劉煥成，趙強(qiáng)，杜艷麗，王潔琦，張文慧，韓毅強(qiáng)，姜?jiǎng)P巖，杜吉到

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；3.北大荒集團(tuán)黑龍江尖山農(nóng)場(chǎng)有限公司）

大豆作為蛋白質(zhì)和油料作物在世界范圍廣泛種植。除此之外，大豆還是天然維生素E（VE）的主要來(lái)源。VE又稱生育酚，黃色粘稠性液體，不溶于水，溶于有機(jī)溶劑。在光照、堿性條件、氧氣和金屬離子中容易分解[1-2]。VE包括α-、β-、γ-和δ-生育酚及其相應(yīng)的生育三稀酚。α-生育酚在大豆籽粒中含量較低，但活性最高，且更易被人體吸收并保留在細(xì)胞中，VE含量目前以α-生育酚含量為標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)報(bào)道，提高α-生育酚攝入量有利于抑制或改善癌癥[3-4]、心血管病[2，5]、眼部疾病[6-7]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]、肌肉膜修復(fù)[8]、肝功能[9]和肺功能[10]等疾病的發(fā)病率。

由于醫(yī)療和保健作用，大豆籽粒VE的價(jià)值越來(lái)越受到消費(fèi)者和相關(guān)產(chǎn)業(yè)重視。東北是我國(guó)大豆主產(chǎn)區(qū)，從南到北氣候差異較大、生態(tài)區(qū)分布多樣、環(huán)境條件多變。據(jù)報(bào)道，環(huán)境因素對(duì)生育酚含量有巨大的影響[11-12]，環(huán)境條件會(huì)造成植物內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量的大幅度改變[13]。但是目前針對(duì)東北環(huán)境條件對(duì)大豆VE含量影響的研究還鮮有報(bào)道。研究利用重組自交系群體及其親本兩年三地的氣象條件和VE含量表型數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析研究，以期了解氣候因素對(duì)大豆籽粒VE含量的影響，為指導(dǎo)大田生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

研究以富含維生素E的大豆品種北豐9和低維生素E含量大豆品種Freeborn為親本衍生的238份F6：7重組自交系為材料。重組自交系群體及其親本2013年和2014年種植于長(zhǎng)春（43.86 °N，125.35 °E）、哈爾濱阿城區(qū)（45.33 °N，127.00 °E）和哈爾濱呼蘭區(qū)（46.04 °N，126.73 °E）三個(gè)地點(diǎn)。田間采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，三次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種1行，行長(zhǎng)3 m，壟寬0.67 m，株距0.06 m。管理同大田生產(chǎn)。為了排除邊際效應(yīng)影響，成熟后在每行中間區(qū)域隨機(jī)收獲5株，脫粒后用于大豆籽粒維生素E及其組分含量檢測(cè)。

1.2 氣象數(shù)據(jù)

氣象數(shù)據(jù)來(lái)源于2014年和2015年中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒。

1.3 大豆生育酚提取與檢測(cè)

把大豆籽粒在65℃溫度下烘箱中烘干后磨成粉，稱取0.100 0 g，加入0.050 0 g抗壞血酸，與3 mL 80%乙醇震蕩混勻10 s后置于超聲波清洗器中提取15 min，提取8 min時(shí)再次震蕩混勻10 s一次，提取完成后在13 000 rpm下離心15 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后在設(shè)定色譜條件下測(cè)定[14]。

利用高壓液相色譜技術(shù)（HPLC），采用外標(biāo)法對(duì)大豆籽粒維生素E及其組分進(jìn)行定性和定量分析。β-生育酚含量在大豆籽粒中含量很低，檢測(cè)時(shí)忽略不計(jì)。維生素E總含量為α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚含量之和。

色譜條件：色譜柱為DIKMA公司產(chǎn)品，色譜柱填料為Diamonsil（TM）鉆石C18，5 μm，柱規(guī)格為250×4.6 mm；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)330 nm；流動(dòng)相為甲醇，流速1.5 mL·min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)度為10 min[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS9.50統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)?zāi)攴輾夂驐l件分析

5-9月是大豆生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，如表1所示，這段時(shí)期哈爾濱市和長(zhǎng)春市日均氣溫2013年均高于2014年，除了6月份同期日均氣溫2014年高于2013年外，其他月份同期日均氣溫均2013年高于2014年。整個(gè)大豆生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，哈爾濱市和長(zhǎng)春市平均降水量2013年高于2014年。兩市月平均降水量9月份同期降水2014年高于2013年，5-8月份同期2013年高于2014年。大豆生長(zhǎng)發(fā)育階段，哈爾濱市地區(qū)平均日照時(shí)數(shù)2013年長(zhǎng)于2014年，長(zhǎng)春地區(qū)則2013短于2014年。5月、6月和8月份同期，哈爾濱和長(zhǎng)春地區(qū)月平均日照時(shí)數(shù)年際間變化趨勢(shì)相同，即5月份2013年長(zhǎng)于2014年，6月和8月份2014年長(zhǎng)于2013年。而在其它月份（7和9月份），哈爾濱和長(zhǎng)春地區(qū)月平均日照時(shí)數(shù)年際間變化趨勢(shì)完全相反，即7月和9月份同期，哈爾濱地區(qū)日平均日照時(shí)數(shù)均為2013年>2014年，而長(zhǎng)春地區(qū)2013年<2014年。

表1 2013年和2014年試驗(yàn)區(qū)氣象條件Table 1 The meteorological conditions in 2013 and 2014

2.2 大豆維生素E及其組分含量表型分析

不同年份和地點(diǎn)的大豆維生素E及其組分含量，如表2所示。重組自交系群體維生素E及其組分含量分布廣，所有性狀均表現(xiàn)為超親分離。2013年，重組自交系群體α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量的平均含量最高值均出現(xiàn)在哈爾濱阿城區(qū)。2014年，最高值則均出現(xiàn)在哈爾濱呼蘭區(qū)。同一地點(diǎn)不同年份間比較，父母本和重組自交系群體平均值維生素E及其組分含量2013年均高于2014年。

表2 親本及其重組自交系群體維生素E含量Table 2 Vitamin E contents of the soybean recombinant inbred line（RIL）population and parents（μg·g-1）

2.3 大豆維生素E及其組分含量多因素統(tǒng)計(jì)分析

研究對(duì)重組自交系群體的α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量進(jìn)行了多因素統(tǒng)計(jì)分析。如表3所示，α-生育酚含量在年份、群體、年份×地點(diǎn)互作、年份×群體互作、地點(diǎn)×群體互作和年份×地點(diǎn)×群體互作差異均達(dá)到極顯著（P<0.001），在地點(diǎn)變異達(dá)到顯著性差異（P=0.001 1）。如表4、表5和表6所示，對(duì)于γ-生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量，年份、地點(diǎn)、群體、年份×地點(diǎn)互作、年份×群體互作、地點(diǎn)×群體互作和年份×地點(diǎn)×群體互作差異均達(dá)到極顯著（P<0.001）。說(shuō)明不同種植環(huán)境對(duì)大豆籽粒維生素E及其組分含量影響較大。

表3 重組自交系群體大豆籽粒α-生育酚含量多因素統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Multiariable statistical analysis of α-tocopherol contents in RILs

表4 重組自交系群體大豆籽粒γ-生育酚含量多因素統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Multiariable statistical analysis of γ-tocopherol contents in RILs

表5 重組自交系群體大豆籽粒δ-生育酚含量多因素統(tǒng)計(jì)分析Table 5 Multiariable statistical analysis of δ-tocopherol contents in RILs

表6 重組自交系群體大豆籽粒維生素E總含量多因素統(tǒng)計(jì)分析Table 6 Multiariable statistical analysis of total VE contents in RILs

2.4 大豆維生素E及其組分含量比較分析

為了更清晰和詳細(xì)地對(duì)比不同年份和地點(diǎn)間大豆籽粒維生素E的差異水平，研究從重組自交系群體選取維生素E及其組分含量在不同環(huán)境條件下分別屬于高、中和低水平的三個(gè)株系RIL-31、RIL-132和RIL-98，并與親本和重組自交系群體平均值進(jìn)行多重比較分析。

如圖1所示，2013年任一地點(diǎn)大豆籽粒α-生育酚含量均極顯著高于2014年（P<0.01）。2013年，F(xiàn)reeborn的α-生育酚含量在三個(gè)種植地點(diǎn)之間呈極顯著差異（P<0.01），含量順序?yàn)楹籼m>長(zhǎng)春>阿城。北豐9和RIL-31（高）在2013年三個(gè)種植地點(diǎn)之間差異顯著（P<0.05），北豐9的含量順序?yàn)殚L(zhǎng)春>呼蘭>阿城，RIL-31含量順序?yàn)楹籼m>阿城>長(zhǎng)春。RIL-132（中）和RIL-98（低）在2013年阿城的α-生育酚含量分別極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）低于其它兩個(gè)種植地點(diǎn)，而長(zhǎng)春和呼蘭之間沒(méi)有顯著性差異。2013年長(zhǎng)春、阿城和呼蘭三個(gè)地點(diǎn)RILs平均值α-生育酚含量之間差異不顯著。2014年，呼蘭試驗(yàn)點(diǎn)北豐9的α-生育酚含量極顯著高于長(zhǎng)春和阿城試驗(yàn)點(diǎn)（P<0.01），F(xiàn)reeborn的α-生育酚含量在阿城最高，呼蘭最低，兩種植地點(diǎn)間呈極顯著差異（P<0.01），RIL-31在呼蘭的α-生育酚含量極顯著低于長(zhǎng)春和阿城（P<0.01），RIL-132在長(zhǎng)春的α-生育酚含量極顯著高于阿城和呼蘭（P<0.01），RIL-98在三個(gè)種植地點(diǎn)間的α-生育酚含量呈顯著性差異（P<0.05），含量順序?yàn)殚L(zhǎng)春>呼蘭>阿城。2014年三個(gè)地點(diǎn)RILs平均值α-生育酚含量呼蘭顯著高于長(zhǎng)春和阿城（P<0.05）。

圖1 不同環(huán)境大豆籽粒α-生育酚含量比較分析Fig.1 Comparative analysis of α-tocopherol contents in soybean seeds in different environments

如圖2所示，2013年任一地點(diǎn)大豆籽粒γ-生育酚含量均極顯著高于2014年（P<0.01）。2013年，呼蘭試驗(yàn)點(diǎn)的北豐9和RIL-31的γ-生育酚含量均極顯著低于長(zhǎng)春和阿城（P<0.01），而在長(zhǎng)春與阿城之間差異不顯著。長(zhǎng)春試驗(yàn)點(diǎn)RIL-132的γ-生育酚含量極顯著高于阿城和呼蘭（P<0.01）。Freeborn、RIL-98和自交系群體平均值的γ-生育酚平含量三個(gè)種植地點(diǎn)間均呈極顯著差異（P<0.01），F(xiàn)reeborn的含量順序?yàn)楹籼m>阿城>長(zhǎng)春，RIL-98的含量順序與Freeborn恰恰相反，為長(zhǎng)春>阿城>呼蘭，自交系平均值含量順序?yàn)榘⒊?長(zhǎng)春>呼蘭。2014年，北豐9和RIL-132的γ-生育酚含量三個(gè)種植地點(diǎn)間均呈極顯著差異（P<0.01），含量順序均為呼蘭>長(zhǎng)春>阿城。在呼蘭種植地點(diǎn)，F(xiàn)reeborn和重組自交系群體平均值的γ-生育酚含量均極顯著高于其它兩個(gè)地點(diǎn)（P<0.01），長(zhǎng)春和阿城之間差異不顯著。長(zhǎng)春試驗(yàn)點(diǎn)RIL-31的γ-生育酚含量極顯著低于阿城和呼蘭（P<0.01），而RIL-98的γ-生育酚含量極顯著高于阿城和呼蘭（P<0.01），兩個(gè)株系在阿城和呼蘭之間差異均不顯著。

圖2 不同環(huán)境大豆籽粒γ-生育酚含量比較分析Fig.2 Comparative analysis of γ-tocopherol contents in soybean seeds in different environments

如圖3所示，2013年任一地點(diǎn)的大豆籽粒δ-生育酚含量均極顯著高于2014年（P<0.01）。2013年，阿城試驗(yàn)點(diǎn)北豐9的δ-生育酚含量極顯著高于長(zhǎng)春和呼蘭（P<0.01），長(zhǎng)春和呼蘭兩地間差異不顯著。Freeborn、RIL-31和RIL-98的δ-生育酚含量在三個(gè)地點(diǎn)呈極顯著差異（P<0.01），含量順序分別為呼蘭>阿城>長(zhǎng)春、阿城>呼蘭>長(zhǎng)春和阿城>長(zhǎng)春>呼蘭。2013年，重組自交系群體δ-生育酚平均含量在三個(gè)地點(diǎn)間呈顯著差異（P<0.05），含量順序?yàn)榘⒊?呼蘭>長(zhǎng)春。2014年，北豐9、RIL-31和RIL-98的δ-生育酚含量在三個(gè)地點(diǎn)呈極顯著差異（P<0.01），含量順序?yàn)閯e為呼蘭>長(zhǎng)春>阿城、阿城>長(zhǎng)春>呼蘭和長(zhǎng)春>阿城>呼蘭。呼蘭試驗(yàn)點(diǎn)Freeborn的δ-生育酚含量極顯著高于長(zhǎng)春和阿城（P<0.01），長(zhǎng)春和阿城之間差異不顯著。呼蘭試驗(yàn)點(diǎn)RIL-132的δ-生育酚含量最高，長(zhǎng)春最低，兩地間差異極顯著（P<0.01），與阿城試驗(yàn)點(diǎn)的δ-生育酚含量差異未達(dá)到顯著水平。呼蘭試驗(yàn)點(diǎn)重組自交系群體δ-生育酚平均含量顯著高于長(zhǎng)春和阿城（P<0.05），長(zhǎng)春和阿城之間差異不顯著。

圖3 不同環(huán)境大豆籽粒δ-生育酚含量比較分析Fig.3 Comparative analysis of δ-tocopherol contents in soybean seeds in different environments

如圖4所示，2013年任一地點(diǎn)的大豆籽粒維生素E總含量均極顯著高于2014年（P<0.01）。2013年，北豐9和RIL-132的維生素E總含量在三個(gè)地點(diǎn)間呈現(xiàn)顯著或極顯著差異，其中，呼蘭試驗(yàn)點(diǎn)北豐9的維生素E總含量與長(zhǎng)春和阿城之間的差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），含量順序?yàn)榘⒊?長(zhǎng)春>呼蘭。長(zhǎng)春試驗(yàn)點(diǎn)RIL-132的維生素E總含量極顯著高于阿城和呼蘭（P<0.01），含量順序?yàn)殚L(zhǎng)春>呼蘭>阿城。Freeborn的維生素E總含量三個(gè)地點(diǎn)間差異極顯著（P<0.01），含量順序?yàn)楹籼m>阿城>長(zhǎng)春。阿城試驗(yàn)點(diǎn)RIL-31維生素E總含量極顯著高于長(zhǎng)春試驗(yàn)點(diǎn)（P<0.01），呼蘭含量介于兩地之間，與長(zhǎng)春和阿城差異不顯著。呼蘭試驗(yàn)點(diǎn)RIL-98維生素E總含量極顯著低于長(zhǎng)春和阿城（P<0.01），長(zhǎng)春和阿城之間差異不顯著。阿城試驗(yàn)點(diǎn)重組自交系群體維生素E總含量平均值極顯著高于長(zhǎng)春和呼蘭（P<0.01），長(zhǎng)春和呼蘭之間差異不顯著。2014年，北豐9維生素E總含量在三個(gè)地點(diǎn)之間呈極顯著差異（P<0.01），含量順序?yàn)楹籼m>長(zhǎng)春>阿城。呼蘭試驗(yàn)點(diǎn)Freeborn、RIL-132和重組自交系群體平均值的維生素E總含量極顯著高于長(zhǎng)春和阿城（P<0.01），長(zhǎng)春和阿城之間差異不顯著。長(zhǎng)春試驗(yàn)點(diǎn)RIL-31的維生素E總含量顯著低于阿城和呼蘭（P<0.05），而RIL-98的維生素E總含量極顯著高于阿城和呼蘭（P<0.01），兩個(gè)株系在阿城和呼蘭之間均差異不顯著。

圖4 不同環(huán)境大豆籽粒維生素E總含量比較分析Fig.4 Comparative analysis of Total VE contents in soybean seeds in different environments

3 結(jié)論與討論

相關(guān)報(bào)道顯示，大豆籽粒維生素E及其組分含量是由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀，具有較低的廣泛遺傳力[15-16]。研究通過(guò)多因素統(tǒng)計(jì)分析顯示，α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量在年份、地點(diǎn)、群體、年份×地點(diǎn)互作、年份×群體互作、地點(diǎn)×群體互作和年份×地點(diǎn)×群體互作均達(dá)到了極顯著差異（表3、表4、表5和表6），說(shuō)明環(huán)境條件對(duì)大豆籽粒維生素E及其組分含量有顯著的影響。

為了解析氣候條件對(duì)大豆籽粒維生素E的影響方式，研究進(jìn)一步對(duì)北豐9、Freeborn、RIL-31（高）、ROL-132（中）、RIL-98（低）和RILs平均值的α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量進(jìn)行了多因素比較分析。結(jié)果顯示，2013年大豆籽粒維生素E及其組分含量均極顯著高于2014年（圖1、圖2、圖3和圖4）。Shaw[15]利用重組自交系群體2年3地的數(shù)據(jù)分析也得出與研究相同結(jié)果，維生素E及其組分含量呈現(xiàn)年際間顯著差異。這個(gè)結(jié)果可能與2013年與2014年3個(gè)地點(diǎn)環(huán)境年際變化有關(guān)。通過(guò)查閱中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒[17-18]，研究選取2013年和2014年5月至9月份大豆生長(zhǎng)發(fā)育階段的氣象數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。分析結(jié)果顯示，哈爾濱地區(qū)和長(zhǎng)春地區(qū)日均氣溫2013年高于2014年。兩區(qū)域5月至9月平均降水量2013年高于2014年。研究顯示，高溫和干旱條件有利于α-生育酚含量提高，但是不利于γ-生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量的積累[11，19-22]。9月份大豆生長(zhǎng)發(fā)育處于鼓粒期至完熟期，是大豆籽粒維生素E含量積累逐漸達(dá)到最大值階段。根據(jù)氣象資料，此時(shí)期，哈爾濱地區(qū)和長(zhǎng)春地區(qū)日均氣溫2013年＞2014年，月平均降水量2013年<2014年，氣溫和降水條件均更有利于2013年大豆籽粒α-生育酚含量的積累，但是相反也會(huì)抑制γ-生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量的提高。以往研究結(jié)論與氣象因素可以解釋大豆籽粒α-生育酚含量2013年高于2014年。但是，不足以解釋?duì)?生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量為何2013年也高于2014年。據(jù)報(bào)道，光照強(qiáng)度、臭氧和紫外線輻射均能影響植物維生素E及其組分的含量[23-37]。由于目前研究所掌握氣象數(shù)據(jù)不足及相關(guān)研究還不夠深入，還很難以解釋這個(gè)結(jié)果。但研究認(rèn)為，γ-生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量2013年高于2014年可能因?yàn)槭艿狡渌鼩庀笠蛩啬觌H變化的影響，而這些因素有可能是造成年際差異的主要因素。想要闡明大豆籽粒維生素E及其組分含量年季差異的原因，還需進(jìn)行深入的研究加以解釋和驗(yàn)證。

根據(jù)表型數(shù)據(jù)顯示，2013年，重組自交系群體α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量的平均含量最高值均出現(xiàn)在哈爾濱阿城區(qū)。2014年，最高值則均出現(xiàn)在哈爾濱呼蘭區(qū)。研究顯示，我國(guó)東北北部且包括哈爾濱地區(qū)，大豆籽粒中富含生育酚等多項(xiàng)功能性成分，而東北中南部且包括長(zhǎng)春地區(qū)，則不屬于高生育酚含量區(qū)域[38]。這也與研究結(jié)果相互印證。相關(guān)研究也指出，要根據(jù)種植區(qū)土壤和氣候特點(diǎn)進(jìn)行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[39]。研究結(jié)果顯示哈爾濱地區(qū)較長(zhǎng)春地區(qū)氣候條件更易種植生產(chǎn)出高維生素E含量的大豆產(chǎn)品，可以為高維生素E大豆生產(chǎn)提供參考。研究中，重組自交系群體的α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量具有廣泛的表型變異，所有性狀均表現(xiàn)為超親分離。這些性狀的超親變異有益于大豆維生素E性狀的改良。