎng)基進(jìn)行涂布，置于28℃中培養(yǎng)7 d，觀察是否有菌落的生長。

菌株YX-3分離、純化：在超凈臺中將表面消毒后的銀杏果實剝離其果核，將外種皮的果肉部分貼附在LB培養(yǎng)基及PDA培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基設(shè)5個重復(fù)，然后置于25℃黑暗培養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，待有菌落生長，馬上使用接種針挑取，在LB和NA培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，直至分離純化出單一的菌落。

1.2.2 菌株YX-3形態(tài)學(xué)及生理生化特性研究

參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》的研究方法，對菌株YX-3分別進(jìn)行淀粉水解試驗、明膠液化試驗、V-P試驗、甲基紅試驗、硫化氫產(chǎn)氣試驗、檸檬酸鹽試驗、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗、碳源利用試驗、接觸酶利用試驗，對菌株YX-3進(jìn)行生理生化特性研究[21-22]。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取菌體DNA，通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，送上海派森諾科技有限公司進(jìn)行測序。用BLAST軟件將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析。

1.2.4 貝萊斯芽孢桿菌YX-3的生長曲線測定

將貝萊斯芽孢桿菌YX-3接種在NA固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h，以較大量挑取貝萊斯芽孢桿菌YX-3的菌落接種于100 mL/250 mL NA液體培養(yǎng)基，28℃，200 rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h得貝萊斯芽孢桿菌YX-3種子液。取貝萊斯芽孢桿菌YX-3種子液以1%接種量接種于100 mL/250 mL NA液體培養(yǎng)基，28℃，200 rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)，重復(fù)3組。每間隔6 h取樣1 mL，使用紫外分光光度計測OD600值，使用Graphpad prism 8軟件作圖。

1.2.5 貝萊斯芽孢桿菌YX-3對6種病原菌的抑菌活性

取已于PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d的試驗病原菌，在菌落最外周處使用φ6.5mm打孔器打取菌餅，接種在空白PDA培養(yǎng)基中心處，置于28℃培養(yǎng)3 d，將已培養(yǎng)24 h的菌株YX-3點樣接種于距離菌餅中心25 mm處，以只接種病原菌的PDA培養(yǎng)基作為空白對照組，每種病原菌重復(fù)3組，置于28℃繼續(xù)培養(yǎng)7 d。觀察病原菌生長直徑。

抑菌率公式如下：抑制生長率（%）=（對照組凈生長直徑-處理凈生長直徑）/對照組凈生長直徑×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用軟件IBM SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較（LSD）、鄧肯（Duncan）法進(jìn)行樣本間差異顯著性分析，使用Graphpad prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌YX-3形態(tài)學(xué)及生理生化特性研究

貝萊斯芽孢桿菌YX-3菌落呈乳白色，邊緣光滑，培養(yǎng)5 d后菌落由飽滿轉(zhuǎn)變?yōu)橹行奶幩?，革蘭氏染色結(jié)果為陽性（見圖1），菌體呈桿狀，大小約0.5×3.1 μm（圖1-A），芽孢大小大小約為0.5×1.0 μm（圖1-B）。生理生化試驗結(jié)果如表1所示。

圖1 貝萊斯芽孢桿菌YX-3的菌落形態(tài)及革蘭氏染色（×100）Fig.1 Colony morphology and gram staining of Bacillus velezensis YX-3（×100）

表1 貝萊斯芽孢桿菌YX-3生理生化試驗結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test results of Bacillus velezennsis YX-3

2.2 貝萊斯芽孢桿菌YX-3的生長曲線測定

如圖2所示，0~24 h貝萊斯芽孢桿菌YX-3的增長速度較慢，為其延緩期。24~48 h其增長速度較快，為對數(shù)期。48~72 h細(xì)胞數(shù)幾乎不變，為其平穩(wěn)期，72 h后OD開始下降，是由于其細(xì)胞數(shù)的減少及芽孢的形成，芽孢的吸光值低于活體細(xì)胞，故為衰亡期。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將菌株YX-3測序后，NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對，比對結(jié)果顯示：菌株YX-3為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezennsis）；將菌株YX-3的序列通過MAGE 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。

圖2 貝萊斯芽孢桿菌YX-3的生長曲線Fig.2 The growth curve of the of Bacillus velezensis YX-3

圖3 貝萊斯芽孢桿菌YX-3及相關(guān)菌株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Bacillus velezensis YX-3 and its related strains

2.4 貝萊斯芽孢桿菌YX-3對6種病原菌的抑菌活性

貝萊斯芽孢桿菌YX-3對6種病原菌均表現(xiàn)出拮抗作用，其中一組對峙試驗如圖4所示，抑菌率均在50.0%以上。貝萊斯芽孢桿菌YX-3對藤倉鐮刀菌的拮抗作用較強(qiáng)，抑菌率為69.19%±0.24%。對灰梨孢菌、禾谷鐮刀菌、新月彎孢菌、串珠鐮刀菌及尖孢鐮刀菌的抑菌率分別為63.74%±0.68%、68.02%±0.89%、64.92%±0.49%、66.28%±0.03%；對新月彎孢菌的拮抗作用較弱，抑菌率為60.47%±0.09%。

圖4 貝萊斯芽孢桿菌YX-3對6種植物病原菌平板對峙Fig.4 The antagonism of the Bacillus velezennsis YX-3 to 6 plant diseases

圖5 貝萊斯芽孢桿菌YX-3對6種病原菌的抑菌率（P<0.01）Fig.5 Inhibition rate of Bacillus velezensis YX-3 to 6 kinds of pathogens（P<0.01）

3 結(jié)論

芽孢桿菌作為一類防治植物病害的重要生物資源，其主要抑菌物質(zhì)來源于自身產(chǎn)生的蛋白、脂肽、揮發(fā)類物質(zhì)，并能促使植株分泌一定的拮抗物質(zhì)及促生長物質(zhì)[23]。此外，芽孢桿菌次級代謝物能誘導(dǎo)植物對潛在的植物病原菌產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性，部分產(chǎn)酸芽孢桿菌還能增強(qiáng)作物的抗逆性[24-25]。貝萊斯芽孢桿菌在早期時被認(rèn)定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的同物異名種[26]，Dunlap和Fan等[27-28]研究表明，解淀粉芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌（Bacillus.siamensis）和貝萊斯芽孢桿菌（包括Bacillus.velezensis、Bacillus.methylotrophicus和Bacillus.amyloliquefaciens sp.Plantarum）應(yīng)保持其自身物種的分類地位。貝萊斯芽孢桿菌主要從植物和土壤中分離，并展現(xiàn)出對植物病原真菌的拮抗作用。李永麗等[29]分離自新疆野蘋果的內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌Mr12對南天竹炭疽病菌、小麥赤霉病菌及葡萄座腔菌等多種植物病原菌具有抑制作用，其中以對南天竹炭疽病菌的抑菌效果最強(qiáng)達(dá)91.17%。貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1從梓樹中分離，其產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物能有效抑制茄鏈格孢菌、葡萄孢菌、桃褐腐病菌，以對葡萄孢菌的抑制率達(dá)93.8%[30]。貝萊斯芽孢桿菌XT-1由Marta等[31]從鹽堿土地中分離出，其對桃褐腐病菌的抑菌率超過80%。Myo等[32]對分離自青海祁連山土壤的芽孢桿菌NKG-2的代謝產(chǎn)物對尖孢鐮刀菌的抑制作用為60%，代謝產(chǎn)物中的揮發(fā)性物質(zhì)對禾谷鐮刀菌的抑制率為57%。貝萊斯芽孢桿菌HC6分離于健康仔豬的腸道，其對禾谷鐮刀菌的抑制能力最強(qiáng)，抑制率約為60.3%[33]。貝萊斯芽孢桿菌8-4對加利鏈霉菌、燕麥鐮刀菌和辣椒炭疽病菌等馬鈴薯病原菌均有抑制作用，其對辣椒炭疽病菌的拮抗活性最高67.84%[34]。

綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌已從多種環(huán)境中分離出來，并展示出對植物病原菌的抑制作用，但由于菌株特異性基因簇的存在，不同菌株的活性可能存在差異，因此，由于產(chǎn)生了特殊的酶和代謝物，它們在抑制病原體和促進(jìn)植物生長等方面都起著重要的作用[35-36]。目前，在玉米真菌病害防治中使用的微生物菌株主要為蠟狀芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌及假單胞菌等[37]，其中蠟狀芽孢桿菌B25在PDA中對輪枝鐮刀菌的抑制率僅有53%，但其菌劑于田間試驗中，將由輪枝鐮刀菌引發(fā)的莖腐和穗腐病分別降低了50%和76.3%[38]。研究中的貝萊斯芽孢桿菌YX-3分離自銀杏外種皮，該菌株在平板對峙試驗中，對引起玉米、水稻及大豆等作物根腐病害的鐮刀菌及灰梨孢菌等有抑制作用，其抑菌率達(dá)60%以上，對引起玉米根腐及穗腐病害的藤倉鐮刀菌，其抑菌率達(dá)69.19%，一方面，證實了貝萊斯芽孢桿菌YX-3的抗菌廣譜性，對由多種鐮刀菌共同侵染所致的根腐及穗腐具有潛在的防治作用，另一方面其在平板對峙中有較好的抑菌效果，其有望于大田試驗和大田生產(chǎn)中得到應(yīng)用。研究拓展了其在玉米、水稻及小麥等重要糧食作物的微生物病害防治。后續(xù)研究將在研究基礎(chǔ)上，提取、分離純化菌株發(fā)酵液的主要抑菌活性成分，深入探究貝萊斯芽孢桿菌YX-3的抑菌機(jī)理、防病效應(yīng)及其穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

從銀杏外種皮中分離獲得的菌株YX-3，經(jīng)鑒定確定為貝萊斯芽孢桿菌，其對藤倉鐮刀菌、灰梨孢菌、禾谷鐮刀菌、新月彎孢菌、串珠鐮刀菌及尖孢鐮刀菌抑菌率均超過60%，貝萊斯芽孢桿菌YX-3對引起禾本科作物病害的真菌有較好抑制效果，對藤倉鐮刀菌的抑制能力較強(qiáng)，而對新月彎孢菌較弱。