陳婷婷 程浩艷 李 震 金保勝 陳煒睿 黃 蕊 王文霞** 鄭俊霞**
(1)廣東工業(yè)大學生物醫(yī)藥學院,廣州 510006;2)河南科技大學材料科學與工程學院,洛陽 471000)
在醫(yī)學領域,利用納米技術構建靶向納米藥物遞送系統(tǒng)可改善傳統(tǒng)藥物溶解性和傳遞效率,延長藥物半衰期,提高其生物利用度及降低不良反應,有望解決臨床治療中出現的耐藥性問題[1]。近年來,基于納米顆粒的靶向藥物載體在生物醫(yī)藥領域越來越多地受到關注和青睞[2],如脂質體、蛋白質、線粒體、具有大平面尺寸和比表面積的過渡金屬硫族化合物和過渡金屬碳化物等二維材料。然而,新型納米藥物載體的有效性、安全性、藥代動力學等成藥性特征仍需深入和系統(tǒng)的研究。此外,納米載體藥物在未來大規(guī)模生產應用中仍存在一些“瓶頸”問題,如納米載體載藥量低、載體材料制備復雜、批次間可控性較差、生產成本高昂、具有潛在的系統(tǒng)毒性和免疫原性等,很大程度上限制了其臨床應用[3-4]。
Fig.1 Number of publications regarding the self-assembled carrier-free nanodrugs reported in recent 10 years(web of science,2022.04.07)圖1 近10年自組裝無載體納米藥物文獻報道數量(web of science,2022.04.07)
為了實現更高的療效,無載體納米藥物的概念被提出。這種策略是基于藥物分子的自組裝作用形成的納米結構,其載藥量高達100%[5]。相比于傳統(tǒng)納米藥物遞送系統(tǒng),自組裝無載體納米藥物遞送系統(tǒng)還具有如下獨特的優(yōu)勢:制備方法簡單靈活、藥物負載能力和傳遞效率高、血液循環(huán)半衰期長、避免載體帶來的相關毒性及免疫原等副作用[6]。近年來,無載體納米藥物廣泛應用于抗腫瘤、抗菌、抗炎和抗氧化等生物醫(yī)學領域[7],從近10年相關文獻報道數量(圖1)可以看出,無載體納米藥物越來越受到國內外學者的廣泛關注,并成為當前研究的熱點。因此,本文主要系統(tǒng)地綜述無載體納米藥物的自組裝機理、制備方法及其在抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化等方面的應用,重點指出目前無載體納米藥物在應用過程中存在的主要問題,并展望未來相關的主要研究方向,為無載體納米藥物在醫(yī)藥治療領域的開發(fā)與應用提供重要的借鑒。
自組裝是基本結構單元(分子、納米材料、微米物質等)自發(fā)形成有序結構的一種技術。目前,無載體納米藥物主要通過氫鍵、π-π 堆積、疏水作用、靜電作用和范德華力等非共價鍵的弱作用力自組裝形成。
氫鍵是無載體納米藥物自組裝很重要的一種非共價鍵驅動作用力。氫鍵主要存在于H原子和電負性的原子(如O、F 和N)之間,是一種比較弱的作用力,強度為10~40 kJ/mol[8-9]。Le 等[9]使用瞬時納米沉淀法通過紫杉醇(paclitaxel,PTX)、單寧酸(tannic acid,TA) 及聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)之間的氫鍵作用自組裝制備出平均粒徑為54 nm 的紫杉醇/單寧酸/聚乙烯基吡咯烷酮納米藥物(PTX-NP)(圖2),單寧酸可以抑制腫瘤細胞中P糖蛋白的表達,降低腫瘤細胞耐藥性。pH 響應型的PTX-NP 能夠在胃腸道靶向釋放,口服給藥后相對生物利用度為25.6%,在乳腺癌異種移植小鼠模型中具有顯著的腫瘤抑制效果。分子動力學模擬研究表明,PVP的羰基與TA 中的鄰苯三酚或兒茶酚部分形成氫鍵,PTX 的羥基或氧原子與TA 形成氫鍵。與PVP 相比,TA與PTX之間的氫鍵作用力更強,但是TA與PVP之間的氫鍵作用對形成穩(wěn)定的無載體納米藥物PTX-NP具有重要作用。
Fig.2 Self-assembly mechanism diagram of PTX-NP[9]圖2 PTX-NP的自組裝機理圖[9]
π-π 堆積是有機納米藥物自組裝的重要驅動力之一。π-π 堆積是指芳香環(huán)之間有吸引力的非共價相互作用,是一種與氫鍵同樣重要的非共價鍵相互作用,其強度在1~50 kJ/mol之間,可以促進含有π共軛基團的定向生長[10]。因此,芳香族化合物的芳香環(huán)可以通過邊對面(T 形)、偏移堆疊或者面對面相互堆積驅動自組裝形成納米藥物[11]。Zhu等[12]通過鐵死亡誘導劑erastin 和光敏劑二氫卟吩e6(chlorin,Ce6)之間的π-π堆積和氫鍵作用力自組裝成無載體納米藥物Ce6-erastin,Ce6-erastin 能被腫瘤細胞高效攝取。一方面鐵死亡過程中脂質過氧化物和活性氧(ROS)的過量蓄積破壞氧化還原穩(wěn)態(tài),另一方面鐵死亡過程中芬頓反應產生的分子氧可補充光動力治療(PDT)過程中氧氣的消耗,進一步提高PDT的療效,因此,Ce6-erastin介導的誘導鐵死亡聯合PDT可以有效抑制腫瘤細胞活性,具有顯著的抗腫瘤效果。研究表明,可以通過調控π-π 相互作用自組裝制備不同形狀的無載體納米藥物。Hu 等[13]將 親 水 聚 乙 二 醇(polyethylene glycol,PEG) 和還原性響應喜樹堿前藥單體(CPTM)通過可逆加成斷裂鏈轉移聚合反應制備出聚前藥兩性分子PEG-b-PCPTM,然后通過調控PEG-b-PCPTM 自組裝過程中有機溶劑的組成和加水速度,高效可控制備出具有4種不同結構的納米藥物(球形、花狀復合囊泡、光滑盤狀和錯列堆積片層結構)。研究表明,4 種結構納米藥物具有不同的降解速率、藥物釋放速率和腫瘤細胞毒性。此外,不同形貌自組裝納米藥物也表現出不同的生物效應。
疏水作用是疏水藥物自組裝形成納米粒子的主要驅動力。由于疏水分子不能與水分子充分相互作用,它們傾向于在水溶液中以最小化表面積的形式聚集,從而降低總能量,提高納米結構的穩(wěn)定性[14]。近年來,許多研究學者通過疏水作用將疏水性藥物和親水性藥物自組裝成無載體納米藥物。Cao 等[15]通過疏水作用將疏水的酚類抗氧化劑琥珀丁醇(succinobucol,SCB)與三嵌段聚合物泊洛沙姆P188 自組裝成球形納米顆粒,該納米粒子提高了SCB 的口服生物利用度,并顯著降低乳腺癌細胞VCAM-1 的表達,抑制乳腺癌細胞的肺轉移。Huang 等[16]通過疏水作用將親水性抗癌藥伊立替康(irinotecan,Ⅰr)和疏水性抗癌藥苯丁酸氮芥(chlorambucil,Cb)自組裝形成球形Ⅰr-Cb納米藥物,該自組裝無載體納米藥物在血液中的滯留時間更長,促進細胞對藥物的高效攝取,藥物進入細胞后親水性和疏水性單體藥物之間的酯鍵水解,釋放出游離的Ⅰr 和Cb,發(fā)揮優(yōu)異的抗癌活性。目前由疏水作用驅動形成的自組裝無載體納米藥物多為球形納米粒子,但也有少數為其他結構。Liang等[17]將兩個疏性水性的抗癌藥物喜樹堿分子(camptothecin,CPT)和兩個親水性的抗癌藥物氟尿苷分子(floxuridine,FUDR)通過可水解的酯鍵偶聯到季戊四醇骨架上,通過疏水作用自組裝合成一種具有高度對稱性的Janus結構喜樹堿-氟尿苷共軛化合物(JCFC NCs)。該JCFC 共軛化合物在極性溶劑中可自組裝形成具有類似脂質體雙層膜結構的納米膠囊。JCFC 納米膠囊的載藥量高達60%以上,穩(wěn)定性較高且可避免藥物分子的泄漏。與游離的FUDR 及CPT 相比,JCFC 納米膠囊可高效富集到達腫瘤部位,在酸性微環(huán)境和酯酶的作用下,釋放出摩爾比為1∶1的氟尿苷/喜樹堿具有顯著的協(xié)同抗腫瘤效果。
除了氫鍵、π-π 相互作用和疏水作用,靜電作用和范德華力也是驅動自組裝制備無載體納米藥物的非共價作用力。靜電作用發(fā)生在含有帶電基團的藥物之間,帶電基團之間的相互作用力與電荷量成正比,與基團電荷中心距離成反比[18-19]。對于帶電基團的藥物,通過改變藥物比例可以改變靜電作用活化能,從而獲得具有不同粒徑的無載體納米藥物。Xiao 等[19]通過阿霉素(doxorubicin,DOX)上的—NH2+和光敏劑脫鎂葉綠酸 A(pyropheophorbide a,PhA)上的—COO-之間的靜電作用自組裝制備了無載體納米粒子DOX-PhA NPs,用于光/化療聯合治療癌癥。通過調控DOX和PhA 的比例,可以制備得到不同粒徑的DOXPhA NPs。在弱相互作用力中,范德華力屬于短程作用力,它比化學鍵或共價鍵弱得多,能量在1~4 kJ/mol 之間[20]。雖然范德華力很少被視為控制自組裝的主要驅動力,但它可以用來調整納米粒子的大小、分子晶體構象和穩(wěn)定性[20]。
無載體納米藥物也可以由兩種或兩種以上的非共價作用自組裝而成。Zhang 等[21]通過吉非替尼(gefitinib,GEF)和三肽酪絲纈肽(tyroservatide,YSV)之間的氫鍵和π-π堆積作用自組裝制備無載體納米藥物GEF-YSV NPs,與GEF、YSV 和GEF/YSV 混合藥物相比,GEF-YSV NPs 的細胞內化作用增強,可顯著抑制癌細胞增殖。Zhou等[22]通過π-π堆積和氫鍵將喜樹堿-20(S)-甘氨酸(CPT-NH2)自組裝成納米纖維,該納米藥物可以有效穿透癌細胞的細胞膜,最大限度地提高療效。Wang 等[23]利用大黃素(rhein,Rhe)和DOX 分子之間的氫鍵、π-π 作用和疏水作用通過反溶劑沉淀法自組裝制備RHE/DOX NPs(RD NPs)。與單獨用藥相比,RD NPs 對4T1 細胞表現出較高的細胞毒性,通過調控NF-κB1和MMP-9的表達從而抑制腫瘤細胞的侵襲和生長。
綜上所述,無載體納米藥物主要通過氫鍵、π-π 堆積、疏水作用、靜電作用以及范德華力等非共價作用自組裝而成。分子間的非共價作用力取決于藥物分子的化學結構。一般來說,具有以下結構特征的分子可能會通過自組裝形成無載體納米藥物:a.大量的芳香結構(驅動π-π堆積相互作用);b.各種離子基團(驅動靜電作用);c.豐富的氧原子和氮原子(驅動氫鍵)[3]。
無載體納米藥物的自組裝方法包括體內自組裝法和體外自組裝法。與體外自組裝法相比,體內自組裝法制備的無載體納米藥物具有更高的載藥量,在血液中的循環(huán)時間更長,具有更優(yōu)異的細胞攝取率[7]。
無載體納米藥物的體外自組裝法包括自上而下法、反溶劑沉淀法和模板輔助沉淀法。
2.1.1 自上而下法
無載體納米藥物的自上而下制備方法主要包括高壓均質法和介質研磨法。高壓均質法是指在高壓條件下,利用沖擊力、剪切力和空腔作用來減小藥物的粒徑,制備粒徑分布較窄的納米藥物[7]。Fan等[24]通過高壓均質法制備了平均粒徑為(125.6±2.2)nm 的雷公藤紅素-牛血清白蛋白納米藥物(celastrol-BSA-NPs)。celastrol-BSA-NPs 的載藥量高達(13.88±0.12)%,釋放時間最長可達168 h。與游離的雷公藤紅素相比,celastrol-BSA-NPs在水溶液中的溶解度更高,細胞攝取率更高,通過腸道屏障的能力更強,在治療飲食誘導的肥胖癥方面表現出更好的生物利用度和體內療效。該方法具有操作簡單和可規(guī)?;a的優(yōu)點,但是存在設備成本高、均質循環(huán)次數多、均質化前藥物需經過高速攪拌和分散預處理等缺點[25]。介質研磨法是將藥物與研磨介質置于研磨室中,通過機器的運轉帶動藥物顆粒之間以及藥物顆粒與研磨介質、器壁間的撞擊,而達到納米級別[26]。如Tanaka等[27]通過在磨漿中加入適量的分散劑Pluronic F-68,將難溶性藥物阿苯達唑和達那唑分別研磨為納米顆粒。分散的納米顆粒通過凍干從漿液中提取出來,得到粒徑分別為185和102 nm的納米顆粒。介質研磨法雖然操作簡單、可大規(guī)模生產,但是磨床可能因為腐蝕而污染產品,延長制備周期。因此,研磨介質磨損和研磨表面可能對產品帶來的污染限制了其在高純度納米藥物制備領域的應用。研究表明,通過與其他方法結合,可以解決介質研磨法存在的缺點。Patel等[28]通過超聲波輔助介質研磨法制備得到小粒徑低污染的非諾貝特納米藥物,提高了藥物懸浮液的穩(wěn)定性。
2.1.2 反溶劑沉淀法
反溶劑沉淀法通常是將疏水性藥物或者兩親化合物溶解在合適的有機溶劑中,然后與大量反溶劑(如去離子水)混合,使溶液過飽和,進而析出藥物并通過非共價作用力自組裝為無載體納米藥物(圖3)。反溶劑沉淀法具有操作簡單、環(huán)境友好、成本低廉等優(yōu)點。通過改變反溶劑沉淀法關鍵實驗參數可以調控無載體納米藥物的形貌和尺寸,使無載體納米藥物在血液中的循環(huán)時間更長,具有更優(yōu)異的細胞攝取率[7]。如Chen 等[29]以10-羥基喜樹堿(10-hydroxycamptothecin,HCPT)乙醇溶液和DOX水溶液為主要實驗藥物原料,通過調控DOX/HCPT 摩爾濃度和HCPT 乙醇溶液的注射速率,可以制備形貌和粒徑可控的無載體納米藥物HCPT/DOX,當DOX/HCPT 摩爾濃度為4∶1 時,得到形貌均一、粒徑為231.6 nm的球形無載體納米藥物。
Fig.3 Schematic illustration for the synthesis of carrier-free nanodrugs by reverse solvent precipitation[6]圖3 反溶劑沉淀法制備無載體納米藥物的示意圖[6]
雖然反溶劑沉淀法操作簡便、成本低廉,不需要昂貴的實驗設備,但是,在反溶劑沉淀法自組裝過程中,無載體納米藥物的形貌和尺寸非常容易受到藥物濃度、溶劑類型和攪拌速率等關鍵實驗因素的影響[6]。因此,此方法制備無載體納米藥物仍然面臨很多“瓶頸”,如制備的無載體納米藥物產率較低、 重復性較差且粒徑較大(100~500 nm)等[30-31]。
2.1.3 模板輔助沉淀法
模板輔助沉淀法在反溶劑沉淀法的基礎上,通過使用模板來實現對無載體納米藥物顆粒尺寸的控制,可以解決反溶劑沉淀法所面臨的瓶頸問題。模板輔助沉淀法可分為陽極氧化鋁(AAO)模板輔助法[32]和冰模板輔助法[33],此方法首先將預處理的模板在藥物溶液中浸泡,使藥物溶液通過毛細管力擴散到模板的孔或縫隙,然后使溶劑揮發(fā),藥物前體進行自組裝,最后去除模板得到無載體納米藥物。通過模板輔助法制備的無載體納米藥物的粒徑受到藥物濃度和模板孔徑的影響,當實驗藥物的濃度較高時,模板中藥物的濃度也較高,因此自組裝制備的無載體納米藥物的粒徑就越大[7]。然而,當實驗藥物濃度升高到一定的閾值時,無載體納米藥物的粒徑主要受模板孔徑大小的影響。如Zhang等[32]通過調控AAO 模板尺寸制備出粒徑分布為10~100 nm 的無載體納米藥物替尼泊苷VM-26 PND,首次合成了粒徑小于20 nm的無載體納米藥物(圖4),突破了反溶劑沉淀法無法制備粒徑較小的無載體納米藥物的瓶頸。此外,該方法也應用于多種實驗藥物自組裝制備無載體納米藥物,如紫杉醇(paclitaxel,PTX)、他莫昔芬(tamoxifen,TMF)、卡莫司?。╟armustine,BCNU)、甲氨蝶呤 (methotrexate, MTX) 和 6- 巰 基 嘌 呤(6-mercaptopurine,6-MP)等[32]。
Fig.4 Schematic diagram of preparation of carrier-free nanodrugs by AAO template assisted precipitation method[32]圖4 利用AAO模板輔助沉淀法制備無載體納米藥物的步驟示意圖[32]
但是,AAO模板輔助法使用的AAO模板價格昂貴、前處理程序冗雜、殘存的微量模板可能污染藥物,且去除AAO 模板使用的強酸或強堿可能會破壞納米藥物的結構。近年來,研究表明使用冰模板輔助法制備無載體納米藥物具有獨特的優(yōu)勢,如Zhang 等[33]開發(fā)一種低成本、環(huán)境友好的冰模板輔助法制備具有高純度和生物相容性的無載體納米藥物姜黃素(Cur PDNs),將溶解在四氫呋喃中的姜黃素滴在冰模板上,有機溶劑揮發(fā)后,姜黃素滲透到冰晶體中,冰模板在-20℃反應24 h使實驗藥物自組裝為純姜黃素納米藥物。最后,通過融化、冷凍干燥或超聲分散在去離子水中等方法提取純姜黃素納米藥物。通過調控冰模板晶界形狀和通道尺寸可以制備得到不同形貌和粒徑的無載體納米藥物。與AAO 模板輔助法相比,冰模板輔助法成本低廉、操作簡便、模板易得且制備的無載體納米藥物產率較高。
體內自組裝是指通過靜脈注射的外源性小分子響應于特定位點發(fā)生自組裝,原位形成具有特定診斷和治療功能的高度有序納米藥物,其廣泛應用于腫瘤的診斷和治療等領域[34-35]。不同于納米材料的被動靶向,體內自組裝納米藥物具有獨特的靶向方式,即小分子藥物的自組裝對病理位點具有選擇性,可避免非靶向藥物遞送帶來潛在副作用的風險。
根據刺激來源的不同,用于體內自組裝的刺激可分為內源性刺激和外源性刺激。內源性刺激包括多種過表達的酶、pH值和氧化還原環(huán)境等[36]。與正常器官不同,腫瘤部位過表達的酶、酸性環(huán)境和氧化還原條件等可作為觸發(fā)因素引發(fā)小分子藥物自組裝。在這些生理信號的刺激下,藥物前體被切割或共軛以改變其化學結構和組裝性質,從而使所得的分子進一步自組裝成所需的納米藥物[37]。如圖5所示,Cong 等[34]利用腫瘤微環(huán)境pH 來調控體內自組裝行為,將由pH 敏感單元順烏頭酸酐(CAA)修飾的治療肽和細胞穿膜肽通過硫醇-烯點擊反應與主鏈β-硫代酸酯偶聯,開發(fā)出了一種pH響應型多肽聚合物,CAA 可以使多肽聚合物在中性水溶液中水解為穩(wěn)定的單鏈狀態(tài)。多肽聚合物單鏈尺寸較小,可以滲透到腫瘤深處;而當多肽聚合物到達腫瘤中的弱酸微環(huán)境中時,CAA 將響應脫除并引起多肽聚合物自組裝為納米顆粒。此納米顆??梢酝ㄟ^內吞作用進入腫瘤細胞,同時CAA 的完全水解也使治療肽的治療活性恢復,從而有效殺死癌細胞。Wu 等[38]設計一種堿性磷酸酶(ALP)可激活的近紅外探針ⅠR775-Phe Phe-Tyr(H2PO3)-OH(1P)。研究表明,1P在腫瘤微環(huán)境中堿性磷酸酶的作用下去磷酸化,生成疏水性的產物ⅠR775-Phe-Phe-Tyr-OH(1),其被腫瘤細胞攝取后自組裝成納米顆粒(1-NPs)。1-NPs 使光聲成像信號增大6.4倍,可用于精準診斷探針相對應的癌癥。
Fig.5 Schematic illustration for the self-assembly and permeation of PT-K-CAA in tumor microenvironment[34]圖5 PT-K-CAA在腫瘤微環(huán)境中的自組裝及滲透過程示意圖[34]
外源性刺激一般指外部物理刺激,如溫度和化學反應等。Liu 等[39]合成了由多聚(β-硫酯)、功能肽和近紅外分子組成的聚合物偶聯物(polymerpeptide conjugates,PPCs)。PPCs尺寸較小(<10 nm),易在腫瘤部位發(fā)生滲透,從而能夠“深入腫瘤內部”。在近紅外激光照射下,近紅外分子引起的高溫使熱響應性PPCs 在腫瘤內自組裝為球形納米顆粒。其在腫瘤內積聚并有效進入細胞,通過破壞線粒體膜誘導細胞凋亡。不同類型的外源性刺激可以協(xié)同靶向癌細胞。Yao 等[40]利用酶觸發(fā)的超分子自組裝和四嗪(tetrazine,Tz) 與反式環(huán)辛烯(trans-cyclooctene,TCO)之間的生物正交斷鍵反應合成了帶有前藥激活開關Tz 的酶響應組裝前體短肽,與Tz 偶聯的分子在宮頸癌細胞內過表達的磷酸酶作用下去磷酸化并原位自組裝為納米組裝體,使前藥激活開關Tz 獲得腫瘤靶向性并且大量富集。阿霉素前藥TCO-DOX在腫瘤內能被高效激活,注射4 h后,腫瘤內活化的DOX濃度比正常細胞或組織高10倍,顯著提高了癌細胞的殺傷效果。
綜上所述,介質研磨法和高壓均質法可用于工業(yè)化生產納米藥物,但過程耗時、易污染產品;反溶劑沉淀法和模板輔助沉淀法是自組裝制備納米藥物常用的方法,具有綠色環(huán)保、工藝簡單、成本較低等優(yōu)點,但是目前僅限于實驗室或者理論研究;而體內自組裝法制備的納米藥物具有靶向性,可在目標位置進行自組裝,從而達到更高的療效。
根據世界衛(wèi)生組織公布的數據,目前癌癥已成為全球第二大死因,每年有近960 萬人死于癌癥[41]?;瘜W藥物治療(化療)是臨床控制腫瘤惡化的主要手段之一。然而,化療中使用的藥物存在生物相容性差、副作用大、耐藥等缺點,極大地限制了其臨床療效[42]。目前研究表明,將化療藥物以非共價鍵封裝到納米載體(如納米微球、脂質體以及各種類型的聚合物膠束)中可以改善難溶藥物的溶解性,滿足不同給藥途徑,但是,這些納米系統(tǒng)的載藥能力低,藥物釋放緩慢,進一步限制了其治療效果[43]。
因此,開發(fā)一種不使用載體的高負載藥物給藥系統(tǒng)是非常有意義的。自組裝無載體納米藥物是指由一種或幾種活性藥物自驅動形成的納米級自投遞藥物[44]。由于其具有載藥量高和無載體等優(yōu)點,已被研究者開發(fā)用于治療腫瘤。如Fan 等[45]利用熊果酸(ursolic acid,UA)分子間的靜電和疏水作用通過反溶劑沉淀法自組裝合成單一純納米藥物(UA NPs),通過下調STAT 3的表達,影響腫瘤細胞的轉錄過程,誘導TNF-α 的表達來殺傷癌細胞。與游離UA 相比,UA NPs 顯著改善了治療動物外周血中CD4+ T 細胞的數量,并增強了CD4+/CD8+T細胞的浸潤。除熊果酸外,阿霉素[46]、喜樹堿[47]和紫杉醇[48]等抗癌藥物也被發(fā)現具有自組裝能力,其自組裝形成的納米藥物與游離的純藥物相比,制備簡單、載藥量超高,且可顯著提高抗癌效果。
由于腫瘤的異質性[49],單藥通常不足以控制腫瘤,因此,多種化療藥物聯合治療被認為是一種更有前景的癌癥治療方式[50]。Xiao等[42]利用雷公藤紅素(celastrol,CST)和DOX 分子間的靜電作用和π-π堆積,通過反溶劑沉淀法將其自組裝形成雷公藤紅素/阿霉素納米藥物(CST/DOX NPs)(圖6a)。通過使用PBS 緩沖溶液(pH=7.4 和5.0)模擬血管中的血流條件和腫瘤酸性微環(huán)境,對其進行體外藥物釋放研究,在pH7.4 PBS中經過48 h后僅釋放出48.9%的DOX,但在pH5.0 PBS中48 h后釋放出83.2%的DOX,表明CST/DOX NPs 的體外釋放具有明顯的pH 響應性。激光共聚焦顯微鏡分析表明CST/DOX NPs 通過被MCF-7 和MCF-7/ADR細胞內化而轉化為游離藥物CST 和DOX,從而發(fā)揮抗癌作用。與單藥和CST/DOX 復合物相比,在CST/DOX NPs 處理下多細胞球形腫瘤(MCs)的平均直徑從100%降低到11.8%,具有顯著的抗癌效果(圖6b)。此外,腫瘤微環(huán)境具有不同于其他組織的特點,如微酸性(pH=5.6)、谷胱甘肽(GSH)過度表達、乏氧程度嚴重以及過氧化氫水平高等[51]。因此,不少研究者通過脂鍵或二硫鍵將兩種化療藥物結合形成兩親性前藥,隨后自組裝形成納米藥物,可以在腫瘤細胞內部響應性轉化為具有生物活性的原藥,從而達到抗腫瘤的效果并降低藥物的全身毒副作用的目的。如Hou等[52]將親水性藥物吉西他濱(gemcitabine,Gem)和疏水性藥物CPT 通過二硫鍵鏈接后得到兩親性Gem-CPT前藥,通過反溶劑沉淀法在水溶液中自組裝形成Gem-CPT NAs。在腫瘤還原性的微環(huán)境下,Gem-CPT NAs 二硫鍵被裂解,釋放出Gem 和CPT分子,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Huang 等[53]通過酯化反應將疏水性藥物Cb分別與親水性藥物Gem和Ⅰr 鏈接起來,得到兩親性的綴合物Gem-Cb 和Ⅰr-Cb,由于具有兩親性特征,Gem-Cb 和Ⅰr-Cb 綴合物能在水中組裝形成納米粒子。此外,可以使用反溶劑沉淀法將具有不同摩爾比例的兩種綴合物Gem-Cb和Ⅰr-Cb自組裝制備成具有優(yōu)異抗癌效果的三元納米復合藥物(圖6c)。該三元納米復合藥物到達腫瘤細胞后酯鍵被水解,釋放出3種具有不同抗癌機制和非毒性重疊的藥物,從而發(fā)揮藥物的協(xié)同治療作用以提高療效。體外細胞毒性研究表明,三元納米復合藥物N4對人肺癌細胞A549具有較高的細胞毒性(圖6d,e)。
此外,通過引入靶向配體也可以提高無載體納米藥物對癌細胞的靶向性和降低全身毒性。常用的癌癥治療靶向配體有CD44、葉酸受體或整合素受體等。例如,Jiang 等[54]通過π-π 堆積、疏水和靜電作用將熊果酸和DOX自組裝形成UD NPs,并在表面修飾HER2適配體,提高了對乳腺癌細胞的靶向能力,從而達到更好的抗癌作用。
細菌感染嚴重威脅著人類的健康,導致各種疾病甚至死亡[55]。抗生素是治療臨床細菌感染相關疾病的主要藥物,然而,抗生素的大量使用使得耐藥菌發(fā)生率急劇增加,給臨床細菌感染相關疾病的治療帶來極大挑戰(zhàn)。相關研究表明,利用納米技術開發(fā)載藥系統(tǒng),可以減少抗生素的劑量和使用頻率[56-58]。納米藥物載體具有體積小、比表面積大、基質可控釋放、靶向給藥等優(yōu)點,但是,載藥系統(tǒng)使用的無機輔助劑如二氧化硅、金屬骨架等不能被人體代謝消除[59-60]。因此,合成簡單、無載體、生物相容性好的自組裝納米藥物在臨床細菌感染治療中具有重要意義。
Fig.6 Self-assembled carrier-free nanodrugs for cancer therapy[42,53]圖6 自組裝無載體納米藥物用于癌癥治療[42,53]
雷海明等[61-63]基于中藥處方的啟示,研究發(fā)現小檗堿上的季銨離子和苯環(huán)可與其他藥物通過非共價自組裝成納米粒子,發(fā)揮抗菌作用。比如,該課題組基于中藥活性成分小檗堿(berberine,Ber)和Rhe 之間的π-π 相互作用和靜電作用利用反溶劑沉淀法自組裝制備Ber-Rhe NPs(圖7a)。由于兩種活性成分Ber和Rhe的協(xié)同抑菌作用,Ber-Rhe NPs的抗菌活性顯著增強(圖7b)[61]。該課題組也通過構建小檗堿和肉桂酸自組裝納米給藥系統(tǒng)以提高對金黃色葡萄球菌的抑菌活性[62]。在自組裝過程中,肉桂酸的羰基可與小檗堿的氮原子形成氫鍵,同時兩個分子的芳香環(huán)形成π-π堆積結構。該自組裝納米粒子能自發(fā)地吸附于細菌表面,滲入細胞,攻擊多耐藥的金黃色葡萄球菌,從而達到較強的抑菌效果。Song 等[64]對小檗堿進行烷基化修飾后合成4種衍生物,在抗幽門螺旋桿菌上表現出比小檗堿更強的抗菌活性。隨著小檗堿上修飾的烷基鏈長度的增加,小檗堿衍生物對幽門螺旋桿菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值逐漸降低。并且,該團隊將這4種烷基化小檗堿衍生 物(berberine derivatives,BDs) 和 鼠 李 糖 脂(rhamnolipid,RHL)通過靜電和疏水作用自組裝制備出BD/RHL NDs(圖7c)[65]。與BDs相比,自組裝的納米粒子對幽門螺旋桿菌的抑制效果增加了2~8 倍。其中,C10-BD 的MIC為1.56 mg/L,而C10-BD/RHL NDs 的MIC為0.78 mg/L。此 外,C10-BD/RHL NDs可以顯著抑制并破壞幽門螺旋桿菌的生物膜,降低生物膜生物量(圖7d)并殺死分散在生物膜中的大部分幽門螺桿菌,減弱殘留細菌對生物表面的再黏附作用,從而防止生物膜的重組。因此,自組裝制備的BD/RHL NDs具備小檗堿衍生物的抗菌活性和鼠李糖脂清除生物膜的作用,在對抗生物膜及抗菌方面有巨大潛力,并為治療幽門螺桿菌引起的相關慢性胃病提供了一種有前景的方法。
Fig.7 Self-assembled carrier-free nanomaterials for antibacterial[61,65]圖7 自組裝無載體納米藥物用于抗菌[61,65]
3.3.1 抗炎作用
動脈粥樣硬化是動脈中的一種慢性炎癥,減少斑塊炎癥對減少動脈粥樣硬化血栓的發(fā)生具有重要意義[66]。Nasr 等[67]首先將透明質酸(hyaluronic acid,HA)與阿托伐他?。╝torvastatin,ATV)結合得到兩親性聚合物HA-ATV,然后通過反溶劑沉淀法在水溶液中自組裝形成以ATV 為疏水核心的納米藥物(HA-ATV NPs)。與游離ATV 相比,HA-ATV NPs 可以通過HA 和CD44 的相互作用靶向炎癥性動脈粥樣硬化斑塊,從而減輕炎癥反應。此外,抗炎藥物偶聯聚合物可自組裝形成納米藥物,改善水溶性,提高其在炎癥治療中的效果,如迷迭香酸[68]和吲哚美辛(indomethacin,ⅠND)[69]。其中,ⅠND 是一種具有很好療效的抗炎藥物,但其水不溶性和極低的生物利用度嚴重限制了其臨床轉化[70]。為了改善ⅠND的水不溶性,Lin等[69]將PEG通過酰胺鍵共價連接到兩個ⅠND藥物分子上,并在水溶液中自組裝形成納米前藥(ⅠND-PEG-ⅠND NPs),此自組裝無載體納米藥物可以實現炎癥環(huán)境中代謝活躍過表達的組織蛋白酶B的釋放[71],可特異性水解酰胺鍵。此外,與游離ⅠND 相比,ⅠND-PEG-ⅠND NPs 顯著降低了對正常成骨細胞的毒性,并對巨噬細胞表現出更強的抗炎作用。
3.3.2 抗氧化作用
ROS 是生物體中正常細胞的代謝物,正常水平的ROS 對于維持細胞信號傳導和其他細胞內功能至關重要。然而,過度的ROS 會破壞氧化還原狀態(tài)并引起氧化應激。氧化應激會對細胞造成嚴重損害,導致一系列嚴重疾病,例如眼疾、中風、敗血癥、阿爾茨海默病和帕金森病等[72-73]。目前被廣泛用于去除生物體中過量ROS 的抗氧化劑在生理條件下具有穩(wěn)定性低、非特異性和短壽命的缺點[74]。因此,開發(fā)新型無載體納米藥物以有效消除細胞中過表達的ROS 并防止細胞氧化應激損傷具有重要意義。Zhu等[75]使用9-芴基甲氧羰基-色氨酸(Fmoc-Trp)、槲皮素(quercetin,Que)和Fe2+作為構建模塊,通過配位和靜電相互作用自組裝形成Fmoc-Trp-Fe2+-Que(FTFQ)NPs。FTFQ NPs很大程度提高了Que 的生物利用度,并通過直接/間接方式降低Aβ 的聚集能力,減小Aβ 寡聚體/纖維誘導的神經毒性,用于阿爾茨海默病的協(xié)同治療。Zheng 等[76]在熱處理輔助下通過靜電作用驅動帶負電荷的透明質酸和帶正電荷的米托醌(MitoQ)自組裝制備新型線粒體特異性抗氧化納米藥物(MitoO NPs)。MitoQ NPs在線粒體中亞細胞的分布比游離MitoQ高2~3倍,可以顯著提高線粒體ROS 清除率,減少眼部ROS 的積累,從而緩解干眼病癥狀。
自組裝無載體納米藥物是近幾年開發(fā)的一種新型藥物,在生物醫(yī)學領域不斷展示其潛在的應用價值,得到了國內外研究學者的廣泛關注。本文主要從無載體納米藥物自組裝機理、制備方法及其在抗腫瘤、抗菌、抗氧化等方面的應用系統(tǒng)闡述了自組裝無載體納米藥物的研究進展。目前,自組裝無載體納米藥物的制備方法主要包括自上而下、反溶劑沉淀法、模板輔助沉淀法和體內自組裝法。近年來,科研工作者將其開發(fā)應用于抗腫瘤、抗菌、抗炎及抗氧化等生物醫(yī)學領域。雖然自組裝無載體納米藥物可以降低毒性,表現出良好的治療效果,但將其應用于臨床治療還需要進一步地深入研究和開發(fā)利用,未來自組裝無載體納米藥物在生物醫(yī)學領域的重點研究可以圍繞以下方面展開:
a.進一步研究和闡明無載體納米藥物自組裝機制。目前大多數研究者通常通過經驗篩選藥物配方[77],通過分析藥物分子的結構,推測能否形成弱相互作用力進行自組裝。目前已報道的自組裝納米藥物數量非常有限,未來仍需要進一步探索藥物自組裝機制并擴展自組裝藥物分子庫??梢酝ㄟ^建立數據庫、計算機輔助分子結構模擬和單晶衍射等方法詳細研究和了解藥物分子的空間幾何結構以及藥物分子之間可能存在的弱相互作用,并且借助計算機建模來預測藥物分子的自組裝行為[78-79],從而更好地理解分子自組裝機制,篩選出更多藥物自組裝配方,這對于新型無載體納米藥物的設計與開發(fā)具有非常重要的指導意義。
b.深入研究無載體納米藥物輔料的毒性和在體內的代謝途徑,系統(tǒng)探討輔料對自組裝無載體納米藥物發(fā)揮藥效的動力學影響機制。在無載體納米藥物的制備過程中,一般會使用輔料如PEG、蛋白質、細胞膜和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA)等增加納米藥物的穩(wěn)定性[36],目前,輔料對納米藥物的緩釋和治療效果影響的相關研究仍然非常缺乏。
c.防止無載體納米藥物早期滲漏,提高其穩(wěn)定性。無載體納米藥物通常通過弱相互作用力自組裝而成,其納米結構容易受到體內復雜環(huán)境的影響,導致藥物在到達靶點之前發(fā)生滲漏,具有不穩(wěn)定性[7]。目前已經有部分研究學者試圖通過加入少量的聚乙二醇、蛋白質和細胞膜等[80]來提高其穩(wěn)定性和治療效果。此外,研究表明,可以通過對藥物分子進行修飾,引入在靶點能刺激響應性斷裂的鏈接,從而實現選擇性藥物釋放,但同時也可能帶來工業(yè)生產處理和穩(wěn)定性問題。因此,自組裝無載體納米藥物的穩(wěn)定性可能會嚴重限制其在臨床應用的實際應用,應該積極探索與其他改性方法相結合,尋求更優(yōu)的方法提高其穩(wěn)定性,防止無載體納米藥物早期滲漏,從而開發(fā)出能夠應用于臨床治療的高效穩(wěn)定無載體納米藥物,這是未來非常重要的研究方向之一。
d.精準控制無載體納米藥物在應用中的粒徑大小和藥物緩釋比例,以期實現更好的治療效果。無載體納米藥物粒徑大小決定其生物分布、腫瘤滲透、細胞內化、血漿和組織間隙清除,以及體內排泄,所有這些對癌癥的整體治療效果都有著舉足輕重的影響力。粒徑較小的藥物有利于滲透到腫瘤深處,發(fā)揮更強的腫瘤抑制能力,但其在腫瘤組織處的保留時間又隨著粒徑增大而增加[7]。因此,非常有必要拓展新的合成方法制備在生物組織不同環(huán)境內粒徑可調的無載體納米藥物,從而實現更好的治療效果。此外,無載體納米藥物可能有多成分單體藥物組成,深入研究并精準控制不同藥物的緩釋比例,可以為其臨床治療發(fā)揮更好作用提供科學指導。
e.實現大規(guī)模工業(yè)化生產。在工業(yè)化的大規(guī)模生產中,由于藥物濃度較高,難以保證納米顆粒的理化性質與實驗室制備一致。研究表明,冷凍干燥是保證無載體納米藥物貯存穩(wěn)定性的良好選擇[81],但冷凍干燥配方中顆粒的再分散性和膠體穩(wěn)定性仍然是一個難題。因此,在未來的研究中,無載體納米藥物的制備技術應滿足工業(yè)化生產的要求,其重現性、濃縮性、無菌性、凍干性和存儲性等技術細節(jié)需要高度重視。