王佼佼， 田茂松， 王明進， 王娜， 廖玉丹， 劉玲， 潘雪莉

(貴州醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生與健康學院 & 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

馬拉色菌(Malassezia)是一種條件致病真菌[1]，寄生于人和動物的正常皮膚表面，在機體免疫力下降或皮膚微環(huán)境失調(diào)(溫度、濕度、皮膚油脂分泌情況、多汗等)的情況下，可致皮膚發(fā)生馬拉色菌毛囊炎、花斑糠疹等炎癥，也與脂溢性皮炎、特異性皮炎、銀屑病等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2-4]。馬拉色菌毛囊炎是一種臨床常見的炎癥性、淺表性皮膚病，可呈慢性表現(xiàn)，皮損以鱗屑、紅斑為主，并且伴有不同程度瘙癢，引起該病的菌種主要為糠秕馬拉色菌(Malasseziafurfur,M．furfur)。臨床上治療馬拉色菌相關(guān)皮膚病主要為外用抗真菌藥物，長期使用會導致使用局部皮膚萎縮、毛細血管擴張、痤瘡樣皮炎、色素沉著及繼發(fā)感染，療效雖好但副作用多，且不能長期使用。所以針對此類微生物的感染，探索新的治療方法具有重要意義。小葉苦丁茶，系采摘木犀科粗壯女貞(ligustrum purpurascens)的幼嫩芽葉經(jīng)加工而成。小葉苦丁茶因其獨特的味道在我國具有悠久的飲用歷史，還具有一定的藥用背景[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)苦丁茶水提取物中的成分槲皮素、多糖類、黃酮、皂苷有明顯的抗菌抑菌作用[7-9]。在對皮膚病治療中，利用苦丁茶煎劑熏洗濕敷治療足癬合并細菌感染臨床療效良好[10]，苦丁茶液對放療所致口腔潰瘍的恢復也有良好的促進作用[11]。目前未見應用小葉苦丁茶治療馬拉色菌皮膚感染的相關(guān)研究報道，故本研究通過建立M．furfur皮膚感染豚鼠模型，觀察小葉苦丁茶水煎液外涂對豚鼠M．furfur皮膚感染恢復的促進效果，為探索M．furfur皮膚感染安全有效的治療方法提供新的思路，并進一步挖掘苦丁茶“食藥兩用”的應用價值與前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康白色豚鼠20只，體質(zhì)量為(325±10)g，雌雄各半，由本校實驗中心提供[許可證號SCXK(湘)2019-0015]，所有豚鼠均單獨飼養(yǎng)。本研究方案已通過貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審核并批準(批準號為1900227)。

1.1.2實驗菌株 糠秕馬拉色菌標準菌株(廣東省微生物研究所，編號ATCC 44344)。

1.1.3實驗材料 小葉苦丁茶購于貴州省余慶縣，豚鼠高脂飼料購于江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司。

1.1.4實驗儀器與試劑 正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，T100梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)，真菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(寶生物工程有限公司)，4%多聚甲醛。

1.2 實驗方法

1.2.1M．furfur菌懸液配制 將M．furfur接種于固體培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)2次后，挑其菌落置于0.9%生理鹽水無菌試管中，震蕩搖勻制成菌懸液，麥氏比濁管計數(shù)將濃度調(diào)整為1×109CFU/mL。

1.2.2M．furfur皮膚感染豚鼠模型 20只豚鼠按體重隨機分為模型組(14只)和對照組(6只)，組內(nèi)雌雄各半。將每只豚鼠背部約3 cm×3 cm區(qū)域標記作為M．furfur備毛區(qū)、脫去毛發(fā)后自然晾干；次日用酒精消毒備毛區(qū)后，刮取豚鼠皮屑進行真菌直接鏡檢、確定為陰性，采用紫外線燈下照射30 min、粗砂紙均勻打磨豚鼠備毛區(qū)、涂抹適量無菌橄欖油；模型組于備毛區(qū)涂抹0.5 mL新鮮配制的M．furfur菌懸液，對照組于備毛區(qū)涂抹0.5 mL生理鹽水，每日1次、連續(xù)7 d。

1.2.3M．furfur模型的鑒定 建模第8天時，肉眼觀察兩組豚鼠背部備毛區(qū)進行皮損評分、以0～3分計[12]，無皮損為0 分、輕度皮損(>20%備毛區(qū))為1分、中度皮損(備毛區(qū)處20%<備毛區(qū)<50%備毛區(qū))為2分、重度皮損(>50%備毛區(qū))為3分；然后取豚鼠備毛區(qū)皮屑于10%氫氧化鉀常規(guī)鏡檢觀察是否有M．furfur圓形孢子，同時將皮屑種于含青霉素和鏈霉素的馬拉色固體培養(yǎng)基中，并另接種標準菌株作為對照，培養(yǎng)72 h后，分別提取皮屑陽性菌落與標準菌株菌落的DNA，送武漢天一華煜基因科技有限公司進行Sanger測序，標準菌株菌落序列提交到NCBI中進行Blast比對，再比對皮屑陽性菌落與標準菌落核苷酸序列；最后模型組與對照組各取2只豚鼠麻醉處死，取備毛區(qū)皮膚，進行蘇木精-伊紅染色( hematoxylin-eosin staining，HE )及過碘酸雪夫染色(periodic acid schiff，PAS)染色，觀察皮膚組織學改變及馬拉色菌孢子數(shù)量。

1.2.4小葉苦丁茶水煎液治療豚鼠M．furfur皮膚感染 小葉苦丁茶水煎液的制備，據(jù)文獻報道[13]，茶葉外用對人體抗菌作用有效濃度為0.02 g/mL，所以根據(jù)人與動物間藥物劑量換算方法[14]，得出豚鼠外用濃度約為0.5 g/mL。稱取小葉苦丁茶15 g，加入純水150 mL，加熱煎煮20 min后用紗布濾出煎液，濾渣再加純水100 mL同法煎煮20 min過濾，兩次濾液混合加熱濃縮成30 mL，即為濃度0.5 g/mL水煎液，備用[15]。

1.2.5M．furfur皮膚感染豚鼠模型分組及處理 將模型鑒定后剩余的12只豚鼠根據(jù)M．furfur備毛區(qū)皮損評分按照隨機數(shù)表法分組，隨機分為干預組和自然恢復組，每組各6只、雌雄各半。干預組：每只豚鼠按10 mL/kg的劑量，用0.5 g/mL小葉苦丁茶水煎液外涂于豚鼠感染區(qū)，連續(xù)10 d。自然恢復組涂抹生理鹽水。

1.3 觀察指標

1.3.1感染區(qū)皮損評分 分別于治療第 0、3、7、10天，觀察干預組和自然恢復組豚鼠背部M．furfur感染區(qū)的皮損情況并評分。

1.3.2感染區(qū)菌落數(shù)及轉(zhuǎn)陰率測定 干預組豚鼠末次給予小葉苦丁茶水煎液治療24 h ，麻醉處死、消毒背部感染區(qū)皮膚，每只豚鼠剪下直徑為1 cm ×1 cm方形皮損，置于0.9% 生理鹽水1 mL的離心管中、充分研磨為勻漿、制成混懸液；取混懸液300 μL接種于含青霉素和鏈霉素的馬拉色固體培養(yǎng)皿、搖勻鋪開、培養(yǎng)72 h，記錄其菌落數(shù)、計算真菌轉(zhuǎn)陰率。培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)≤1 CFU，即視為陰性[16]；真菌轉(zhuǎn)陰率=每組培養(yǎng)陰性動物數(shù)/每組感染動物總數(shù)×100%。

1.3.3M．furfur感染豚鼠模型皮膚病理組織及M．furfur孢子檢查 造模成功10 d時，取干預組(小葉苦丁茶水煎液治療10 d)和自然恢復組豚鼠各2只處死，剪取背部感染區(qū)處皮膚，4%多聚甲醛溶液固定24 h、石蠟包埋切片，經(jīng)HE、PAS染色觀察皮膚組織學改變及皮膚損傷組織的M．furfur孢子。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 M．furfur感染豚鼠皮膚模型建立

對照組豚鼠皮膚皮損無明顯變化，連續(xù)感染M．furfur7 d后，肉眼觀察M．furfur感染豚鼠皮膚皮損隨著時間變化逐漸加重(圖1)，背部皮損評分均達到中度以上。模型組皮屑于10%氫氧化鉀直接鏡檢可見圓形孢子，皮屑培養(yǎng)菌落數(shù)均>1 CFU，即真菌培養(yǎng)陽性。標準菌株核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中糠秕馬拉色菌序列相似度為100%，且模型組皮屑或毛發(fā)培養(yǎng)菌株與標準菌株核苷酸序列相似度為100%，可鑒定為同一菌種，部分測序峰圖見圖2、圖3。皮膚組織HE染色顯示，與對照組(圖4A)相比，模型組皮膚可見表皮增生，角質(zhì)層角化過度，角化不全，棘層細胞增厚，皮脂腺增多(圖4B、圖4C)，鏡下可見較多中性粒細胞浸潤(圖4D)。PAS染色顯示角質(zhì)層及毛囊處出現(xiàn)大量圓形糠秕馬拉色菌孢子(圖4E、圖4F)。

圖1 豚鼠皮膚M．furfur備毛區(qū)連續(xù)7 d的皮損變化Fig.1 Changes of skin lesion in M. furfur-infected area of guinea pigs for 7 days

圖2 M．furfur標準菌株DNA ITS1區(qū)sanger測序峰圖Fig.2 Sanger sequencing map of DNA ITS1 region of M．furfur standard strain

圖3 豚鼠M．furfur皮膚備毛區(qū)皮屑培養(yǎng)的菌落 DNA ITS1區(qū)sanger測序峰圖Fig.3 Sanger sequencing map of DNA ITS1 region of bacterial colonies in M. furfur-infected skin of guinea pigs

注：紅色箭頭代表M．furfur孢子；A為豚鼠對照組皮膚(HE，×100)，B、C為豚鼠模型組皮膚備毛區(qū)出現(xiàn)表皮增生、角質(zhì)層角化過度、角化不全、棘層細胞增厚、皮脂腺增多(HE，×100)，D為豚鼠模型組皮膚備毛區(qū)出現(xiàn)較多中性粒細胞浸潤(HE，×400)，E、F為豚鼠模型組皮膚備毛區(qū)可見大量圓形糠秕馬拉色菌孢子(PAS，×1 000)。圖4 豚鼠正常組與模型組皮膚顯微鏡下觀察Fig.4 Observation of the skin of guinea pigs in normal group and model group under the microscope

2.2 小葉苦丁茶水煎液對M．furfur皮膚感染模型豚鼠皮損評分的影響

隨著苦丁茶水煎液治療時間的延長，干預組和自然恢復組皮損程度明顯減輕(圖5)，治療10 d后，兩組皮損評分差異有統(tǒng)計學意義(t=3.968，P=0.003，表1)。干預組豚鼠皮膚感染區(qū)已接近豚鼠正常皮膚，自然恢復組還有少量鱗屑和紅斑。

圖5 小葉苦丁茶水煎液對M．furfur皮膚感染模型豚鼠皮損的影響Fig.5 Effect of small-leaf Kuding tea decoction on skin lesions of M. furfur-infected guinea pigs

表1 小葉苦丁茶水煎液對M．furfur皮膚感染模型豚鼠皮損評分影響Tab.1 Effect of small-leaf Kuding tea decoction on skin lesions score of M. furfur-infected guinea

2.3 M．furfur皮膚感染模型豚鼠感染區(qū)菌落形成及轉(zhuǎn)陰率影響

小葉苦丁茶水煎液治療豚鼠M．furfur皮膚感染10 d后，根據(jù)Spearman秩和檢驗，干預組與自然恢復組的菌落數(shù)具有差異(H=2.115，P=0.034，表2)。根據(jù)Fisher確切概率法，干預組的真菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰率為66.7%，而自然恢復組的真菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰率0%。干預組與自然恢復組的真菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰率差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.014，表3)。

表2 兩組M．furfur皮膚感染模型豚鼠背部感染區(qū)菌落數(shù)比較[M(P25，P75)]Tab.2 Comparison of the numbers of bacteria in back infected area of M. furfur-infected guinea pigs between two groups[M(P25，P75)]

表3 兩組M．furfur皮膚感染模型豚鼠背部感染區(qū)真菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰率比較Tab.3 Comparison of the fungi negative conversion ratioin back infected area of M. furfur-infected guinea pigs between two groups

2.4 M．furfur皮膚感染模型豚鼠背部感染區(qū)組織學變化及M．furfur孢子數(shù)量

治療10 d時HE染色結(jié)果顯示，與自然恢復組相比，干預組治療10 d時角質(zhì)層變薄、皮脂腺減少(圖6)。PAS染色結(jié)果顯示，與自然恢復組相比，干預組未發(fā)現(xiàn)圓形M．furfur孢子，而自然恢復組在鏡下仍可找到少量的圓形M．furfur孢子(圖7)。

3 討論

馬拉色菌是皮膚真菌感染性疾病中最常見的致病菌，可導致花斑糠疹、馬拉色菌毛囊炎，也與頭皮糠疹、脂溢性皮炎、特應性皮炎及銀屑病等疾病的發(fā)病有關(guān)。在這些疾病中，M．furfur是臨床馬拉色菌相關(guān)疾病中分離率較高的菌種。而近幾年來，由于皮質(zhì)類固醇激素、廣譜抗生素、放化療藥物等的廣泛使用，降低了機體免疫力和破壞了皮膚微環(huán)境的平衡，從而導致馬拉色菌引起的淺部皮膚感染越來越多[17]。

注：紅色箭頭代表皮脂腺；A為干預組角質(zhì)層變薄、皮脂腺減少(HE，×100)，B為自然恢復組呈角質(zhì)層稍厚、皮脂腺多(HE，×100)。圖6 小葉苦丁茶水煎液對M．furfur皮膚感染模型豚鼠皮膚組織學改變Fig.6 Skin histological changes of small-leaf Kuding tea decoction on M. furfur-infected guinea pigs

注：紅色箭頭代表M．furfur孢子；A為干預組未見M．furfur孢子，B為自然恢復組有少量M．furfur孢子。圖7 小葉苦丁茶水煎液對皮膚感染豚鼠中M．furfur孢子的影響(PAS，×1 000)Fig.7 Effect of small-leaf Kuding tea decoction on M. furfur spores in infected skin of guinea pigs( PAS,×1 000)

小葉苦丁茶主要生長在我國貴州、云南、四川等地[19]。貴州余慶小葉苦丁茶生長在貴州境內(nèi)烏江河流域喀斯特地貌、海拔400～800米地區(qū)，品質(zhì)優(yōu)良、產(chǎn)量高。小葉苦丁茶味微苦，性微寒。傳統(tǒng)中醫(yī)認為，小葉苦丁茶具有清熱解毒、消腫止痛等功效[20]。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮是苦丁茶的主要活性成分之一，在苦丁茶內(nèi)占據(jù)相當大的比重[21]。延永等[22]對苦丁茶總黃酮提取物進行了體外抑菌測試，結(jié)果表明苦丁茶中的總黃酮提取物具有抑菌作用，并發(fā)現(xiàn)隨著黃酮濃度的增加抑菌作用越強。有研究顯示總黃酮的抑菌作用與其破壞了細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)[23]。小葉苦丁茶還具有高硒、低咖啡堿等特點，具有一定的保健價值，且已被證實對人體沒有急慢性、致突變以及致畸等毒性，已被正式批準為食品[24]。故本研究基于小葉苦丁茶抗菌抑菌的功效，利用小葉苦丁茶水煎液對M．furfur皮膚感染豚鼠進行治療觀察。

本研究利用7 d連續(xù)涂菌法對豚鼠皮膚進行M．furfur感染模型的建立。M．furfur為嗜脂性的條件致病菌，故本實驗給予豚鼠高脂飼料喂養(yǎng)，增加食物中脂肪含量以刺激豚鼠皮脂分泌。在涂抹菌液之前，先用磨砂紙打磨豚鼠背部皮膚并涂抹橄欖油，進一步為建模成功創(chuàng)造條件。目前，M．furfur豚鼠皮膚感染無統(tǒng)一的模型鑒定及療效評價標準。本研究不僅通過肉眼觀察測定皮損評分、鏡下觀察皮屑、皮屑培養(yǎng)菌落計數(shù)以及病理組織學檢查4個方面進行模型鑒定，還將皮屑培養(yǎng)出的菌落DNA與標準菌株DNA進行序列比對，進一步為模型鑒定提供了可靠依據(jù)。本研究中模型鑒定結(jié)果表明建模成功。

采用小葉苦丁茶水煎液對豚鼠皮損處進行外涂處理，結(jié)果顯示，連續(xù)用藥10 d后，干預組肉眼皮損評分和菌落數(shù)均低于自然恢復組，差異具有統(tǒng)計學意義。藥物治療真菌病的療效評估包括臨床治愈和真菌學治愈，而真菌學治愈更為客觀。給藥10 d后，干預組真菌轉(zhuǎn)陰率均高于自然恢復組，差異具有統(tǒng)計學意義。通過對豚鼠皮損病理組織鏡下觀察，結(jié)果顯示小葉苦丁茶水煎液可減輕豚鼠皮膚病變程度，減少感染皮膚組織中孢子數(shù)，即小葉苦丁茶水煎液能促進豚鼠糠秕馬拉色菌皮膚感染恢復，但其具體機制尚需進一步研究 。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)小葉苦丁茶水煎液外涂對豚鼠M．furfur皮膚感染恢復有較好的促進作用，這不僅為臨床上治療M．furfur皮膚感染尋找簡單有效的方法提供了新的思路，也為進一步開發(fā)小葉苦丁茶“食藥兩用”的應用前景提供了理論依據(jù)。