高志浩，張佳玥，劉陽(yáng)，王金丹，張旭，張瑩，王秋菊，孫金艷，劉國(guó)君，劉勝軍

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）

鵝是季節(jié)性繁殖動(dòng)物，其繁殖活動(dòng)的季節(jié)性源自其自身內(nèi)源性生物節(jié)律與環(huán)境變化的相互作用，光周期是指晝夜周期中光照期和暗期長(zhǎng)短的交替變化，是影響鵝生產(chǎn)最重要的環(huán)境因素之一[1-2]。光周期會(huì)影響鵝Clock基因的表達(dá)[3]，也會(huì)引起下丘腦、垂體、卵巢中繁殖相關(guān)基因表達(dá)水平的變化[4]。自然光周期情況下，我國(guó)南北方鵝種表現(xiàn)出不同的繁殖節(jié)律，但都表現(xiàn)為休產(chǎn)期、產(chǎn)蛋初期、產(chǎn)蛋高峰期及產(chǎn)蛋末期四個(gè)繁殖階段。

探究鵝Clock基因和下丘腦、垂體、卵巢中繁殖相關(guān)基因表達(dá)水平的變化對(duì)闡明鵝季節(jié)性繁殖行為的分子機(jī)制有著重要的理論指導(dǎo)意義。鳥(niǎo)類(lèi)季節(jié)性繁殖的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，光周期調(diào)控鳥(niǎo)類(lèi)季節(jié)性繁殖的初步機(jī)制是：鳥(niǎo)類(lèi)下丘腦光感受器首先感知光信號(hào)[5]，誘導(dǎo)垂體結(jié)節(jié)部分泌促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropin releasing hormone，TSH）[6]；TSH作用于下丘腦基底部的室管膜細(xì)胞，使其分泌甲狀腺激素激活酶Ⅱ型脫碘酶，催化甲狀腺素（thyroxin，T4）轉(zhuǎn)化為三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）[7]，啟動(dòng)促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的合成和分泌[8]；GnRH經(jīng)血液循環(huán)作用于垂體，刺激促性腺激素—促黃體素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）的合成和分泌[9]；LH和FSH促進(jìn)性腺發(fā)育成熟，禽類(lèi)進(jìn)入繁殖狀態(tài)，開(kāi)始產(chǎn)卵[10]。在禽類(lèi)產(chǎn)蛋后期，光信號(hào)誘導(dǎo)下丘腦室旁核分泌促性腺激素抑制激素（Ggonadotropin-releasing hormoneGnIH）[11]，垂體前葉分泌催乳素（prolactin，PRL）[12]，抑制LH的分泌，反向調(diào)控繁殖活動(dòng)[13]；PRL還可以與卵巢上PRL受體結(jié)合直接抑制卵泡發(fā)育，導(dǎo)致卵泡閉鎖[14]；PRL的釋放激素—血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）可以促進(jìn)禽類(lèi)PRL的分泌，增強(qiáng)PRL的功能[15]；卵巢卵泡發(fā)育產(chǎn)生的雌二醇（estradiol，E2）也可以提高PRL水平[16]。最終在多種激素協(xié)同作用下，停止產(chǎn)卵。PRL是禽類(lèi)繁殖活動(dòng)發(fā)生季節(jié)性退化或產(chǎn)蛋季節(jié)終止的主要原因[17]。

Clock基因是動(dòng)物內(nèi)源性節(jié)律變化的核心，Zhang等[18]對(duì)亞洲短趾百靈的研究表明，Clock基因通過(guò)影響繁殖相關(guān)激素的分泌調(diào)控鳥(niǎo)類(lèi)的繁殖期。Shi等[19]關(guān)于馬崗鵝的研究表明，繁殖期LH、睪酮的血清濃度高于休產(chǎn)期，PRL則相反；增加光照，LH、FSH的血清濃度下降，PRL上升，減少光照則相反。Huang等[20]關(guān)于馬崗鵝在一個(gè)繁殖周期中繁殖相關(guān)激素血清濃度變化的研究結(jié)果與Shi等類(lèi)似；增加光照，下丘腦VIP基因、垂體PRL基因表的達(dá)水平上升，但下丘腦GnRH基因、垂體LH基因的表達(dá)水平無(wú)明顯下降。Zhu等[21]關(guān)于揚(yáng)州鵝的研究表明，增加光照，揚(yáng)州鵝下丘腦中GnRH基因的表達(dá)水平上升，GnIH基因、VIP基因下降；垂體中FSH基因、LH基因，睪丸中FSHR基因、LHR基因的表達(dá)水平上升。當(dāng)出現(xiàn)光不應(yīng)現(xiàn)象后，揚(yáng)州鵝下丘腦中GnIH基因、VIP基因、垂體中VIPR基因、PRL基因的表達(dá)水平上升。Yang等[22]關(guān)于揚(yáng)州鵝的研究表明，繁殖期FSH基因的表達(dá)水平，LH、FSH的血清濃度均高于休產(chǎn)期；但是繁殖期PRL的血清濃度也高于休產(chǎn)期，這與Zhu等的研究結(jié)果不同。

關(guān)于光周期調(diào)控馬崗鵝、揚(yáng)州鵝等南方短日照或部分長(zhǎng)日照類(lèi)型鵝種繁殖相關(guān)激素分泌及基因表達(dá)水平的研究較多，但光周期如何影響北方完全長(zhǎng)光照類(lèi)型成年鵝種，及各繁殖階段繁殖軸（Hypothalamic pituitary gonadal axis，HPG）相關(guān)基因表達(dá)水平的變化則鮮有研究。試驗(yàn)以長(zhǎng)光照類(lèi)型東北地方鵝種東北白鵝為研究對(duì)象，測(cè)定鵝群的產(chǎn)蛋活動(dòng)，采集一個(gè)繁殖周期不同時(shí)期東北白鵝下丘腦、垂體、卵巢組織樣本，檢測(cè)不同時(shí)期繁殖相關(guān)基因的表達(dá)水平，探究不同繁殖階段HPG軸繁殖相關(guān)基因表達(dá)及生殖激素變化的規(guī)律，為進(jìn)一步闡明北方長(zhǎng)光照鵝種季節(jié)性繁殖行為的分子調(diào)控機(jī)制提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取黑龍江大慶某鵝場(chǎng)同一批次已完成一個(gè)自然產(chǎn)蛋周期（2017年6月20日孵化出殼，2018年2月20日開(kāi)始產(chǎn)蛋，7月20日產(chǎn)蛋結(jié)束）的健康東北白鵝母鵝600只，在鵝群自然光照、正常飼喂的情況下，經(jīng)選擇淘汰，選留健康東北白鵝500只，鵝群于2019年2月25日重新開(kāi)產(chǎn)，7月初產(chǎn)蛋結(jié)束。

1.2 樣本采集

分別在休產(chǎn)期（2019年1月15日）、產(chǎn)蛋前期（2019年3月20日，產(chǎn)蛋率低于20%）、產(chǎn)蛋高峰期（2019年5月1日，產(chǎn)蛋率30%以上）、產(chǎn)蛋后期（2019年7月1日，產(chǎn)蛋率20%以下）四個(gè)階段選取健康雌性東北白鵝各5只，采集血樣，離心獲得血清，-20℃冰箱保存；采集下丘腦、垂體、卵巢組織的樣本，液氮凍存，-80℃冰箱保存。

1.3 激素濃度測(cè)定

采用上海優(yōu)選生物科技有限公司（中國(guó)）商用試劑盒測(cè)定血清中LH、FSH和PRL的濃度。

1.4 總RNA提取與cDNA制備

用5 min極速RNA提取試劑盒（新海基因，哈爾濱）提取不同組織總RNA；用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA，日本）制備cDNA，-20℃冰箱保存。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

參考的禽類(lèi)基因序列來(lái)自NCBI，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 HPG軸各器官測(cè)定的基因及引物信息Table 1 Gene tested in HPG axis and its primer information

1.6 東北白鵝下丘腦、垂體、卵巢中繁殖相關(guān)基因表達(dá)定量分析

1.7 數(shù)據(jù)分析

基因表達(dá)水平以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。以休產(chǎn)期各基因的相對(duì)表達(dá)水平為1.00。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同繁殖階段東北白鵝下丘腦中Clock基因和繁殖相關(guān)基因表達(dá)情況

下丘腦中Clock基因和繁殖相關(guān)基因在不同繁殖階段的表達(dá)水平如圖1所示，由圖1可知，Clock基因在產(chǎn)蛋高峰期的表達(dá)水平顯著高于產(chǎn)蛋后期（P<0.05）；GnRH基因的表達(dá)水平在試驗(yàn)期內(nèi)呈下降趨勢(shì)，在休產(chǎn)期的表達(dá)水平與產(chǎn)蛋后期差異顯著（P<0.05）；VIP基因在產(chǎn)蛋高峰期的表達(dá)水平顯著高于產(chǎn)蛋后期（P<0.05）。

圖1 不同繁殖階段下丘腦Clock基因和繁殖相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平Fig.1 Relative expression level of Clock gene and reproductive related genes mRNA in different periods in hypothalamus

2.2 不同繁殖階段東北白鵝垂體中相關(guān)基因表達(dá)情況

垂體中相關(guān)基因在不同繁殖階段的表達(dá)水平如圖2所示，由圖2可知，LH基因在休產(chǎn)期的表達(dá)水平極顯著低于產(chǎn)蛋期（P<0.01）；FSH基因的表達(dá)水平在產(chǎn)蛋高峰期及之前呈上升趨勢(shì)，差異極顯著（P<0.01），在產(chǎn)蛋后期下降，極顯著低于產(chǎn)蛋高峰期（P<0.01）；PRL基因在產(chǎn)蛋高峰期及之前的表達(dá)水平極顯著低于產(chǎn)蛋后期（P<0.01）。

圖2 不同繁殖階段垂體繁殖相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Relative expression level of reproductive related genes mRNA in different periods in pituitary

2.3 不同繁殖階段東北白鵝卵巢中繁殖相關(guān)基因表達(dá)情況

卵巢中繁殖相關(guān)基因在不同繁殖階段的表達(dá)水平如圖3所示，由圖3可知，LHR基因表達(dá)水平的變化差異不顯著（P>0.05）；FSHR基因在產(chǎn)蛋高峰期的表達(dá)水平極顯著高于產(chǎn)蛋后期（P<0.01），變化趨勢(shì)與Clock基因相似。

圖3 不同繁殖階段卵巢繁殖相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative expression level of reproductive related genes mRNA in different periods in ovary

2.4 不同繁殖階段東北白鵝血清中繁殖相關(guān)激素濃度變化情況

血清中繁殖相關(guān)激素在不同繁殖階段的濃度變化如圖4所示，由圖4可知，LH在繁殖期的血清濃度極顯著高于休產(chǎn)期（P<0.01），在產(chǎn)蛋高峰期極顯著高于產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋后期（P<0.01）；FSH在產(chǎn)蛋后期的血清濃度極顯著高于休產(chǎn)期和產(chǎn)蛋前期（P<0.01），在產(chǎn)蛋高峰期極顯著高于產(chǎn)蛋后期（P<0.01）；PRL血清濃度差異不顯著（P>0.05）。

圖4 不同繁殖階段血清LH，F(xiàn)SH和PRL的變化Fig.4 Serum levels of reproductive hormones in different periods

3 討論

籽鵝和東北白鵝是黑龍江省兩個(gè)主要的地方鵝種，目前對(duì)籽鵝繁殖性狀的研究較多，但對(duì)于體型相對(duì)較大的東北白鵝的研究較少。

Clock基因是動(dòng)物內(nèi)源性節(jié)律變化的核心元件，Agarwal等[23]的研究表明，光周期的改變會(huì)引起下丘腦中Clock基因表達(dá)水平的變化。試驗(yàn)中，東北白鵝下丘腦中Clock基因表達(dá)水平隨光周期的變化而變化，變化趨勢(shì)與產(chǎn)蛋曲線相同，在產(chǎn)蛋高峰期及之前逐漸上升，在產(chǎn)蛋后期下降。勞永聰?shù)萚24]關(guān)于馬崗鵝的研究表明，Clock基因在產(chǎn)蛋高峰期的下丘腦中高表達(dá)，與試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明該基因可能參與鵝繁殖節(jié)律的調(diào)控。但馬崗鵝在光照逐漸縮短的11月份產(chǎn)蛋，東北白鵝在光照逐漸增加的春季產(chǎn)蛋，這表明Clock基因的表達(dá)水平與光周期關(guān)系不大。Renthlei等[25]研究表明，在全暗的條件下，Clock基因的表達(dá)水平依然呈現(xiàn)出節(jié)律性變化，這表明Clock基因表達(dá)水平的節(jié)律性變化并不依賴(lài)于光周期。Guh等[26]認(rèn)為，不論長(zhǎng)光照還是短光照鳥(niǎo)類(lèi)，都對(duì)光照時(shí)長(zhǎng)的變化非常敏感，存在一個(gè)關(guān)鍵日照時(shí)長(zhǎng)和光可誘導(dǎo)相位，一旦光照時(shí)間和光可誘導(dǎo)相位重合，便可誘導(dǎo)繁殖過(guò)程，而Clock基因則參與產(chǎn)生光可誘導(dǎo)相位過(guò)程。因此可以認(rèn)為，Clock基因的表達(dá)具有內(nèi)源性特征，進(jìn)一步的研究表明Clock基因通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物代謝通路中基因的表達(dá)、激素的分泌調(diào)節(jié)動(dòng)物的代謝，進(jìn)而影響動(dòng)物的行為，包括采食、繁殖等[27]。

GnRH基因的表達(dá)與鳥(niǎo)類(lèi)內(nèi)源性生物節(jié)律有關(guān)。在本次試驗(yàn)中，下丘腦的GnRH基因在產(chǎn)蛋高峰期及之前，表達(dá)水平均高于產(chǎn)蛋后期。Moore等[28]指出鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)入春季繁殖季節(jié)時(shí)，下丘腦視前區(qū)GnRH的含量增加，GnRH活性增加會(huì)刺激垂體前葉釋放FSH和LH，促性腺激素會(huì)誘導(dǎo)性腺生長(zhǎng)并釋放作用于大腦以調(diào)節(jié)繁殖行為的性激素。Parhar等[29]指出GnRH是一種關(guān)鍵的下丘腦神經(jīng)肽，可刺激垂體釋放促性腺激素，促性腺激素可刺激性腺中性激素的分泌，性激素可調(diào)控脊椎動(dòng)物的社會(huì)行為，而社會(huì)行為是繁殖的關(guān)鍵組成部分。Zhang等[30]研究表明，卵巢顆粒細(xì)胞的增殖呈劑量依賴(lài)性受GnRH激動(dòng)劑和拮抗劑的影響，GnRH可能通過(guò)與細(xì)胞連接相關(guān)的自分泌或旁分泌途徑直接調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞增殖，GnRH可能通過(guò)改變參與卵巢顆粒細(xì)胞中cAMP積累、排卵周期和細(xì)胞連接的基因的表達(dá)，在卵泡發(fā)育中發(fā)揮作用。這些研究表明，GnRH基因在開(kāi)產(chǎn)前、產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋高峰期的高表達(dá)，是受到內(nèi)源性生物節(jié)律的調(diào)節(jié)，參與繁殖活動(dòng)的開(kāi)始與持續(xù)，一方面參與繁殖軸相關(guān)激素水平的調(diào)控，另一方面直接調(diào)控卵泡的發(fā)育；GnRH基因在產(chǎn)蛋后期的低表達(dá)，一方面可能是東北白鵝內(nèi)源性生物節(jié)律的調(diào)節(jié)，另一方面可能是發(fā)揮終止繁殖活動(dòng)作用的VIP基因和PRL基因表達(dá)升高的影響。

FSHR在繁殖期間，介導(dǎo)鵝卵巢對(duì)FSH的反應(yīng)。在本次試驗(yàn)中，卵巢中LHR基因表達(dá)水平的變化差異不顯著；FSHR基因在產(chǎn)蛋高峰期的表達(dá)水平高于產(chǎn)蛋后期。Zhu等[31]研究表明，低濃度的PRL可以促進(jìn)LHR基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)LH的功能，高濃度的PRL會(huì)抑制LH的分泌。這可能是LHR基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與PRL血清濃度的變化趨勢(shì)相反的原因。Cui等[32]研究表明，F(xiàn)SH可以誘導(dǎo)FSHR基因的表達(dá)。這可能是FSHR基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與FSH血清濃度的變化趨勢(shì)相同的原因。

在鳥(niǎo)類(lèi)中，光周期調(diào)控繁殖節(jié)律最終由垂體分泌促性腺激素和PRL實(shí)現(xiàn)。在試驗(yàn)中，垂體中LH基因在休產(chǎn)期的表達(dá)水平低于產(chǎn)蛋期；FSH基因的表達(dá)水平在產(chǎn)蛋高峰期及之前呈上升趨勢(shì)，在產(chǎn)蛋后期下降；下丘腦的VIP基因和垂體的PRL基因均是在產(chǎn)蛋末期時(shí)表達(dá)水平達(dá)到巔峰；FSH在產(chǎn)蛋后期的血清濃度極顯著高于休產(chǎn)期和產(chǎn)蛋前期，在產(chǎn)蛋高峰期極顯著高于產(chǎn)蛋后期；LH在繁殖期的血清濃度極顯著高于休產(chǎn)期，在產(chǎn)蛋高峰期極顯著高于產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋后期；PRL血清濃度差異不顯著。光照時(shí)間的增加首先刺激LH的分泌，進(jìn)而刺激性腺發(fā)育，鳥(niǎo)類(lèi)開(kāi)始繁殖，然后PRL開(kāi)始分泌，推動(dòng)光不應(yīng)期現(xiàn)象的發(fā)展，達(dá)到一定程度后，LH分泌減少，性腺開(kāi)始退化[33]。Yang等[34]發(fā)現(xiàn)，GnRH可促進(jìn)鵝LH、FSH的合成。Palermo等[35]研究表明，F(xiàn)SH通過(guò)調(diào)控卵巢小卵泡的發(fā)育促進(jìn)雌激素的分泌，LH調(diào)控大卵泡的發(fā)育和成熟。Bahr等[36]研究表明，F(xiàn)SH主要控制較不成熟（較?。┞雅莸某墒?，刺激較小排卵前卵泡的顆粒細(xì)胞分泌孕酮，LH主要用作促排卵。這些結(jié)果表明，F(xiàn)SH基因、LH基因表達(dá)水平和血清濃度受GnRH的調(diào)控，但GnRH基因表達(dá)的變化趨勢(shì)與FSH基因、LH基因表達(dá)水平和血清濃度的變化趨勢(shì)不盡相同，F(xiàn)SH基因和LH基因與CLOCK基因在產(chǎn)蛋高峰期的同樣高表達(dá)，表明FSH和LH的分泌可能受到內(nèi)源節(jié)律的調(diào)控。Dawson等[37]研究表明GnRH調(diào)控LH的產(chǎn)生和分泌，下丘腦分泌VIP時(shí)會(huì)促進(jìn)垂體分泌PRL。Rozenboim等[38]的研究表明，PRL通過(guò)作用于下丘腦和垂體前葉抑制其自身的分泌，通過(guò)降低下丘腦中GnRH的水平降低LH的水平。

4 結(jié)論

Clock基因、LH基因、FSH基因和FSHR基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與東北白鵝產(chǎn)蛋曲線的變化相似，從休產(chǎn)期、產(chǎn)蛋前期到產(chǎn)蛋高峰期，逐漸升高，在產(chǎn)蛋后期降低。東北白鵝下丘腦、垂體、卵巢中Clock基因和繁殖相關(guān)基因的表達(dá)水平與鵝的產(chǎn)蛋節(jié)律密切相關(guān)。血液中FSH和LH在產(chǎn)蛋高峰期的濃度明顯高于繁殖期的其他階段和休產(chǎn)期。