趙琨， 肖云**， 肖茗耀， 楊純， 董敏娜， 向柄全

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科， 云南 昆明 650118; 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部， 云南 昆明 650032)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指感染、創(chuàng)傷等多種肺內(nèi)外因素，直接或間接導(dǎo)致的以肺部炎癥和通透性增加為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。ALI和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是連續(xù)的病理生理過(guò)程[1]。雖然近些年對(duì)于ALI的研究和治療取得了一定的進(jìn)展，但其發(fā)生率仍然較高，且缺乏特異性的治療手段[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)是各種病因?qū)е翧LI的共同途徑[4]，主要因?yàn)檠装Y與抗炎反應(yīng)的平衡被打破，導(dǎo)致肺部炎性損傷，因此糾正失衡的炎癥反應(yīng)，可能是ALI治療的關(guān)鍵點(diǎn)[5]。細(xì)胞因子在介導(dǎo)和調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)中扮演重要角色，常見(jiàn)促炎細(xì)胞因子有腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1(interleukin 1，IL-1)、IL-6、IL-8、干擾素γ(inerferon γ，IFN-γ)等，抗炎細(xì)胞因子有IL-4、IL-10及IL-13等[6]。IL-4是機(jī)體重要的抗炎細(xì)胞因子之一，可通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化而發(fā)揮抗炎作用[7-8]。本研究前期發(fā)現(xiàn)，IL-4具有抑制炎癥反應(yīng)、降低細(xì)胞凋亡的作用，在ALI中可能具有正向調(diào)節(jié)作用，本研究通過(guò)建立ALI小鼠模型，觀察IL-4對(duì)ALI小鼠的治療作用及機(jī)制，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

月齡7～8周的c57小鼠，體質(zhì)量約20 g，IL-4細(xì)胞因子購(gòu)自PeproTech，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購(gòu)自北京索萊寶公司，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beyotime，SureScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit及BlazeTaqTMSYBR?Green qPCR Mix 2.0試劑盒均購(gòu)自廣州Genecopoeia公司，Caspase-3抗體購(gòu)自CST，Bcl-2 抗體購(gòu)自GeneTex，Anti-beta Actin抗體購(gòu)自Abcam，Immobilon Western HRP Substrate Luminol Reagent購(gòu)自Affinity，小鼠IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)自NeoBioscience，小鼠IFN-γ ELISA試劑盒購(gòu)自Abmart。

1.2 研究方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 取雄性c57小鼠36只，隨機(jī)分為ALI組、 ALI+IL-4治療組和對(duì)照組，每組12只。ALI組和ALI+IL-4治療組小鼠腹腔注射LPS 10 μg/只[9]，建立小鼠ALI模型，對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。ALI+IL-4治療組于30 min后腹腔注射IL-4 10 μg/kg[10]，此時(shí)，ALI組和對(duì)照組均腹腔注射等體積生理鹽水。3組小鼠均在完成注射后的12 h及24 h分別選取6只小鼠行眼球采血并頸椎脫臼法處死。

1.2.2細(xì)胞因子檢測(cè) 小鼠眼球采血0.5 mL、采集的血液離心后收集上清液，根據(jù)IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ不同細(xì)胞因子配制相應(yīng)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液，將標(biāo)準(zhǔn)液及上述待測(cè)上清液加入相應(yīng)的預(yù)包被 ELISA 試劑盒， 37 ℃孵育1 h，清洗后加入TMB底物，37 ℃放置30 min后加入停止液。使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm波長(zhǎng)處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其OD450 nm繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)算小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ濃度。

1.2.3肺泡灌洗液蛋白含量測(cè)定 處死小鼠后，T字形剪開(kāi)胸部皮膚，暴露胸腔，結(jié)扎氣管和右肺后，使用PBS 1 mL分3次對(duì)左肺進(jìn)行肺泡灌洗，重復(fù)灌洗3遍，回收灌洗液離心吸取上清液測(cè)定體積并備用；重懸細(xì)胞沉淀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，若細(xì)胞數(shù)為109個(gè)/L，則認(rèn)為灌洗液合格。配制0～1 g/L的梯度濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，并將待測(cè)的肺泡灌洗上清液及各濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)液加入96孔板中，最后按說(shuō)明書(shū)加入BCA蛋白定量檢測(cè)試劑，37 ℃恒溫箱孵育30 min，測(cè)定各孔OD562 nm。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度及其OD562 nm繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算肺泡灌洗液中的蛋白濃度，通過(guò)肺泡灌洗液蛋白濃度反映小鼠肺部炎性滲出程度、間接評(píng)估小鼠肺損傷程度。

1.2.4細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及蛋白 處死小鼠后，取小鼠右肺下葉組織，檢測(cè)Caspase3、Bcl-2 基因mRNA及蛋白的表達(dá)。提取小鼠肺組織的總RNA，使用總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄組序列，合成Caspase3、Bcl-2以及內(nèi)參GAPDH的引物，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測(cè)Caspase3及Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量；提取小鼠肺組織總蛋白，總蛋白經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、膜封閉后，分別加入Caspase3、Bcl-2、β-actin一抗，4 ℃過(guò)夜孵育后加入二抗孵育，以ECL發(fā)光試劑成像，以β-actin為內(nèi)參，對(duì)比各組Caspase3、Bcl-2蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清細(xì)胞因子檢測(cè)

與對(duì)照(Control)組比較，ALI組中IL-β分泌量雖然有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的分泌量均明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，以上結(jié)果表明ALI會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌量增加，引發(fā)炎癥反應(yīng)。而在ALI+IL-4組與ALI組的比較中，除IL-10在12 h時(shí)分泌量高于ALI組外(P<0.05)，ALI+IL-4組其余細(xì)胞因子的分泌量均低于ALI組(P<0.05)，以上結(jié)果表明，采用IL-4治療可以降低ALI小鼠中各類炎癥細(xì)胞因子的分泌量，減輕炎癥反應(yīng)。見(jiàn)圖1。

注：圖A、B、D、E，(1)與12 h-Control組比較，P<0.05；(2)與24 h-Control組比較，P<0.05；(3)與12 h-ALI組比較，P<0.05；(4)與24 h-ALI組比較，P<0.05；圖C，(1)與24 h-Control組比較，P<0.05；(2)與12 h-ALI組比較，P<0.05；(3)與24 h-ALI組比較，P<0.05。圖1 ELISA檢測(cè)小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10含量Fig.1 Concentrations of serum TNF- α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, and IL-10 by ELISA

2.2 肺泡灌洗液中蛋白含量

滲出液蛋白含量測(cè)定可作為評(píng)估肺泡-毛細(xì)血管屏障通透性的客觀指標(biāo)。與對(duì)照(Control)組比較，ALI組中肺灌洗液中的蛋白濃度升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，該結(jié)果表明ALI會(huì)增加肺泡-毛細(xì)血管屏障的通透性，加重肺部炎癥反應(yīng)。而采用IL-4治療后，ALI小鼠肺灌洗液中蛋白濃度出現(xiàn)了下降，但差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果表明IL-4治療后降低肺泡-毛細(xì)血管屏障的通透性，減輕肺部炎癥反應(yīng)。見(jiàn)圖2。

圖2 BCA法檢測(cè)各組小鼠肺灌洗液中的蛋白含量Fig.2 Protein concentrations of mouse lung lavage fluids in each group by BCA

2.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)

對(duì)肺組織凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)情況分析結(jié)果顯示，ALI組肺組織中Caspase3 mRNA和蛋白的表達(dá)量均升高，在24 h時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2 mRNA和蛋白表達(dá)量在12 h和24 h時(shí)均出現(xiàn)了下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，以上結(jié)果表明ALI造成了肺組織細(xì)胞的損傷。而采用IL-4治療后，可以明顯降低ALI小鼠肺組織細(xì)胞中Caspase3 mRNA和蛋白的表達(dá)量(P<0.05)，增加Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)量(P<0.05)，提示采用IL-4治療后肺組織的損傷情況得到顯著緩解。見(jiàn)圖3、圖4。

注：圖A，(1)與12 h-Control組比較，P<0.05；(2)與24 h-Control組比較，P<0.05；(3)與12 h-ALI組比較，P<0.05；(4)與24 h-ALI組比較，P<0.05。圖B， (1)與24 h-Control組比較，P<0.05；(2)與12 h-ALI組比較，P<0.05；(3)與24 h-ALI組比較，P<0.05。圖3 qPCR檢測(cè)小鼠肺組織中Caspase3、Bcl-2的表達(dá)Fig.3 The expression levels of Caspase3 and Bcl-2 in mouse lung tissues by qPCR

注：(1)與12 h-Control組比較，P<0.05；(2)與24 h-Control組比較，P<0.05；(3)與12 h-ALI組比較，P<0.05；(4)與24 h-ALI組比較，P<0.05。圖4 Western blot法檢測(cè)小鼠檢測(cè)小鼠肺組織中Caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.4 Protein expression levels of Caspase3 and Bcl-2 in mouse lung tissues by Western blot

3 討論

ALI是指感染、創(chuàng)傷等多種肺內(nèi)外因素，直接或間接導(dǎo)致的以肺部炎癥和通透性增加為主要表現(xiàn)的臨床綜合征[11]；目前臨床治療措施主要為機(jī)械通氣及藥物治療等，有研究表明，采用保護(hù)性呼吸機(jī)策略能在一定程度上幫助ALI/ARDS患者的治療, 卻無(wú)法有效降低其死亡率[4]。目前臨床針對(duì)ALI仍缺乏特異性治療，發(fā)病率及死亡率仍較高。

ALI的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，至今仍未完全闡明。目前認(rèn)為全身炎癥反應(yīng)是各種病因?qū)е翧LI的共同途徑[12]。機(jī)體在感染和創(chuàng)傷等應(yīng)激狀態(tài)下，多種炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子釋放，引起廣泛性全身反應(yīng)，同時(shí)反饋引起抗炎介質(zhì)的釋放，從而達(dá)到制衡炎癥反應(yīng)的目的。當(dāng)二者之間的平衡被打破，則會(huì)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)[13-14]。肺臟的病理改變主要是微血管病變、肺泡通透性增加、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生增加[15]。TNF-α直接損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)可抑制Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌肺泡表面活性物質(zhì)。IL-1與TNF-α相似，同樣是ALI中另一個(gè)重要的炎癥介質(zhì)；IL-6能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化及浸潤(rùn)，同時(shí)上調(diào)黏附分子和其他細(xì)胞因子表達(dá)，從而加強(qiáng)炎癥反應(yīng)[16]。

IL-4是機(jī)體重要的抗炎細(xì)胞因子之一，大量研究表明，IL-4可通過(guò)下調(diào)機(jī)體促炎細(xì)胞因子，促使機(jī)體促炎及抗炎細(xì)胞因子恢復(fù)平衡[17]。本研究結(jié)果顯示：與ALI組相比，ALI+IL-4治療組中各促炎細(xì)胞因子在造模后12 h及24 h均明顯下降，說(shuō)明IL-4可通過(guò)下調(diào)促炎細(xì)胞因子水平來(lái)抑制肺部炎癥反應(yīng)。同時(shí)有研究表明，在IL-4敲除的小鼠 ALI 模型中，其發(fā)病進(jìn)展及炎癥反應(yīng)遠(yuǎn)高于IL-4正常的小鼠模型，這表明IL-4在ALI過(guò)程中扮演重要角色[18]。另一研究也得出同樣的結(jié)論，該研究通過(guò)移植分泌IL-4的巨噬細(xì)胞治療ALI，結(jié)果表明在移植后，小鼠肺部炎癥、組織損傷程度均明顯減輕，ALI小鼠死亡率明顯下降[19]。本研究結(jié)果表明：與ALI組相比，ALI+IL-4治療組中Caspase3表達(dá)顯著降低, Bcl-2的表達(dá)顯著升高，治療組小鼠死亡率明顯下降。

ALI/ARDS另一重要病理生理改變?yōu)檠装Y反應(yīng)導(dǎo)致肺泡-毛細(xì)血管通透性增高，富含蛋白的液體通過(guò)彌散機(jī)制向血管外和肺泡內(nèi)移動(dòng)，造成肺間質(zhì)及肺泡水腫[20]。目前認(rèn)為其機(jī)制主要為大量炎性細(xì)胞積聚于肺毛細(xì)血管，釋放炎性介質(zhì)、活性氧代謝產(chǎn)物和蛋白酶等物質(zhì)，造成肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷[21]。本研究通過(guò)測(cè)定小鼠肺泡灌洗液中蛋白含量來(lái)評(píng)估肺泡-毛細(xì)血管屏障通透性[22]，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，ALI組中肺灌洗液中的蛋白濃度升高，ALI+IL-4治療組肺灌洗液中蛋白濃度較ALI組降低，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。李維維等[23]研究發(fā)現(xiàn)：IL-4組小鼠肺泡灌洗液蛋白濃度明顯減少，說(shuō)明IL-4可以改善ALI小鼠肺毛細(xì)血管通透性。

綜上，通過(guò)前期研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)IL-4可下調(diào)機(jī)體促炎細(xì)胞因子的分泌水平，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕ALI肺部組織損傷，減輕毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺上皮細(xì)胞損傷，因此在ALI中具有一定的保護(hù)作用。Wehrmann等[24]研究發(fā)現(xiàn)，IL-4 表達(dá)會(huì)降低常駐肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的 TNF-α，從而減少肺部巨噬細(xì)胞的積累、炎癥和肺泡毛細(xì)血管泄漏。段曉光等[25]也有研究表明，提高抗炎因子IL-4水平可有效減輕LPS誘導(dǎo)ALI大鼠的肺部炎癥反應(yīng)。因此，IL-4在ALI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能具有一定的保護(hù)作用，具有進(jìn)一步研究及探討的價(jià)值。